普通野生稻杂交后代抗白叶枯病鉴定筛选
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水稻转基因育种的研究进展与应用现状刘志宏1 田 媛2 陈红娜1 周志豪1 郑 洁2 杨晓怀1(1深圳市农业科技促进中心,广东深圳518000;2暨南大学食品科学与工程系,广东广州510632)摘要:随着生物技术发展的不断深入,我国水稻种业的发展也面临着全新的机遇和挑战。
目前,改善水稻品种质量的主要方法有分子标记技术、基因编辑技术和转基因技术。
其中,转基因水稻是利用生物技术手段将外源基因转入到目标水稻的基因组中,通过外源基因的表达,获得具有抗病、抗虫、抗除草剂等优良性状的水稻品种。
近年来,国内外在采用转基因技术进行水稻育种,提升水稻产量、改善水稻品质方面具有较多的研究进展。
在阐述转基因技术工作原理的基础上,概述国内外利用转基因技术在优质水稻育种方面的研究进展,进一步探究转基因技术在我国水稻育种领域的发展前景。
关键词:转基因育种;水稻;病虫害;除草剂Research Progress and Application Status of Rice Transgenic Breeding LIU Zhihong1,TIAN Yuan2,CHEN Hongna1,ZHOU Zhihao1,ZHENG Jie2,YANG Xiaohuai1(1Shenzhen Agricultural Technology Promotion Center,Shenzhen 518000,Guangdong;2Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632)水稻(Oryza sativa L.)作为世界上重要的粮食作物之一,为世界超过1/3的人口提供了主粮,全球种植面积约1.4亿hm2[1]。
“十二五”以来,我国水稻产量连续稳定在2亿t以上[2]。
水稻作为我国的主要粮食作物,在我国粮食生产领域占据着十分重要的地位,水稻品种改良仍是保障种业持续发展和国家粮食安全的重点。
野生稻优良基因的发掘利用研究进展在稻属(Oryza Linnaeus)中,仅2个为栽培种,其余20余种均为野生稻,包括AA、BB、CC、BBCC、CCDD、EE、GG、FF、HHKK、HHJJ 10种染色体组[1]。
我国的野生稻资源较为丰富,其中云南地区就包含了中国仅有的3种野生稻,即药用野生稻(O.officinalis Wall)、疣粒野生稻(O.meyeriana Bail)和普通野生稻(O.rufipogon Griff)[2]。
野生稻由于长期在野生状态下生长,经过抵御病虫害的侵袭和不良环境的自然选择,蕴含了大量的优良基因,是一个天然的基因宝库[3]。
但栽培稻由于长期经人为的选育和驯化,许多有利基因被定向选择而过滤掉,致使其具有传狭窄性和单一性,大大降低了抵抗病虫害侵袭和忍受各种逆境的能力。
解决此问题的有效方法,就是从野生稻中发掘栽培稻已丢失的优良基因,并应用于栽培稻的遗传育种,以拓宽其遗传基础。
现已从野生稻中发掘出抗病虫、耐旱、耐寒、高产及其他许多有用基因[4]。
对这些优良基因进行分子标记定位,有助于及时发掘并充分利用野生品种资源,为栽培稻育种做出贡献。
目前迅速发展的分子生物技术促进了这一领域的研究,现对多年来野生稻中优异基因的发掘和分子标记定位,以及这些基因在栽培稻中的转移利用作一综述。
1野生稻抗虫基因发掘及定位自20世纪70年代起,许多国家相继开展了水稻稻飞虱抗性基因的发掘工作,其中发现的部分抗性基因来自野生稻。
目前已经有10多个抗稻飞虱基因从5种不同的野生稻资源中找到并鉴定。
在澳洲野生稻(Oryza australiensis)中,发掘的抗褐飞虱有Bph10和Bph18。
其中Bph10是由Ishii et al[5]鉴定出的,是1对显性的抗虫基因,且被定位在第12号染色体上,与RG457相距3.68 cM。
研究表明:Bph10抗褐飞虱生物型1、2、3。
Bph18由Jena et al[6]鉴定出,被定位在第12号染色体上S15552和RM463之间。
2023-2024学年山东省菏泽市高二下学期期中生物试题1.在我国很多地区都有制作米酒的传统,先将糯米蒸熟,冷却至30℃左右,再加少许放凉的水和一定量的酒曲混合均匀后置于容器,在米饭中间挖一个小洞,加盖后周围用茅草捂住,几天后即可取小洞处的酒汁饮用。
下列说法正确的是()A.先将糯米蒸熟,有利于微生物分解其中的有机物B.为保证米酒风味纯正,需通过对酵母菌菌种的选育及纯化培养来获得酒曲C.发酵后期随代谢产物的积累,发酵液的pH增大,酵母菌活性逐渐下降D.若最终获得的米酒偏酸,可能的原因是醋酸菌无氧发酵产生了醋酸2.某生物活动小组以萝卜为材料分别用3种不同浓度的食盐制作泡菜,下图是活动小组记录的亚硝酸盐含量与发酵天数的关系图。
下列说法正确的是()A.先用沸水短时间处理萝卜条,再添加陈泡菜水可缩短腌制时间B.泡菜的最佳食用时间应在发酵的第5天左右C.泡菜坛装八成满可以防止发酵过程中酵母菌、乳酸菌等产生的CO 2使发酵液溢出D.食盐的浓度越高,亚硝酸盐含量的峰值越低,这与抑制其他杂菌繁殖有关3.微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
在分离、纯化酵母菌实验中,划线接种、培养结果如图。
下列说法正确的是()A.该培养基的制备流程为灭菌→加琼脂→倒平板B.每次接种前,灼烧接种环待冷却后重新蘸取菌液划线,可将菌种逐步稀释C.实验中只有接种需要在酒精灯火焰旁进行D.利用平板划线法纯化酵母菌,接种环的灼烧次数与划线次数不同4.下列关于“土壤中分解尿素细菌的分离与计数”(纯化培养的培养基中菌落数为178个)的说法,合理的是()A.分离分解尿素的细菌时,尿素是培养基中唯一的氮源和碳源B.用滴管吸取0.1ml菌液滴加到培养基表面的过程中无需再灭菌C.图中振荡的目的主要是为了增加分解尿素的细菌的浓度,属于选择培养D.由计数结果可知10克土样中的菌株数约为1.78×10 9个5.青霉菌是生产青霉素的重要工业菌种。
水稻白叶枯病抗性基因研究进展
王丹
【期刊名称】《农业科学》
【年(卷),期】2024(14)4
【摘要】白叶枯病(Bacterial blight, BB)是影响水稻产量最严重的细菌病害之一。
传统的化学防治方法效果往往不理想,选育和利用抗病品种是最经济、最有效、最环保的方法,而抗病基因的发掘及其功能研究是进行抗病育种的重要基础。
到目前为止,已有48个水稻白叶枯病抗性基因被国际注册或期刊报道,其中17个基因已成功克隆和鉴定。
本文对水稻白叶枯病抗性基因的研究和育种应用进展进行了综述。
【总页数】14页(P437-450)
【作者】王丹
【作者单位】浙江师范大学生命科学学院金华
【正文语种】中文
【中图分类】S43
【相关文献】
1.水稻白叶枯病抗性基因及其分子标记辅助选择育种研究进展
2.水稻白叶枯病抗性基因研究进展
3.水稻白叶枯病抗性基因Xa21的分子生物学研究进展
4.关于水稻白叶枯病抗性基因研究进展
5.水稻白叶枯病抗性相关基因的研究进展
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分子标记辅助选择在水稻抗病育种研究进展官华忠摘要:随着水稻高密度分子遗传图谱的构建和重要农艺性状的基因或QTL的定位,分子标记辅助选择逐渐用于质量和数量性状的遗传改良。
本文综述了分子标记辅助选择在水稻抗稻瘟病、抗白叶枯病和抗细菌性条斑病的育种应用的研究进展,存在的问题和展望。
关键词:分子标记辅助选择,水稻育种,稻瘟病,白叶枯病,细菌性条斑病水稻是全球重要的粮食作物之一,全世界有25亿以上的人口主食大米,其中中国是世界上最大的水稻生产和消费国,60%人口以稻米为主要食粮。
