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超高效液相色谱串联质谱法检测晨尿中儿茶酚胺及其代谢产物的价值

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作者简介:闫亚娟,女,技师,主要从事临床生化研究.　△　通信作者,EＧmail:lunlmqd＠１６３．com.

本文引用格式:闫亚娟,黄猛,张丹,等．超高效液相色谱串联质谱法检测晨尿中儿茶酚胺及其代谢产物的价值[J]．国际检验医学杂志,２０２１,４２(１０):１２２８Ｇ１２３２．􀅰论 著􀅰

超高效液相色谱串联质谱法检测晨尿中

儿茶酚胺及其代谢产物的价值

闫亚娟１,黄　猛２,张　丹２,刘慧琳２,伦立民２△１．青岛大学医学部,山东青岛２６６０００;２．青岛大学附属医院检验科,山东青岛２６６０００

摘　要:目的　建立一种稳定、灵敏、可靠且可以同时检测尿儿茶酚胺及其代谢产物的方法.方法　采用

超高效液相色谱串联质谱法(UPLCＧMS/MS)检测晨尿标本中儿茶酚胺及其代谢产物.采用固相萃取的前处

理方法,对液相色谱条件及质谱条件进行优化,并对该方法的检测限、定量下限、线性、精密度、准确度和基质效

应及稳定性进行性能验证.检测１００例体检健康者晨尿及其中２０例体检健康者２４h尿液,根据肌酐检测值对

稀释差异进行归一化,考察晨尿与２４h尿液收集这两种不同采样方法之间检测儿茶酚及其代谢产物的相关性,

并建立了晨尿检测６种分析物的参考区间.结果　６种分析物在相应的浓度范围内均线性关系良好,精密度、

准确度、基质效应均＜１０％,室温放置２４h、４℃放置２４h、４℃放置４８h及—８０℃放置７d稳定性均较好,变

化≤６．２％.晨尿与２４h尿液标本检测结果呈正相关(r＝０．９３~０．９７,P＜０．０００１),６种分析物的参考区间去

甲肾上腺素为２．６~１４０．４μg/gCr,肾上腺素为０．３~３７．２μg/gCr,多巴胺为４３．４~５６１．８μg/gCr,３Ｇ甲氧酪

胺为１８．０~１６５．７μg/gCr,甲氧基去甲肾上腺素为１５．１~２４１．５μg/gCr,甲氧基肾上腺素为６．８~１９２．０

μg/gCr.结论　建立了一种方便快速、灵敏、特异的UPLCＧMS/MS,一次进样可同时检测晨尿中６种儿茶酚

胺及其代谢产物,可为儿茶酚胺的常规检测及临床应用提供一种简单、可靠的新手段.

关键词:液相色谱串联质谱法;　儿茶酚胺;　甲氧基肾上腺素;　３Ｇ甲氧酪胺DOI:１０．３９６９/j．issn．１６７３Ｇ４１３０．２０２１．１０．０１７中图法分类号:R４４６．９

文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０２１)１０Ｇ１２２８Ｇ０６文献标志码:A

Determinationvalueofcatecholaminesandtheirmetabolitesin

morningurinebyultrahighperformanceliquidchromatographyＧtandemmassspectrometry

YANYajuan１,HUANGMeng２,ZHANGDan２,LIUHuilin２,LUNLimin２△１．MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao,Shandong２６６０００,China;２．Department

ofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong２６６０００,ChinaAbstract:Objective　Toestablishastable,sensitiveandreliablemethodforthedetectionofurinarycateＧ

cholaminesandtheirmetabolites．Methods　ThecatecholaminesandtheirmetabolitesinmorningurinesamＧ

plesweredetectedbyultrahighperformanceliquidchromatographyＧtandemmassspectrometry(UPLCＧMS/

MS)．Solidphaseextractionwasusedasthepretreatmentmethod,andoptimizedtheconditionsofliquidchroＧ

matographyandmassspectrometry,andverifiedtheperformanceofthemethod,includinglimitofdetection,

limitofquantitation,linearity,precision,accuracy,matrixeffectandstability．Morningurineof１００apparentlyhealthysubjectsand２４hurineof２０casesofthemweremeasured．Thedifferenceofdilutionwasnormalized

accordingtothecreatininemeasuredvalue．Thecorrelationbetweentheresultsof６kindsofanalytesdetected

bymorningurineand２４hurinewereanalyzed,thenestablishedthereferenceintervalof６kindsofanalytes

detectedbymorningurine．Results　Withinthecorrespondingconcentrationrange,thelinearrelationshipof

the６kindsofanalyteswasgood,theprecision,accuracyandmatrixeffectwerealllessthan１０％．Thestabilityoftheanalyteswasgoodwhenplacedatroomtemperaturefor２４h,at４℃for２４h,at４℃for４８handat

