色谱分析(中国药科大学)第2章色谱法的基本参数及理论

第二章 色谱法的基本参数及理论一、色谱分离与保留作用色谱的保留作用：在色谱系统中，当样品混合物被流动相带入柱内后，便在固定相与流动相之间不断地进行分配平衡。

不同的化合物由于他们之间理化性质的差异，在两相中存在量的比值也各不相同。

固定相中存在量多的化合物，冲出柱子所需消耗流动相的量就多，较慢地被从色谱柱中被洗脱出来。

流动相中存在的比例大的化合物，冲洗出柱子所需消耗流动相的量就少，较快地被从色谱柱中被洗脱出来。

这种现象就称为色谱的保留作用。

图 2-1 色谱分离示意图样品组分在两相间分配平衡时，其在两相中存在量的比值称为容量因子(capacity factor) k ’，又称分配比（partion ratio ）或分配容量。

k ’ = MS M M 式中，Ms ：组分在固定相中的量，M M ：组分在流动相中的量。

在固定相中的量为零的化合物，其k ’=0，这些组分被称为在该色谱条件下的非保留物质。

容量因子（分配比）可通过实验计算：k ’ =MR t t ' 。

即k ’为组分在固定相中消耗的时间与其在流动相中消耗的时间之比。

样品组分在两相中分配平衡时，其在固定相和流动相中的浓度比称为分配系数（partion factor ），分配系数以K 表示。

其公式如下：Ms c c K ==组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度 K =m m S S V M V M // = k ’· S m V V 式中，Ms/Vs 为样品组分在固定相中的浓度，M m /V m 为样品组分在流动相中的浓度。

分配系数大的组分保留时间长（色谱的保留作用强），分配系数小的组分保留时间短（色谱的保留作用弱）。

K = k ’· Sm V V = k ’· β 式中β = Sm V V 称为相比率，即色谱柱中流动相体积与固定相体积之比。

例在毛细管GC 中壁涂空心柱的相比为：β = 固定相体积（柱中）流动相体积（柱中） = dfrl l r ⋅ππ22 = df r 2式中r为毛细管柱横截面的半径，d f为柱内壁固定液的膜厚。

二、保留值1.保留时间与保留体积保留时间（t R）：从进样到柱后出现浓度最大值所需的时间。

保留体积（V R）：从进样到柱后出现浓度最大值所需消耗流动相的体积。

V R = t R·Fc (Fc为流动相的流速)实验中Fc值的求法：①HPLC直接从仪器读取②GC采用皂膜流量计在柱后测得柱后载气肥皂液120302. 死时间（t M ）和死体积（V M ）t M ：不保留物质从进样开始到柱后出现浓度最大值所需时间。

V M ：不保留物质从进样开始到柱后出现浓度最大值所需消耗流动相的体积。

在以甲醇-水系统为流动相的反相HPLC 中，甲醇峰的保留时间可近似看作死时间。

在GC 中，空气峰（GC-ECD 中）的保留时间和甲烷峰（GC-FID 中）的保留时间可近似看作死时间。

（1） GC 中t M 的准确求算方法：t M = )()()(2)()()(2n R i n R i n R n R i n R i n R t t t t t t -+-⋅-+-+式中t R （n+i ）、t R （n ）、t R （n-i ）为同系物（如正构烷烃）中间隔碳原子数相等的组分的保留时间。

C n – C n-i = C n+i – C n（2） HPLC 中t M 的测法：将流动相中溶剂峰峰的保留时间可近似看作死时间。

3. 调整保留时间（t R ’）和调整保留体积（V R ’）t R ’为扣除死时间的保留值t R ’ = t R - t MV R ’ = V R – V Mk’ = t R ’/ t M4. 相对保留值（relative retention volume ）相对保留值γ1,2为被测组分的调整保留时间t R ’1与标准物的调整保留时间t R ’2之比。

其公式如下：γ1,2 = ''21R R t t = ''21R R V V = ''21R R k k = 21K K （k’ = t R ’/ t M ）式中脚注号1表示被测物，2表示标准物。

采用相对保留值，是为了消除某些操作条件，如流速和固定液流失等对保留值的影响。

相对保留值中标准物可以是被测样品中的某一组分，也可以是人为地加入的某一化合物。

γ1,2仅为柱温、固定液性质的函数，而与其他实验条件无关。

γ1,2作为定性指标的缺点是标准物不统一，其数值随标准物的不同而不同。

5. 保留指数（用于GC ）保留指数（retention index ）又称为柯瓦指数（Kovats index ），是使用最广泛并被国际上公认的定性指标，它具有重现性好（精度可达±0.1指数单位），标准物统一及温度系数小等优点。

鉴于相对保留值存在标准物不统一，测量精度不够高等问题。

Kovats 提出了统一用正构烷烃系列作为标准物。

把保留指数定义为： I x = 100 'lg 'lg 'lg 'lg )1(RN N R RN Rx t t t t --+ + 100N 式中：I x 为被测物的保留指数t R ’x 为被测物的调整保留时间N 为正构烷烃的碳原子数，如正己烷的N = 6t R ’N 及t R ’（N+1）分别为具有N 个碳原子及（N+1）个碳原子的正构烷烃的调整保留时间。