自从实现杂交水稻三系配套以来,我国杂交水稻年种植面积1533.33万hm2左右,约占水稻总面积的50%,而产量则占水稻总产的近60%[1],为我国粮食生产做出了巨大贡献。
然而,水稻病害的危害一直严重地影响着水稻生产。
水稻病害种类很多,全世界有近百种,我国正式记载的达70余种,其中具有经济重要性的有20余种[2]。
稻瘟病、白叶枯病发生面积大,流行性强,危害严重,两者均为水稻“三大病害”之一;同时由于近年来随着感病杂交水稻的大面积推广,细菌性条斑病发生日趋广泛和严重,也已成为我国南方稻区最重要的水稻病害之一。
因此,筛选出具有持久抗瘟能力的种质资源做供体亲本,采用相宜的杂交配组方式,从而培育具有持久抗瘟能力的不育(保持)系和恢复系,并推广和种植抗病品种,是防治水稻稻瘟病病害的最经济有效的措施。
目前国内多数育种单位还基本上是靠传统的方法进行抗病育种,依赖于抗性鉴定和植株表型的选择,常常受到没有合适的致病菌株和病菌发病条件的限制,鉴定结果不准确,育种效率低[3]。
此外,用传统方法构建基因累加系(即基因聚合)是很困难的,难于选育出聚合多个抗病基因的持久抗病品种。
利用生物技术培育持久抗病性品种是现代开辟的新途径。
例如分子标记辅助选择(Maker assisted selection, MAS),这种技术是通过分析与抗病基因紧密连锁的分子标记的基因型来对目标基因进行选择。
水稻白叶枯病抗性基因Xa21的分子生物学研究进展陈小林;颜群;高利军;高汉亮【摘要】由黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)引起的白叶枯病是水稻重要细菌性病害之一.迄今,已有7个水稻白叶枯病抗性基因被克隆.Xa21是第一个被克隆的白叶枯病抗性基因,因具有广谱抗性而受到广泛的关注.对Xa21的发现、定位及克隆、表达特征、编码产物XA21的生化特性、作用与调控以及XA21介导的免疫反应模式等方面的研究结果进行综述,并对今后的研究方向进行展望.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】7页(P8-14)【关键词】水稻;白叶枯病;抗性基因;Xa21【作者】陈小林;颜群;高利军;高汉亮【作者单位】广西作物病虫害生物学重点实验室广西农业科学院植物保护研究所,南宁530007;广西作物病虫害生物学重点实验室广西农业科学院植物保护研究所,南宁530007;广西作物病虫害生物学重点实验室广西农业科学院植物保护研究所,南宁530007;广西作物病虫害生物学重点实验室广西农业科学院植物保护研究所,南宁530007【正文语种】中文由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害之一[1,2]。
受白叶枯病危害的田块一般减产10%-20%,严重的减产50%以上,甚至绝收[3]。
白叶枯病1909年首次在日本福冈地区出现,随后在亚洲各国以及非洲、美洲和澳洲等地的水稻产区被发现,已成为一种世界性的水稻病害[4]。
目前,我国除了新疆、西藏和东北北部以外,其余各稻区均有发生,尤其在南方稻区危害更为严重[3]。
抗性基因的研究一直以来都是水稻白叶枯病防治的重要内容之一,并且已取得较大的成果。
到目前为止,经注册确认的和期刊报道的水稻白叶枯病抗性基因共38个,其中,Xa1、xa5、xa13,Xa21、Xa23、Xa26和Xa27等7个基因已成功被克隆[5-11]。
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(7): 1173−1180/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z106)和中央级公益性科研院所基金项目(2060302-2-08)资助。
*通讯作者(Corresponding author): 赵开军, E-mail: zhaokj@ ** 共同第一作者Received(收稿日期): 2009-01-21; Accepted(接受日期): 2009-03-13.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01173水稻抗白叶枯病新基因Xa32(t )的鉴定和初步定位郑崇珂1,2 王春连2,3,** 于元杰1 梁云涛2 赵开军2,3,*1山东农业大学农学院 / 作物生物学国家重点实验室, 山东泰安271018; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 农业部作物遗传育种重点实验室, 北京100081; 3 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京100081摘 要: 通过多菌系接种鉴定及抗谱分析, 并与目前国际上已知抗白叶枯病基因比较, 证明在水稻抗源C4064中含有一个新的抗白叶枯病基因, 暂命名为Xa32(t)。
应用分离集团分析法(BSA), 借助SSR 和EST 等分子标记, 对该基因进行了分子标记定位。
通过对F 2分离群体及F 3家系单株进行遗传连锁性检测, 发现6个位于水稻第11染色体长臂末端的分子标记RM27256、RM27274、RM2064、ZCK24、RM6293和RM5926与Xa32(t)基因连锁。
它们与Xa32(t)基因间的遗传距离分别为2.1、1.0、1.0、0.5、1.5和2.6 cM 。
其中标记RM6293和RM5926位于染色体近端粒一侧, 其他4个标记RM27256、RM27274、RM2064和ZCK24位于基因的另一侧。
野生稻抗性基因的发掘、定位与利用研究进展王金英;江川;李书柯【摘要】The wild rice is the ancestor of modern cultivated rice.Tens of thousands years ago,ancient human domesticated wild rice into cultivated rice.However,in the process of domestication,about 1/3 alleles and 1/2 genotypes from wild rice has been lost including disease-resistance,insect-resistance,weed-resistance,stressresistance and high yield and quality genes.The genes of disease-resistance(rice blast,bacterial blight,bacterial leaf streak),insect-resistance(rice hopper,yellow rice borer,Cnaphalocrocis medinalis Guenee),stress-resistance(cold resistance,drought resistance,low phosphorous resistance) from wild rice and the utilization of wild rice on rice breeding were summaried in recent years in the paper.%野生稻是现代栽培稻的祖先,几万年前古人类就开始将野生稻逐步驯化成现代栽培稻。
但在野生稻驯化成栽培稻过程中,约有1/3的等位基因和1/2的基因型丢失了,其中包括抗病、虫、杂草、抗逆境基因和高产优质等大量特异基因。