－８０℃for７d,withthechangeequalorlessthan６．２％．Theresultsofmorningurineand２４hurinesamples

significantlycorrelated(r＝０．９３—０．９７,P＜０．０００１)．ThereferenceintervalofcatecholamineswereasfolＧ

lows,noradrenaline２．６－１４０．４μg/gCr,adrenaline０．３—３７．２μg/gCr,dopamine４３．４—５６１．８μg/gCr,３Ｇ

methoxytyramine１８．０—１６５．７μg/gCr,normetanephrine１５．１—２４１．５μg/gCr,matanephrine６．８—１９２．０􀅰８２２１􀅰国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期　IntJLabMed,May２０２１,Vol．４２,No．１０μg/gCr．Conclusion　Aconvenient,rapidandsensitiveUPLCＧMS/MSmethodforthedeterminationof６

kindsofcatecholaminesandtheirmetabolitesisestablished,whichisexpectedtoprovideasimple,convenient,

accurateandsensitivenewmethodfortheroutinedetectionandclinicalapplicationofcatecholamines．

Keywords:liquidchromatographyＧtandemmassspectrometry;　catecholamines;　metanephrine;　３Ｇ

methoxytyramine

尿液儿茶酚胺及其代谢产物的检测对嗜铬细胞

瘤的诊断具有重要意义[１Ｇ２].近年来,国内外已建立

了多种液相色谱串联质谱法(LCＧMS/MS)用于定量

检测尿液中的儿茶酚胺及其代谢产物[３Ｇ６].这些方法

大多留取患者２４h的尿液进行检测,存在诸多不足之

处,如标本用量多、检测耗时长、标本前处理操作复杂

等,限制了儿茶酚胺及其代谢产物检测的临床应用.

因此,本研究旨在建立一种快速且可同时检测尿液儿

茶酚胺及其代谢产物的超高效液相色谱串联质谱法(UPLCＧMS/MS),采用简单、特异的微量尿样固相萃

取,一次进样同时检测尿液中多种儿茶酚胺及其代谢

产物,并建立健康成年人群尿液儿茶酚胺及其代谢产

物的参考区间,为临床嗜铬细胞瘤的诊断提供帮助.１　资料与方法１．１　一般资料　选择青岛大学附属医院体检健康者１００例为研究对象,其中男５１例,年龄１９~６５岁;女４９例,年龄２２~５２岁.纳入研究对象均同时满足以

下条件:(１)２０２０年１—７月来青岛大学附属医院健康

体检的１８~６５岁成人;(２)经体格检查未见异常;(３)

血常规、尿常规、血清生化检测均未见异常;(４)影像

学检查肾上腺未见异常.纳入研究对象排除具有以

下任意一项条件者:(１)有严重心、肺、肝、肾等器质性

疾病,身体状况差;(２)不愿意参与本研究,拒绝签署

知情同意书;(３)既往或目前患有或疑似患有肾上腺

疾病.本研究获得青岛大学附属医院医学伦理委员

会的批准,所有研究对象均自愿参与本研究,并签署

知情同意书.１．２　仪器与试剂　AgilentTechnologies１２９０InfinＧ

ityⅡ超高效液相色谱仪(安捷伦,美国);QTRAP

５５００三重四极杆质谱仪(ABSCIEX,美国);色谱柱

(AgilentPursuitPFP２×１５０mm);PWCX９６孔固

相萃取板.试剂:标准品肾上腺素(E)盐酸盐、去甲肾

上腺素(NE)盐酸盐、多巴胺(DA)盐酸盐、甲氧基肾

上腺素(MN)盐酸盐、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)盐

酸盐、３Ｇ甲氧酪胺(３ＧMT)盐酸盐、高香草酸(HVA)、

香草扁桃酸(VMA)及其对应的同位素内标EＧd３、

NEＧd６、DAＧd４、MNＧd３、NMNＧd３、３ＧMTＧd４、HVAＧ

d３、VMAＧd３(Sigma,美国),醋酸铵(北京化工,中

国),乙腈(色谱级,anaqua,美国),甲醇(色谱级,

anaqua,美国),实验用水为超纯水(１８．２MΩ􀅰cm,２５

℃),由BureWATER超纯水仪制备.尿肌酐检测采用日立７１８０全自动生化分析仪,试剂盒购自北京利

得曼生化股份有限公司.１．３　方法１．３．１　工作液制备及质控品　采用０．２mol/L的盐

酸溶液配制１０μg/mL的儿茶酚胺及其代谢产物的储

备液,并配制成不同浓度的标准品,浓度范围为０．５~

１０００．０ng/mL.