（1）保留指数的定义及公式来源保留指数：I （国际公认，用于GC 中鉴定，定性），相对值，用一系列正构烷烃为基准物。

令正构烷烃的保留指数为I = 100N （N 为正构烷烃的碳数）。

被测物的保留指数Ix 可用内插法算出。

内插法的理论基础为：正构烷烃调整保留时间的对数（lg t R ’）与其相应的碳数成线性关系。

l g t R ’ = a N + b (1)设待测物x ，其调整保留时间为t R ’x ，两正构烷烃n – C N 及n – C N+n 的碳数分别为N 和N+n ，其调整保留时间分别为t R ’N 及t R ’（N+n ） 。

t RN ＜ t Rx ＜t R （N+n ）设待测物x 相当于正构烷的碳数为n x根据(1)式，则： lg t R ’(N+n) = a (N+n) + b (2)lg t R ’x = a n x + b (3)lg t R ’N = a N +b (4)(2) - (4) lg t R ’(N+n) - lg t R ’N = a·n (5)(3) - (4) lg t R ’x - lg t R ’N = a (n x – N) (6)(6)/(5) ' t lg ' t lg 't lg 't lg N R n)N (R N R x R --+ = nN n x - n x = N + n·'t lg ' t lg ' t lg 't lg N R n)N (R N R x R --+ 故待测物x 的保留指数如下：Ix = 100 n x = 100 N + 100 n·'t lg ' t lg 't lg 't lg N R n)N (R N R x R --+ 当相邻两个正构烷烃的碳数差值n = 1时，则 Ix = 100 N + 100·' t lg ' t lg ' t lg 't lg N R 1)N (R N R x R --+ （2）保留指数的特点① 保留指数仅与固定相的性质及柱温有关，与其他实验条件无关，因此定性准确度比t R 等保留值准确。

习惯上将测定时的柱温写在I 符号的下角，所用固定相写在I 符号的上角。

例如I 30150SE ，即采用SE-30为固定相，柱温在150℃进行测试所得的保留指数。

② 同系物的保留指数与碳数呈线性关系。

同系物中，相同的取代基有相同的保留指数增量。

例：正构烷及正构醇的Ix – Nc 曲线如下：b 醇 ＞ b 烷 = 0，即相同碳数的正构醇总是比相同碳数的正构烷的Ix 高，且高出的值为一定值，即b 醇。

b 醇为醇羟基（-OH ）对保留指数做出的贡献。

也即-OH 使得醇类的色谱保留大于烷类（相同碳数时）。

三、保留值与容量因子及分配系数的关系1. 保留值与容量因子k’M R M R V /'V t /'t 'k ==→ t R = t M （1 + k’）M R R t t 't -=由此可见容量因子k’大的组分其保留时间长。

例：在某色谱系统中，系统的死时间为0.5，某样品组分在该系统中的容量因子为5，问该组分进样后需多长时间可出峰。

解：t R = t M （1 + k’） = 0.5（1+5） = 3 min2. 保留值与分配系数t R = t M （1 + k’） = t M （1 + K·V S / V M ）可见，（1）K 大 → t R 大。

（2）在相同色谱条件下，如两组分的K 值相同，则色谱峰重合；差别越大，色谱峰分离度越大。

四、塔板理论（plate theory ）为了研究色谱峰形状及评价柱效，建立了塔板理论。

将色谱柱假想成由许多塔板所组成，在每个塔板上，组分在两相间达成一次平衡。

经多次分配平衡后，各组分由于分配系数不同而彼此分离。

当塔板数足够多时，色谱流出曲线可用高斯（Gaussian ）分布表示：C = σπ2W ·e 222)(σR t t --式中C 为时间t 时组分的浓度，W 为被分离组分的重量，t R 为对应于浓度极大点时的时间（即保留时间），σ为标准偏差。

此方程的图形如下所示：（一）峰高及峰宽度峰高h 为浓度极大值，即图中的AB 。

峰宽度可用以下三种方法表示：标准偏差σ：即图曲线拐点处宽度的一半，即EF 的一半。

半高峰宽W h/2：（半峰宽，半宽度）即峰高一半处的宽度，如图中的GH ，符号，W h/2 = 2.354σ。

峰宽W b ：从峰两边的拐点作切线与基线相交部分的宽度（I J ），又称基线宽度。

W b = 4σ。

（二）理论板数与板高柱效可用理论板数来表示，计算公式如下： n = 2)(σR t → ⎪⎪⎩⎪⎪⎨⎧==222/)(16)(54.5W t n W t n R h R 柱效通常用单位柱长的理论板数来表达，即每米的理论板数（n/L ）。

柱效也可以用相当于一个理论塔板的高度表示，即：H = L/n该式的意义是一个理论板所占据的柱长，以毫米（mm ）为单位。

由于死时间的存在，n 和H 不能确切地反映柱效，尤其是对那些出峰早的组分，因此又提出了有效的塔板数及有效板高的概念。