2005-2012年湖北省水稻区域试验品种(系)抗白叶枯病鉴定与评价宋发菊;黄代金;张其蓉;田进山;赵开荣;刘敏;牟愔【摘要】对湖北省2005-2012年918份水稻区试品种(系)进行田间剪叶接种抗白叶枯病鉴定.结果表明,抗病的品种(系)占9.37%,感病的品种(系)占90.63%,感病品种(系)占的比例大于抗病品种(系)的比例.区试对照材料感病率为95.33%,每年感病对照材料对白叶枯病发病均能达到感病或高感水平,且发病稳定,这为水稻区试品种(系)抗白叶枯病鉴定奠定了基础.本研究明确了近年来湖北省水稻区试品种(系)的抗白叶枯病现状及发展趋势,可为水稻新品种(系)的合理布局和抗性育种提供参考.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2015(054)001【总页数】3页(P84-86)【关键词】水稻区试品种(系);水稻白叶枯病;抗性鉴定【作者】宋发菊;黄代金;张其蓉;田进山;赵开荣;刘敏;牟愔【作者单位】宜昌市农业科学院,湖北宜昌443004;宜昌市农业科学院,湖北宜昌443004;宜昌市农业科学院,湖北宜昌443004;宜昌市农业科学院,湖北宜昌443004;宜昌市农业科学院,湖北宜昌443004;宜昌市农业科学院,湖北宜昌443004;宜昌市农业科学院,湖北宜昌443004【正文语种】中文【中图分类】S511水稻白叶枯病是水稻生产上的主要病害,在全球范围内各稻区均有发生,以日本、印度和中国发生较重,也是湖北省的重要病害之一。
水稻遭受白叶枯病菌侵害时可造成20%~40%的产量损失,有的甚至颗粒无收[1,2]。
白叶枯病原存在致病性的分化现象,不同地区的病菌致病性可能不同。
当同一抗病品种种植一段时间后,由于病菌与品种的协同进化,新的毒性小种可导致品种的抗性丧失。
寻找和挖掘抗性强的稻种资源,进行基因部署和基因轮换,是解决抗性丧失的最有效的方法[3-5]。
宜昌市农业科学院一直承担湖北省水稻区试品种(系)对白叶枯病的抗性鉴定工作,本研究分析和整理了2005-2012年湖北省水稻区试品种(系)对白叶枯病的抗性数据,明确区试品种(系)对白叶枯病的抗性现状,为水稻新品种(系)的合理布局、抗性育种提供科学依据。
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2024, 45(2): 199-206DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202307007钟小惠, 蒋哲, 陆守腾, 等. 水稻抗白叶枯病种质资源筛选及抗性基因鉴定[J]. 华南农业大学学报, 2024, 45(2): 199-206.ZHONG Xiaohui, JIANG Zhe, LU Shouteng, et al. Germplasm resource screening of resistance against bacterial blight and identification of resistance gene in rice[J]. Journal of South China Agricultural University, 2024, 45(2): 199-206.水稻抗白叶枯病种质资源筛选及抗性基因鉴定钟小惠1,2†,蒋 哲1,2†,陆守腾1,黄福钢1,2,王彩先3,农保选4,邱永福1,2(1 广西大学 农学院/广西农业环境与农产品安全重点实验室/广西高校作物栽培与生理学重点实验室, 广西 南宁 530004;2 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点试验室, 广西 南宁 530004;3 玉林农业科学院,广西 玉林 537000; 4 广西壮族自治区农业科学院 水稻研究所, 广西 南宁 530007)摘要: 【目的】筛选抗水稻白叶枯病V和IX型菌的水稻品种。
【方法】以97个收集自热带亚热带地区的抗褐飞虱水稻品种为待测样品,水稻白叶枯病V、IX型菌为菌种。
用剪叶接种法鉴定水稻在苗期和成株期的抗白叶枯病能力并划分抗性等级。
对抗性表现优异的品种构建定位群体,并进行基因定位及克隆。
【结果】筛选出苗期抗V型菌的水稻品种20个,成株期8个,2个时期均表现为中抗及以上的品种4个;苗期抗IX型菌的水稻品种34个,成株期9个,2个时期均表现为中抗及以上的品种1个。
药用野生稻基因组DNA提取方法比较毕继安1,王芳1,张国芳1,朱宏芬1,沈岚1,郑红英2,严成其1∗㊀(1.宁波市农业科学研究院生物技术研究所,浙江宁波315101;2.宁波大学植物病毒学研究所,浙江宁波315201)摘要㊀以药用野生稻为试验材料,分别选用传统的CTAB提取法㊁CTAB改良方法㊁碱裂解法㊁磁珠法㊁吸附柱法㊁尿素提取法及酶消化法7种方法提取水稻叶片组织DNA,7种方法分别标记为A G㊂通过比较这些方法提取出DNA的浓度和纯度,分析这些方法的优劣势㊂7种方法均能获得较好的基因组,按获得DNA浓度表现为A>B>F>C>G>E>D,纯度表现为D>E>C>G>B>F>A㊂综合考量DNA的纯度㊁浓度㊁提取时间㊁成本㊁安全无毒等方面因素,若对基因组的质量要求不高,只是做简单的检测且考虑成本问题,可以选择CTAB提取法㊁CTAB改良方法和尿素提取法;若需要高纯度基因组,可以选择磁珠法㊁吸附柱法㊁碱裂解法;若考虑安全无毒㊁快速提取及成本可控,可以选择磁珠法㊁吸附柱法;若样品稀有,可以选用CTAB提取法和CTAB改良法㊂关键词㊀药用野生稻;叶片;基因组;提取方法;有利基因中图分类号㊀S511㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀文章编号㊀0517-6611(2023)14-0086-04doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2023.14.021㊀㊀㊀㊀㊀开放科学(资源服务)标识码(OSID):ComparisonofDifferentExtractionMethodsofGenomicDNAfromOryzaofficinalisBIJi⁃an,WANGFang,ZHANGGuo⁃fangetal㊀(InstituteofBiotechnology,NingboAcademyofAgriculturalScience,Ningbo,Zhejiang315101)Abstract㊀WithOryzaofficinalisastestmaterial,sevenmethodswereusedtoextractthegenomicDNAfromtheOryzaofficinalis,includingtraditionalCTABmethod,improvedCTABmethod,alkalinelysismethod,magneticbeadmethod,adsorptioncolumnmethod,ureaextractionmethodandenzymedigestionmethod.ThesevenmethodsarelabeledA-G,respectively.BycomparingtheconcentrationandpurityofDNAextractedbythesemethods,theadvantagesanddisadvantagesofthesemethodswereanalyzed.AllsevenmethodscanobtaingenomicDNA.TheorderofconcentrationfromhightolowisA>B>F>C>G>E>D,andtheorderofpurityfromhightolowisD>E>C>G>B>F>A.Consideringthepurity,concentration,extractiontime,cost,safetyandnon⁃toxicityoftheextractionprocess,CTABorCTABimprovementextractionandureaextractionmethodmaybepreferredaccordingtothecostandpurity.Themagneticbead,adsorptioncolumnandalkalinelysismethodispreferredwhenhigh⁃purityarerequired.Themagneticbeadandadsorptioncolumnmethodispreferredwhensafety,non⁃toxicity,rapidextrac⁃tionandcostlittlearerequired,whiletheCTABandCTABmodificationmethodisrecommendedforlimitedsamples.Keywords㊀Oryzaofficinalis;Leaf;Genome;Extractionmethod;Favorablegenes基金项目㊀宁波市农业科学研究院院长基金项目(2022NKYP005);宁波市科技创新2025重大专项(2021Z106);宁波市科技创新2025重大专项(2019B10004)㊂作者简介㊀毕继安(1987 ),男,山东青岛人,博士,从事抗病育种研究㊂∗通信作者,研究员,博士,从事抗病育种研究㊂收稿日期㊀2022-08-08㊀㊀药用野生稻多生长于海拔600 1100m丘陵山坡中下部的冲积地和沟边,为喜暖㊁喜雨㊁喜潮湿的短日照植物,适宜在阴蔽㊁腐殖质丰富㊁pH为6左右的肥沃砂壤土上生长㊂药用野生稻在稻属22个种中长势最强,是普通栽培稻的20倍以上,在进化过程中,药用野生稻形成了丰富的遗传多样性,药用野生稻因长期处于野生环境,经受各种自然灾害和地理生态因素的考验,形成了较强的抗性和耐受不良环境因素等方面的优异性状,是天然的基因库㊂药用野生稻农艺性状具有大穗㊁宽叶片㊁粗茎秆等性状,为遗传改良提供了良好的资源条件㊂因此,深入挖掘药用野生稻的优良基因对于新种质创新具有重要意义㊂①大量的抗病基因㊂有研究人员通过对抗病基因的克隆以及高抗条纹叶枯病水稻材料的获得,使药用野生稻资源得到了充分利用,更进一步推动了药用野生稻抗病基因的开发与研究[1]㊂水稻白叶枯病是水稻生长发育过程中常见的病害,而药用野生稻具有大量的优异抗性基因,因此从药用野生稻中挖掘抗白叶枯病基因并加以利用,得到了广大科研工作者的高度重视㊂研究发现,云南药用野生稻多个居群类型对4种主要病害存在一定抗性[2-3],云南药用野生稻种质资源对当地一定时期流行的白叶枯病小种及国内外部分强致病菌整体抗性较好[4],这些研究为药用野生稻的有效抗病基因挖掘奠定了基础㊂②创制新种质资源㊂研究发现,利用构建药用野生稻TAC文库筛选有利基因并通过克隆㊁遗传转化方法及结合育种技术,有望实现药用野生稻在新种质资源上的创制[5-7]㊂同时,栽培稻与药用野生稻种间杂种体内异源基因组重组引起的DNA甲基化变异规律为不对称体细胞杂交的基因融合奠定了基础[8],有研究发现,将药用野生稻总DNA通过穗茎注射法导入恢复系R225可以创制耐阴㊁耐光氧化的水稻新种质[9]㊂③优异内源基因的挖掘㊂有研究表明,云南药用野生稻净光合速率较高,其在羧化效率和光饱和点上所表现出的高光效潜能为探索机体高光效基因提供了理论依据[10-11]㊂药用野生稻中淀粉合成酶基因在同属内的自然进化规律的探索,也为水稻的遗传育种和品质改良提供科学依据[12-13]㊂④抗逆途径基因挖掘㊂有研究人员通过基于药用野生稻干旱胁迫转录组数据分析探索ADF基因对药用野生稻非生物胁迫的影响[14],同时还有研究表明,药用野生稻中LEA蛋白在植物抗逆反应起着重要的作用,这为水稻遗传改良提供重要的理论依据[11,15]㊂上述研究说明药用野生稻中药用野生稻中存在大量㊁有利㊁可挖掘的基因,是种质创新的有利基因库,而组织样品的提取方法还不够完善与全面,这将会导致存在部分有利基因片段获取不够完整,因此选择一种合适的方法提取药用野生稻基因组DNA对于有利基因的深入挖掘至关重㊀㊀㊀安徽农业科学,J.AnhuiAgric.Sci.2023,51(14):86-89要㊂药用野生稻因其生理结构特征比栽培稻较为复杂,其基因组提取相对困难,提取质量相对偏低,因此对药用野生稻DNA提取方法进行探索,优化提取步骤,为获得更加合适㊁更加完整的基因组结构提供理论依据㊂笔者以药用野生稻为素材,综合采用7种方法来提取植物的基因组,比较各种方法所提取的基因组含量与纯度,旨在为后序深入挖掘药用野生稻的有利基因提供技术依据㊂1㊀材料与方法1.1㊀试验材料㊀药用野生稻为该试验培育,准备药用野生稻相同叶位的7组样品,每组样品准确称取0.6g,然后三等分㊂主要试剂:聚乙烯吡咯烷酮(生工生物工程(上海)股份有限公司,中国),β-巯基乙醇(索莱宝生物科技有限公司,中国),ProteinK(索莱宝生物科技有限公司,中国),磁珠(美国Promega公司,US),DNA提取试剂盒(QIAGEN,Germany),R-淀粉酶(美国Sigma公司,US)㊂主要仪器:组织研磨仪(Tissuelyser-96,上海净信实业发展有限公司),离心机(5424R,德国艾本德股份公司),恒温水浴锅(DK-8D,上海一恒科学仪器有限公司),超微量紫外分光光度计(NanoDropOneC,US)㊂1.2㊀试验方法1.2.1㊀基于CTAB的经典DNA提取方法㊂①取0.2g水稻叶片组织于液氮中研磨成细粉状,并将粉末快速转移到2mL离心管中㊂②加入500μL提取缓冲液[2%CTAB,100mmol/LTris-HCl(pH7.4),50mmol/LEDTA(pH8.0),1.4mol/LNaCl,0.2%β-巯基乙醇],颠倒混合均匀离心管,将混合物置于65ħ水浴中孵育30min,每隔10min颠倒混匀一次㊂③将离心管置于离心机中,12000r/min离心15min㊂转移离心管中上层液体到新的1.5mL离心管中㊂④加入200μL苯酚ʒ氯仿ʒ异戊醇(25ʒ24ʒ1)到离心管中并颠倒混合均匀,于室温静置5min,将离心管置于离心机中,12000r/min离心10min,转移离心管中上层液于新的1.5mL离心管中㊂⑤加入200μL氯仿ʒ异戊醇(24ʒ1)溶液轻轻颠倒混匀,于室温静置5min后,将其置于离心机中,12000r/min离心10min,转移离心管的上层液体到新的1.5mL离心管中㊂⑥加入2倍体积的冷乙醇(预先于-20ħ保存),轻混匀,并转移到-20ħ冰箱中静置30min㊂⑦将离心管置于离心机中,14000r/min离心2min,弃上清㊂⑧加入洗涤缓冲液(70%乙醇,10mmol/L醋酸铵),重悬沉淀,12000r/min离心1min,弃上清㊂重复该操作步骤一次㊂⑨将沉淀置于空气中干燥并用100μL超纯水将其溶解,并将其置于37ħ水浴锅中孵育30min㊂最后将其置于-20ħ冰箱中备用或用于后续试验[16-17]㊂1.2.2㊀基于CTAB提取DNA方法的改良㊂①取0.2g水稻叶片和0.1g聚乙烯吡咯烷酮于液氮中研磨成粉末㊂②将粉末转移至2mL离心管中㊂随后将1mL预冷提取缓冲液(100mmol/LTris-HCl㊁50mmol/LEDTA㊁500mmol/LNaCl和2%β-巯基乙醇,最终调节pH至8.0)加入离心管中,涡旋振荡混合物,并在室温下静置10min㊂然后将离心管于4ħ12000r/min下离心10min,弃上清㊂③将沉淀悬浮于1mL预热的提取缓冲液中(3%CTAB㊁1.4mmol/LNaCl㊁100mmol/LTris-HCl㊁0.5mol/LEDTA和2%β-ME,pH为8 