在线微生物检测技术
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为了在方法学上统一标准，会选取固定的培养基进行实验-----局限性。
离线测量，假阳性的情况一直是出现频率较高的现象之一。
替代方法的推动
国际化组织支持在线微生物检测的发展
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OWBA
FDA
Online Water Bioburden Analysis Workgroup
水系统在线微生物分析工作组
Inert
29 -A p r-1 6 00 :0 0 :0 0
BioCount
06 -M ay -1 6
一个纯化水系统30天的监测图. 每7天会对系统进行维护或灭菌。
00
:0 0
:0 0
0
50000
-50000
Inert particles/100 mL
100000
150000
200000
250000
Technologies过程分析技术) 创 立
FDA 法规方面的战略计划 FDA 高级微生物学家支持快速
微生物检测方法
替代方法的推动
国际化组织支持在线微生物检测的发展
水中微生物负荷在线分析的新概念： 对降低微生物风险关键的考量点，应 用，商业利润
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替代方法的推动
国际化组织支持在线微生物检测的发展
(Hill et al, Field Ana. Chem. & Tech, 3(4-5), 221,1999)
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如何对样品进行判断
当样品在PD 和PMT两个通道被同时检测到的时候 那么它会被定义为AFU
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二极管(PD) 检测 405 nm左右的散射波长
倍增管（PMT） 检测>405 nm的荧光波长
在线微生物检测的特点
AFU计数(单个微生物） 实时显示微生物污染状况
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操作简单 无需样品准备和试剂. 触摸屏 在线和离线检测
检测范围广 1 cell / 100 mL 到 2000 / mL 适用于纯化水和注射用水
多种数据传输方式 SCADA connectivity with ModBus TCP Multiple analog outputs Ethernet standard RJ45/Wi-Fi capable.
- 作为一个工业性质的协会来推行在 线微生物检测 - 成员分别为Merck, Novartis, Amgen, Fresinius, Baxter, P&G, Roche, Sanofi 和 Pfizer
FDA PAT (Process Analytical FDA 无菌过程工艺指南 cGMPs
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不是取消，而是减少药典要求的微生物实验 可以作为有效的降低风险工具
降低采样频率从而降低人工成本
减少微生物超标导致的调查事件 提高对微生物控制的响应 达到实时放行
降低消毒频率从而减少能耗
微生物取样的成本
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微生物取样和检测一直以来是制药生产过程中的 一个关注点
取样和平板培养的成本很高而且时间较长
Rapid Testing Biocount 1 10 50 100
如果微生物限度很低，可能根
本长不出菌落
如果微生物限度很低，那么来自AFU和CFU的方法结果上的差 别不会非常大 出微生物限度很低的情况。
USP 发现，培养法没有办法检
在线vs 平板计数– 为什么会有区别?
CFU (Colony Formation Unit) 检测出的结果是基于一个估计的值，通常能够形成菌落的是多 个细胞。 快速检测方法是对微生物进行直接计数，所以得到的数值也在数量级上较大。 在低浓度的情况下，两种方法体现出的差异性可能不大。但是随着浓度的提高，差异会越来 越大。 下面的例子是使用特定浓度的菌液进行的实验（100 cells/ml)
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连续微生物监控
下图显示了，每天对432个100ml样品的检测情况。 9天的连续监测结果。
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Example: 9 days of continuous bioburden (microbial) monitoring
Microbe Count
Inert particle count value
举例
UPW
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议程
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1
2 3 4 5
为什么使用在线微生物监测
在线微生物检测的特点 应用点 药典对微生物检测替代方法的接受度 验证建议
在线微生物检技术
合规性
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连续测量
与现行法规要求相一致
USP <1223> “对于微生物检测替
代方法的验证”
Ph.EUR. 5.1.6. “微生物限度检测
苗述 shu.miao@ 18861106581
在线微生物检测技术
议程
2
1
2 3 4 5
为什么使用在线微生物监测
在线微生物检测的特点 应用点 药典对微生物检测替代方法的接受度 验证建议
传统微生物检测
常用的平板培养法:
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倾倒法 平板涂布法 薄膜过滤法
由Dr. Koch 和Dr. Petri 在1887年发明
举例
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01 -A p r-1
AFU/100 mL
1000
1500
2000
2500
3000
3500
500
6 00
0
:0 0 :0 0
用户数据– PW
08 -A p r-1 6 00 :0 0 :0 0
15 -A p r-1 6 00 :0 0 :0 0
22 -A p r-1 6 00 :0 0 :0 0
传统微生物检测特点
用菌落数(CFU)来估计细菌或霉菌等微生物的数量. 用CFU来计数只局限于可以培养得出来的微生物.（VBNC，viable but non-culturable, USP1223） 培养的时间和温度是两个非常重要的参数. 比较常用的方法是在30-35℃ 培养5-7天 由于水系统环境的多样性, 在较低的温度(e.g. 20-25 ℃)培养较长的时 间 (e.g., 7–14 days) 可以得到更高的菌落数值。