0),与此同时加入20μLProteinK并将混合物于65ħ水浴下孵育至少1h,同时每隔20min颠倒混匀一次,然后将混合物于4ħ12000r/min下离心10min㊂④将上清液转移到新的2mL离心管中,然后向离心管中加入等体积的氯仿ʒ异戊醇(24ʒ1)㊂颠倒混匀后置于室温下静置10min,然后于4ħ12000r/min离心10min㊂⑤将水相转移到新的2mL离心管中㊂加入大约1/10体积的2.5mol/LKAC溶液(pH5.2)㊂⑥将上层水相转移到另一个新的2mL管中,加入1/3体积的冰异丙醇溶液㊂将离心管静置于-20ħ冰箱中30min,随后在4ħ12000r/min下离心10min㊂⑦弃上清,用多糖㊁多酚洗涤缓冲液(含50mmol/LTris-HCl㊁5mmol/LEDTA㊁350mmol/L山梨糖醇,pH8.0)洗涤1次㊂⑧弃掉上清液,将含有DNA的白色沉淀用70%乙醇洗涤2次,自然环境干燥㊂⑨将最终的DNA沉淀用100μL超纯水溶解[18-19]㊂1.2.3㊀碱裂解法㊂①取0.2g水稻叶片组织于液氮中研磨成细粉状,接着将其转移到2mL离心管中㊂②在离心管中加入100μL碱性裂解试剂[25mmol/LNaOH和0.2mmol/LEDTA(PH8.0)],随后添加100μL缓冲试剂[40mmol/LTris-HCl(pH5)]并混匀,静置2min㊂③将离心管置于离心机中12000r/min离心5min,取上清液㊂④上清液中加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)及5μLRNase(10mg/mL)后于37ħ水浴锅中孵育30min,再将其置于65ħ水浴锅孵育10min㊂⑤加入200μL氯仿ʒ异戊醇(24ʒ1)溶液并轻轻颠倒混匀,静置5min后,将其置于离心机中,12000r/min离心10min,转移离心管中的上层液体到新的1.5mL离心管中㊂⑥加入2倍体积的冷乙醇(预先于-20ħ保存),轻混匀,并于-20ħ冰箱中静置30min㊂⑦将离心管置于离心机中,14000r/min离心2min,弃上清㊂⑧加入70%乙醇溶液重悬沉淀,12000r/min离心1min,弃上清;重复该操作步骤1次㊂⑨室温条件下晾干沉淀,加入100μL超纯水充分溶解,保存于-20ħ冰箱中待用[20]㊂1.2.4㊀磁珠法㊂①取0.2g水稻叶片组织于液氮中研磨成粉末,并将粉末转移到2mL离心管中,并加入1mL裂解缓冲液(2%CTAB㊁2.5mmol/LNaCl㊁0.1mol/LTris-HCl㊁20mmol/LEDTA),颠倒混匀㊂②将上述混合物通过0.22μm过滤器,转移到新2mL离心管中,在滤液中加入800μL异丙醇和50μL蛋白酶K,充分混匀㊂③在滤液中加入20μL磁珠原液并涡旋3 4min,静置1min㊂④将混合物置于磁力架沉淀磁珠,弃去上清中不含磁珠的液体㊂⑤磁珠用1mLCW1缓冲液(含7mol/L盐酸胍的50%异丙醇溶液)进行清洗㊂⑥磁珠再用1mLCW2缓冲液(75%乙醇)洗涤2次㊂随后室温放置5min以蒸发残留的乙醇㊂⑦将30μL洗脱缓冲液(10mmol/LTris-HCl,pH8.5,预热至55ħ)加入磁珠中,随后在55ħ水浴锅中孵育5min,孵育期间每隔1min涡旋20s㊂⑧将混合物置于磁力架上,吸取上清液备用[21-23]㊂7851卷14期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀毕继安等㊀药用野生稻基因组DNA提取方法比较1.2.5㊀吸附柱法㊂①取0.2g水稻叶片组织置于研钵中,同时加入液氮充分研磨㊂②加入440μL缓冲液AP1,颠倒混匀材料,再加4μLRNase后,剧烈涡旋混匀㊂③将上述混合物在65ħ下温浴15min,每隔5min轻轻颠倒试管2 3次㊂④加入130μL缓冲液AP2后,轻柔颠倒混匀,并将其置于冰上静置5min㊂⑤将离心管置于离心机中,14000r/min离心5min,缓慢吸取上层液体(500μL)置于MiniSpinColum(柱)中,14000r/min离心1min㊂⑥将上一步中的滤液(450μL)缓慢转移至一新的离心管中,并在溶液中缓慢加入1.5倍体积(675μL)的缓冲液AP3㊂⑦将上一步中混合液(包括形成的沉淀)转移至MiniSpinColum(柱)中,14000r/min离心1min,丢弃废液㊂⑧在MiniSpinColum(柱)中加入500μL缓冲液AW,放置3 5min,12000r/min离心1min,弃掉废液㊂重复洗涤1次㊂⑨在MiniSpinColum(柱)中加入500μL无水乙醇,放置3 5min,12000r/min离心3min,丢弃废液和收集管㊂⑩在MiniSpinColum(柱)下置1.5mL离心管,吸取100μL超纯水加到Dneasy膜上㊂65ħ水浴锅中静置5min,14000r/min离心1min得到DNA㊂1.2.6㊀尿素提取法㊂①利用液氮将0.2g水稻叶片组织研磨成粉末,并转移到2mL离心管中㊂②在离心管中加入600μL尿素提取液(42g尿素㊁7mL5mol/LNaCl㊁5mL1mol/LTris-HClpH8.0㊁4mL0.5mol/LEDTApH8.0和5mL20%Na-N-月桂酰肌氨酸,加入无菌蒸馏水调整最终体积至100mL,温度不高于70ħ)涡旋混匀,于室温下静置1h㊂③将离心管置于离心机中,以12000r/min离心5min㊂④取上清,加入等体积的苯酚ʒ氯仿(1ʒ1)溶液,涡旋混匀离心管㊂⑤将离心管置于预冷的4ħ离心机中,12000r/min离心5min㊂⑥取上清液,加入等体积的异丙醇溶液,颠倒混匀,于4ħ环境静置1h㊂⑦将离心管置于预冷的4ħ的离心机中,12000r/min离心5min㊂⑧弃上清,真空干燥沉淀2min㊂⑨用100μLTE缓冲液(1mL1.0mol/LTris-HCl和0.2mL0.5mol/LEDTA,调节pH到8.0,并用无菌水定容至100mL)溶解沉淀,待用[24-25]㊂1.2.7㊀酶消化法㊂①取0.2g水稻组织叶片在液氮中充分研磨后加入300μL缓冲液[含0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)和0.1mol/LNaCl],并涡旋振荡混匀㊂②在上述溶液中加入10μLR-淀粉酶(Sigma,US),颠倒混匀,于80ħ恒温金属浴中孵育1h㊂③加入33μL2%SDS㊁20μLProteinK和1μLRNaseA,并将其置于55ħ恒温金属浴中孵育1h㊂④加入300μL苯酚ʒ氯仿ʒ异戊醇(25ʒ24ʒ1)溶液,剧烈涡旋振荡2min㊂⑤将上述溶液于15000r/min离心1min,转移上清溶液至2.0mL离心管中,随后加入2倍体积预冷乙醇并置于冰上静置15min㊂⑥将离心管置于预冷的离心机中,4ħ15000r/min离心15min,弃上清㊂⑦离心管中加入500μL预冷的70%乙醇,洗涤沉淀,4ħ,15000r/min离心1min㊂重复1遍㊂⑧弃上清,室温下风干沉淀,加入100μL超纯水溶解沉淀,待用[26-28]㊂2㊀结果与分析2.1㊀水稻基因组浓度㊀采用7种方法得到水稻叶片的基因组后,利用超微量紫外分光光度计测量其浓度,具体数值见表1,不同提取方法得到的DNA浓度存在差异,浓度由高到低依次为A>B>F>C>G>E>D,通过CTAB法获得的基因组DNA可能存在与植物组织中少量的糖类及淀粉或其他物质结合,因此在测量过程中存在一定偏差,导致浓度偏高;而通过磁珠法提取的基因组,因其是在外磁场的作用下纳米磁性微球与核酸结合,磁场大小及磁性微球的特性决定其结合能力,因此浓度偏低一些㊂2.2㊀水稻基因组纯度㊀核酸纯度一般用A260/A230和A260/A280来表示㊂其中,260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长,230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,280nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长㊂高纯度的DNA其A260/A280比值大于1.8,如果比值小于1.8,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要对样品进行纯化;同时DNA纯度的另一个指标为A260/A230,如果A260/A230的比值大于1.8,说明纯度较高,如果小于1.8,表示样品被碳水化合物(糖类)㊁盐类或有机溶剂污染,需要对样品进行纯化㊂根据测定结果来看,这些方法提取的DNA纯度均较高,纯度表现为D>E>C>G>B>F>A(表1)㊂从纯度数据来看,利用磁珠法提取的基因组纯度最高㊂表1㊀不同提取方法的样品浓度及纯度比较Table1㊀Comparisonofconcentrationandpuritybydifferentextrac⁃tionmethodsofsample提取方法Extractionmethod样品平均浓度Averageconcentrationofsamplesʊng/μLA260/A230A260/A280A1816.2861.8501.878B1603.5771.9051.896C1585.3021.9851.936D1131.6672.0232.133E1249.0241.9782.005F1587.4991.8761.868G1328.3691.9611.9063㊀讨论对以上7种方法提取的基因组DNA浓度及纯度进行测定,发现经典CTAB提取方法提取的浓度及纯度较高,适合一般性试验需要,但在试验过程中会用到含有氯仿的有毒试剂,且耗时较长,这需要试验人员规范操作;基于CTAB的改良方法,提取过程中会使用蛋白酶K,这样会有效酶解与核酸结合的组蛋白,使DNA游离在溶液中,且EDTA等螯合剂均不能使之失活,这样提取出的DNA纯度会更高一些;利用碱裂解法提取的叶片组织效果和CTAB相差不大,在裂解植物组织方面效果较好,尤其是在提取纤维素较多的根部㊁茎部优势较为明显;磁珠法提取基因组DNA在前期裂解上使用的是CTAB试剂,但是在纯化的过程中利用了磁珠的优势,使其能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合,并利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性,在88㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年Chaotropic盐(盐酸胍㊁异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下,能从样本中分离出纯度较高的基因组DNA,可用于后续分子杂交试验,但是价格较昂贵㊂吸附柱法是在离心吸附柱内使用一种硅基质滤膜,这种滤膜在低pH㊁高浓度盐存在的条件下,可以选择性吸附DNA片段,而蛋白和其他杂质不会被吸附㊂通过这种方法提取出的DNA浓度相对其他方法较低,有一定量的DNA损失,但是纯度相对较高,减少了有毒试剂的使用,提取时间也相对较短;尿素提取法操作过程比较温和,不需要剧烈的振荡及高温的处理,不易造成DNA变性降解;酶消化法提取的DNA可以轻松地去除植物组织中的淀粉和糖原,用这种方法提取的DNA能避免了基因组中淀粉及糖原的干扰,使DNA的纯度会更高一些,利于基因组获取更加全面与完整㊂因此,需要根据试验材料㊁目的以及后续研究需要综合评估选用适宜的提取纯化方法,在得率与纯度间取得平衡㊂该研究比较了7种不同DNA提取方法,为后续开展药用野生稻基因组的分离及其功能研究奠定基础㊂4 结论药用野生稻作为我国的主要野生稻物种,因其体内含有大量未知功能的有利基因,近些年得到了较为广泛的研究㊂笔者比较了不同提取野生稻基因组DNA方法,综合各方面因素考量,若只需简单的检测且考虑成本问题,可以选择CTAB提取法㊁CTAB改良方法和尿素提取法,但在使用过程中会用到较毒的有机试剂,提取过程需小心谨慎;如需要高纯度基因组可以选择磁珠法㊁吸附柱法㊁碱裂解法;若考虑安全无毒㊁快速提取及成本可控可以选磁珠法㊁吸附柱法;若样品稀有可以选用CTAB提取法和CTAB改良法㊂通过比较这些方法的优劣势,可以为满足不同试验需要选择高效㊁简便㊁安全无毒㊁低成本的最优DNA提取方法提供了一定理论依据,同时也为指导水稻不同组织部位DNA的提取提供了参考价值,进一步为开发与优化快速提取药用野生稻基因组DNA提供理论指导㊂参考文献[1]董岩,钱长根,张维林,等.药用野生稻体细胞杂交后代对条纹叶枯病的抗性鉴定[J].生物技术通讯,2013,24(5):682-684.[2]杨雅云,张敦宇,陈玲,等.云南药用野生稻对四种水稻主要病害的抗性鉴定[J].植物病理学报,2019,49(1):101-112.[3]杨士杰药用野生稻杂交后代对稻瘟病的抗性[J].湖北农业科学,2017,56(3):415-417.[4]陈玲,张敦宇,陈越,等.云南药用野生稻种质资源的白叶枯病抗性评价[J].南方农业学报,2019,50(7):1417-1425.[5]刘蕊,张欢欢,陈志雄,等.筛选和转化药用野生稻TAC克隆获得耐旱水稻[J].中国农业科学,2014,47(8):1445-1457.[6]苏龙,徐志健,乔卫华,等.广西药用野生稻遗传多样性分析及SSR引物数量对遗传多样性结果的影响研究[J].植物遗传资源学报,2017,18(4):603-610.[7]张霞,景翔,周光才,等.药用野生稻GBSS基因的系统发育及组织特异性表达[J].植物学报,2019,54(3):343-349.[8]何平,疏冕,蔡晓丹,等.栽培稻ˑ药用野生稻种间杂种基因组DNA甲基化的遗传与变异研究[J].华北农学报,2017,32(4):19-31.[9]韩义胜,严小微,唐清杰,等.利用药用野生稻培育耐光氧化和耐荫水稻新种质的研究[J].广东农业科学,2014,41(8):22-25.[10]柯学,殷富有,肖素勤,等.云南药用野生稻的高光效特性[J].中国稻米,2015,21(4):72-76.[11]张大燕,李红梅,李培纲,等.药用野生稻OoLEA1基因的克隆和生物信息学分析[J].分子植物育种,2017,15(5):1597-1602.[12]景翔.药用野生稻中淀粉合成酶基因家族的进化[D].曲阜:曲阜师范大学,2016.[13]郭辉,陈灿,张晓丽,等.广西野生稻耐冷性鉴定与遗传纯合研究[J].西南农业学报,2017,30(6):1245-1250.[14]李培纲,李红梅,张帅,等.药用野生稻ADF基因的克隆及其抗逆性分析[J].华北农学报,2017,32(6):37-44.[15]王玲仙,王波,陈越,等.云南药用野生稻幼穗离体培养研究[J].中国稻米,2020,26(2):49-53.[16]OHTSUBOK,SUZUKIK,HARAGUCHIK,etal.Novelmethodforprepa⁃rationofthetemplateDNAandselectionofprimerstodifferentiatethematerialricecultivarsofricewinebyPCR[J].JBiochemBiophysMeth⁃ods,2008,70(6):1020-1028.[17]李娥贤,殷富有,张敦宇,等.云南药用野生稻高质量染色体DNA的制备[J].作物杂志,2020(5):103-109.[18]ABDEL⁃LATIFA,OSMANG.ComparisonofthreegenomicDNAextrac⁃tionmethodstoobtainhighDNAqualityfrommaize[J].PlantMethods,2017,13:1-9.[19]WENGQ,LIJ,LIUXH,etal.ExtractionoftotalDNAandoptimizationoftheRAPDreactionsysteminDioscoreaoppositaThunb.[J].GenetMolRes,2014,13(1):1339-1347.