替代性微生物检测的相关章节
General Information
- 1223 Validation of Alternative Microbiological Methods – 2nd Supplement USP 38
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欧盟药典对微生物替代方法的描述
Information
- 5.1.6 Alternative Methods for Control of Microbiological Quality
在线微生物检测的优势
低成本高质量
对传统的实验室测试方法进行了革新，不用对样品进行 预处理。快速的检测手段有效避免了在试验过程中对样 品的污染。通过优化实验过程和降低能源消耗来实现操 作成本的降低。
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可靠的技术
利用激光介导的荧光技术和散射原理来判断微生物和惰 性粒子。可以检测到通过培养法所检测不出的微生物。
优势
真正的实时监测系统 光学检测技术取代传统培养法 相对于平板法而言，成本低。
牙科医生通过用激光照射的 方法来观察口腔中的细菌。
工作原理
样品流过检测腔，然后在这里激光会对样品进行照 射。. 不规则的散射光线被凹面镜反射后统一方向。. 散射后的光线被收集后用于判断粒子的大小. 代谢产物吸收405nm波长的激光后，会产生大于该波 长的荧光，从而被检测器检测到。 通过软件来判断检测到的是微生物还是微粒。
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为什么推荐在线微生物监测?
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离线微生物监测: 结果不可靠(人为差错) 假阳性 成本高 时间长 影响产品放行时间
在线微生物监测: 可靠的在线结果 允许在线水质放行 最小化取样误差 成本低 不影响产品放行
议程
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为什么使用在线微生物监测
在线微生物检测的特点 应用点 药典对微生物检测替代方法的接受度 验证建议
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微生物中能产生荧光的代谢产物
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(Hill et al, Field Ana. Chem. & Tech, 3(4-5), 221,1999)
代谢产物荧光光谱
通过对两种代谢产物的荧光检测，我们可以对微生物进行判断
405nm Laser
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Fluorescence of metabolites with the 405nm laser
一般, 水系统中取样频率高达每天或者每周。而且 有多个取样点。 大部分结果要5-7天之后才能获得，更有一些需要 长达21天。 据估计，80% 的阳性结果是假阳性结果，其原因 是由于人为误差 制药企业需要决定是否接受这些风险: 是马上将水 用于生产还是等到实验结果出来？
目前微生物检测的方法: 成本高 时间长 结果不可靠 影响产品放行
的替代方法”
较离线测量更加经济
USP 对微生物监控的建议
在线连续监测计数，顺应USP 精神
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USP < 1231 > 对制药用水的建议:
制药用水必须定期进行监测，并且保证水系统处于可控状态下，从而生产出符合质量 要求的水。
USP <1223> 提出并鼓励通过验证后使用替代方法对微生物进行检测。
5.1.6. ALTERNATIVE METHODS FOR CONTROL OF MICROBIOLOGICAL QUALITY The following chapter is published for information. 1. GENERAL INTRODUCTION The objective of this chapter is to facilitate the implementation and use of alternative microbiological methods where this can lead to cost-effective microbiological control and improved assurance for the quality of pharmaceutical products. These alternative methods may also find a place in environmental monitoring. The microbiological methods described in the European Pharmacopoeia have been used for almost a century and these methods - for enumerating and identifying micro-organisms - still serve microbiologists well. Over the years, these methods have been invaluable to help control and secure the production of microbiologically-safe pharmaceutical products. Nevertheless conventional microbiological methods are slow, and results are not available before an incubation period of typically up to 14 days. Thus the results from the conventional microbiological methods seldom enable proactive, corrective action to be taken. Alternative methods for control of microbiological quality have been introduced in recent years, and some of these methods have shown potential for real-time or near-real-time results with the possibility of earlier corrective action. These new methods can also offer significant improvements in the quality of testing.