[20]NARUSHIMAJ,KIMATAS,SOGAK,etal.RapidDNAtemplateprepara⁃tiondirectlyfromaricesamplewithoutpurificationforloop⁃mediatediso⁃thermalamplification(LAMP)ofricegenes[J].BiosciBiotechnolBio⁃chem,2020,84(4):670-677.[21]YUANQB,HUANGYM,WUWB,etal.Redistributionofintracellularandextracellularfree&adsorbedantibioticresistancegenesthroughawastewatertreatmentplantbyanenhancedextracellularDNAextractionmethodwithmagneticbeads[J/OL].EnvironInt,2019,131[2022-03-14].https://doi.org/10.1016/j.envint.2019.104986.[22]TAKAHASHIH,TAKAKURAC,KIMURAB.Aquantitativereal⁃timePCRmethodformonitoringClostridiumbotulinumtypeAinricesamples[J].JFoodProt,2010,73(4):688-694.[23]WANGXF,CHENY,CHENXY,etal.AhighlyintegratedsystemwithrapidDNAextraction,recombinasepolymeraseamplification,andlateralflowbiosensorforon⁃sitedetectionofgeneticallymodifiedcrops[J].AnalChimActa,2020,1109:158-168.[24]YIG,CHOIJH,LEEJH,etal.Rapidandsimpleprocedureforhomoge⁃nizingleaftissuessuitableformini⁃midi⁃scaleDNAextractioninrice[J].PrepBiochemBiotechnol,2005,35(3):257-261.[25]MUTOUC,TANAKAK,ISHIKAWAR.DNAextractionfromriceendo⁃sperm(includingaprotocolforextractionofDNAfromancientseedsam⁃ples)[J].MethodsMolBiol,2014,1099:7-15.[26]BOJANGKP,KUNAA,PUSHPAVALLISNCVL,etal.EvaluationofDNAextractionmethodsformoleculartraceabilityincoldpressed,solventextractedandrefinedgroundnutoils[J].JFoodSciTechnol,2021,58(9):3561-3567.[27]DUANYB,ZHAOFL,CHENHD,etal.AsimplifiedgenomicDNAex⁃tractionprotocolforpre⁃germinationgenotypinginrice[J].GenetMolRes,2015,14(2):6369-6375.[28]SAGIN,MONMAK,IBEA,etal.Comparativeevaluationofthreediffer⁃entextractionmethodsforrice(OryzasativaL.)genomicDNA[J].JAgricFoodChem,2009,57(7):2745-2753.9851卷14期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀毕继安等㊀药用野生稻基因组DNA提取方法比较。
广西八五水稻育种苗头材料抗白叶枯病性鉴定简报
孙恢鸿;朱桂宁;李清标
【期刊名称】《南方农业学报》
【年(卷),期】1996(000)002
【总页数】2页(P97-98)
【作者】孙恢鸿;朱桂宁;李清标
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S511.034
【相关文献】
1.广西野生稻抗白叶枯病多菌系鉴定 [J], 陈成斌;曾华忠;梁云涛;梁世春;徐志健;张烨;黄娟
2.广西常规稻区试品种抗白叶枯病鉴定与分析 [J], 孙恢鸿;农秀美;黄福新;陈永惠;李清标;朱桂宁
3.谈水稻育种高世代材料抗稻瘟性的鉴定 [J], 李明贤
4.利用Xa21基因的PCR标记进行抗白叶枯病水稻育种 [J], 万丙良;杨国才;陈志军;牟同敏;陈其志
5.利用InDel标记鉴定水稻育种材料的籼粳属性 [J], 王林友;张礼霞;勾晓霞;祁永斌;金庆生;王建军
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江西农业学报2010,22(8):81—84A c t a A gr i cul t ur ae J i an铲i普通野生稻杂交后代抗白叶枯病鉴定筛选殷富有,李维蛟,郭怡卿,张敦宇,黄兴奇,程在全+(云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南昆明650223)摘要:为了从野生稻中发掘优异的水稻白叶枯病抗性材料,拓宽栽培稻抗白叶枯病遗传基础,达到控制水稻白叶枯病的目的,对合系35与元江普通野生稻远缘杂交后代不同世代的不同株系材料分年度进行了抗白叶枯病能力的鉴定和分析,并调查了后代材料对水稻白叶枯病的抗病能力,获得了一批高抗和中抗材料.为今后定位高抗白叶枯病基因以及水稻抗病育种提供了依据。
关键词:元江普通野生稻;杂交后代;抗白叶枯病;鉴定中图分类号:$332.2文献标识码:A文章编号:1001—8581(2010)08—0081—04l dent i f i cat i on and Scr e eni ng of R e si st a nc e t o R i ce B a ct er i al B l i ght i nC om m on W nd R i ce H ybr i d O f f spr i ngY I N Fu—you,L I W ei—j i a o,G U O Y i—qi ng,Z H A N G D un—yu,H U A N G X i ng—qi,C H E N G Z ai—quan’(Ins t it ute of B i ot echnol ogy a nd G er m p l as m R e sour c es,Y ur m a n A c ade m y of A gr i cu l t ur al S c i e nc es,K unm i ng650223,Chi na)A b st r act:I n or der t o e x pl o i t excel l ent w il d r i ce r es ou r ces r es i s tant t o r i ce bact eri al bl i s ht(X a m hom onas or yz a e pv.or y zae)a nd a tt a in t he pur pose of contr ol l i ng r i ce bact eri al bl i ght,w e i d e nti f i ed and i nves t i gat ed t he r esi s t an ce t o r i ce bact eri al bli gh t of dif f erent l ines i n dif f erent gener at i ons of“H exi35X Y u肌j i a ng co m//l o n w i ld r i ce”o f f s p r i ng i n dif f erent year s,and obt ai ned som e ri c e m at er i al s w i t h m i d dl e o r hi【gh r esi s t an ce t o r i ce bact eri al bl i ght,w hi ch w i l l pr ovi d e bas i s for t he m appi ng of t he gen e hi ghl y—r es i s t ant t o r i ce bacter i al bli ght a nd r i ce di.s e as e—re si s ta n t br eedi ng i n t he fut ure.K e y w ords:Y uanj i ang com m on w il d r i ce;Hybr i d of f spr i ng;R esi st ance t o r i ce bact eri al bl ight;I dent i f icat ion水稻白叶枯病(X ant hom onas or yzoe.pv.oryzae)最早于1884年在日本福冈县发现…,是仅次于稻瘟病的第二大水稻病害,现已在亚洲、非洲、美洲和澳大利亚等地发生¨。
,该病在周年种植水稻的南亚和东南亚最为严重‘0j。
在中国的发生已有70年以上的历史,20世纪60年代后由于半矮秆、高产、不抗病品种的大范围推广和相应的集约化栽培措施的普及,白叶枯病很快扩展蔓延,其危害也逐渐加重,在中国的许多地方陆续有报道怕叫…。
1976年农业部设立了“全国抗稻瘟病、白叶枯病研究”项目,随后在“全国水稻高产、优质、抗病育种攻关”项目中,明确了抗稻瘟病和白叶枯病为品种改良的主攻目标之一。
水稻白叶枯病病原物为黄单胞菌水稻致病变种细菌,属于黄单胞菌属(X an t hom onas)…J。
水稻感病后,叶片干枯,瘪粒增多,米质松脆,千粒重降低,一般减产10%-30%,严重时可减产50%以上。
此病在育种上被高度地重视,对其致病机理及应答机理的研究也在不断深入。
长期的生产实践证明,水稻抗性品种的选育和利用是防治水稻病害最经济有效的措施之一¨2”j。
选育抗病品种是防治水稻白叶枯病的一个经济、省工、收效大的重要措施,而且也是该病综合防治的基础,因此寻找抗性材料为育种提供抗源非常重要。
我国的抗病育种始于20世纪60年代,也着重于品种的鉴定和筛选。
而栽培水稻中抗白叶枯病基因数量有限,抗病能力也有限,需要用栽培稻以外的抗病基因来拓宽抗病遗传基础。
野生稻资源在多变的环境中经历漫长岁月的自然演化和人工培育与选择,形成了丰富多彩、各具特点的遗传属性,蕴藏着各色各样的宝贵基因,是人们选育高产、优质、多抗新品种和开展遗传进化、栽培、生理以及相关科学研究的材料基础H…。
从野生稻中发掘优异的水稻白叶枯病抗性材料一直是国内外研究者的重要研究内容。
由于普通野生稻是栽培稻的近缘种,只要利用常规杂交就可能将野生稻的优异抗性导入栽培稻。
我们应努力发掘其潜在的利用价值,筛选抗源,为水稻抗病育种提供具有野生稻血缘、遗传基础广泛、农艺性状优良的优异抗源,并提高野生稻资源利用效果,为抗病育种创新利用提供依据。
本文详细地调查研究了合系35与元江普通野生稻杂交后代材料对水稻白叶枯病的抗病能力,旨在为普通野生稻抗白叶枯病种质资源用于水稻育种提供参考。
l材料与方法1.1材料收稿日期:2010—05一17基金项目:云南省科技攻关项日(2006N G34);云南省重点基金项目(20080304)。
作者简介:殷富有(1976一),云南陆良人.助理研究员,主要从事水稻遗传育种研究。
+通讯作者:程在全。
82江西农业学报22卷1.1.1水稻材料栽培稻亲本合系35及其与元江普通野生稻杂交后代B E ,F 。
材料550份。
1.1.2供试菌株水稻白叶枯病菌株采用中国强致病小种(C 1)、云南本地强致病小种(Y 8)及kl 本致病性小种(讯17)3个菌株。
1.2试验地情况2006年5月~2008年10月在云南省玉溪市元江县因远镇(E 102001’,N 23。
61’)进行试验,试验地海拔1600m ,年平均气温16℃。
该试验地常年种植水稻,土壤肥力均匀,土地平整,且在该稻区常年都有白叶枯病发生,适合做白叶枯病鉴定试验。
1.3种植与管理水稻采用育苗移栽方法,秧龄40d 进行移栽,每个株系种植3行,单苗移栽,每行10苗,株距10cm ,行距20cm 。
试验田间管理与当地大田管理一致。
1.4接种方法及分级标准自然诱发和人工接种方法结合。
人工接种是在2006~2008年,于每年的5月开始播种,6月份移栽,8月份在水稻大部分处在孕穗期时,选择在晴天下午,用无菌水将菌液浓度调节至6亿~9亿个/m L ,用沾了菌液的剪刀剪去水稻剑叶的1~2cm 。
每株剪5片叶,每菌株剪5株。
于接种后21d 进行病情调查。
自然诱发是在待鉴定水稻材料周围种植一些感病材料,在田间依靠自然发病,与接种后的待鉴定水稻材料一起调查抗性表型。
病情分级采用全国稻白叶枯病协作组制定的鉴定标准¨…,将病级分为6级。
0级,剪口处无病斑,高抗;1级,剪口处有很小的病斑,很少下伸,长度不超过2am ,抗病;2级,病斑向下延伸2cm 以上,不超过叶长的1/4,中抗;3级,病斑占叶长的1/4--"1/2,中感;4级,病斑占口t -长的1/2—3/4,感病;5级,病斑超过叶长的3/4,高感。
病级平均数=∑(各级病叶数×相应的级数)/总叶数2结果与分析2.1杂交后代的抗性在合系35与元江普通野生稻杂交后代B C :F 。
的550份后代材料中,对3个菌株都为高抗的材料有2份(表1),达到抗病的36份,中抗的49份,中感的49份,感病的29份,高感的5份。
其余的380份材料对3个菌株的抗瘸l 生表型不一致,有的只对2个菌株具有抗疴降,有的对3个菌株具有不同的抗病性(表1)。
对高抗材料与中抗材料及高感材料从外部症状上作了详细的观察,得到了好的比较结果(图1)。
表1杂交后代对水稻白叶枯病的抗性图1不同水稻材料的抗性表型8期殷富有等:普通野生稻杂交后代抗白叶枯病鉴定筛选832.2杂交后代材料与亲本的抗性比较综合分析亲本合系35及元江普通野生稻对白叶枯病的抗性程度与杂交后代材料的抗性程度,得出合系35对这3个菌系的抗性达到中抗(病级1.6-2.0)(表2)。
通过分析对3个菌株具有共同抗性表型的杂交后代材料(170份)与亲本合系35(中抗)比较(表2),有22.34%的材料在抗性上超过栽培稻亲本的抗性,这些材料可能携带了1个或多个来自普通野生稻的抗白叶枯病基因;28.82%的材料与栽培稻亲本具有相同的抗性,这些材料可能不带来自普通野生稻的抗白叶枯病基因;48.82%的抗性比栽培稻亲本的差,造成这些材料不抗白叶枯病的原因可能是其不带来自普通野生稻的抗性基因,又由于杂交后代的基因交换重组也不带有来自栽培稻携带的中抗白叶枯病基因。
表2杂交后代材料与亲本的抗性2.3致病菌株的致病性3个致病菌株对550份杂交后代材料的致病性调查结果表明,不同菌株对不同材料的致病性表型/f:同,在各个病害等级所表现的份数也不同。
杂交后代材料中的抗性表型份数从数值E分析,中抗材料与中感材料占有绝大部分,杂交后代材料中对C l、Y8、,174173种致病菌株中抗的表型观察值分别为163、132、143份,对C l、Y8、盯4173种致病菌株中感的表型观察值分别为192、160、199份;对c1、Y8、T/4173种致病菌株高抗的杂交后代材料较少,对C1、Y8、174173种致病菌株高抗的表型观察值分别为9、19、15份(表3)。