１．３．２　标本采集　嘱所有研究对象在研究过程中不

食用或饮用任何富含儿茶酚胺的食物及饮料,不服用

任何药物,不进行剧烈运动,并保持日常生活方式,嘱

其体检前一天晚上８点后禁食、禁饮,体检当天清晨６:００采集晨尿,并选择其中２０例志愿者采集２４h尿

液,采用６mmol/L盐酸防腐,标本于—８０℃冰箱

保存.１．３．３　标本前处理　将标准品、质控品及尿液标本

取出放置至室温,并混匀,将９６孔固相萃取板预先用

甲醇和水各１mL进行活化和平衡.(１)患者标本:采

用０．２２μm尼龙滤膜过滤得到尿滤液,取４８０μL,加

入２０μL内标工作液和１mL０．５mol/L的乙酸铵溶

液,涡旋５s.(２)标准品及质控品:取２０μL不同浓

度的标准品和质控品,加入４６０μL超纯水,混匀后分

别加入２０μL混合内标工作液和１mL０．５mol/L的

乙酸铵溶液,涡旋５s.将尿液标本、标准品及质控品

分别加入９６孔固相萃取板中,之后分别用１mL２０

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超高效液相色谱串联质谱法同时检测复杂基质中四环素类抗生素及其代谢产物

超高效液相色谱串联质谱法同时检测复杂基质中四环素类抗生素及其代谢产物

２０１３，３２（１１）：２２９３—２３０１　农业环境科学学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｇｒｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０１３年１１月　

超高效液相色谱串联质谱法同时检测复杂基质中　

四环素类抗生素及其代谢产物　

吴晓凤　一，郑嘉熹１　７魏源送　，赵鑫　，仲维科　

（１．中国科学院生态环境研究中心，北京１０００８５；２．中国检验检疫科学研究院，北京１００１２３；３．中国环境监测总站，北京１０００１２）　

摘要：为同时检测复杂基质中（由猪粪和蘑菇渣混合而成的堆肥原料）３种四环素类抗生素（四环素Ｔｃ、土霉素ＯＴＣ和金霉素　ＣＴＣ）及其代谢产物，建立了超高效液相色谱串联质谱检测方法（ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ）。该方法同时采用ｐＨ值＝４的Ｎａ２ＥＤＴＡ－　ＭｃＩ１ｖａｉｎｅ缓冲溶液和乙腈为提取溶液，经过固相萃取净化后，以乙腈和０．１％的甲酸水溶液为流动相，采用超高效液相色谱柱进行　分离，在电喷雾正离子模式下，用四极杆串联质谱仪进行定性和定量分析。３种四环素类抗生素及其代谢产物均在７　ｍｉｎ内完成分　离，总共分析时间为１２　ｍｉｎ。在０－６　ｍｇ・ｋｇ　ＤＷ（Ｄｒｙ　ｗｅｉｇｈｔ）浓度范围内，３种四环素类抗生素及其代谢产物的标准曲线线性良好，　线性相关系数Ｒｚ均大于０．９９６　０，重现ｌ生也较好（ｎ＝ｌ１，相对标准偏差均小于１５％）。在３个加标水平０．２　ｍｇ・ｋｇ～ＤＷ、１　ｍｇ‘ｋｇ　ＤＷ　和４　ｍｇ・ｋｇ　ＤＷ下，ＴＣ、ＯＴＣ、ＣＴＣ的回收率分别为７１％一８９％、６６％～９４％和６６％－８４％；去甲基金霉素（ＤＭＣＴＣ）的回收率为５２％－　６４％；差向异构产物的回收率在３２％～５１％之间；脱水产物以及差向脱水产物的回收率均低于３０％。３种四环素类抗生素及其代谢　产物的检出限和定量限分别在１．６６８～１７．２７０　Ｉｘｇ・ｋｇ　和５．５６１—４５．９１８　ｇ・ｋｇ　范围内，表明该方法具有较高的灵敏度。对北京市某　露天堆肥场中的样品进行测定发现，ＴＣ、ＯＴＣ、ＣＴＣ的浓度分别为０．４、１．６、２．９　ｍｇ・ｋｇ～，检测到的代谢产物主要为相应的差向异构　体，其中差向金霉素（ＥＣＴＣ）的浓度最高，达到２．７　ｍｇ・ｋｇ一，和母体的含量水平比较接近，其他代谢产物也有不同程度的检出。　关键词：四环素类抗生素；代谢产物；超高效液相色谱串联质谱　中图分类号：Ｘ８３３　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７２—２０４３（２０１３）１１—２２９３－０９　ｄｏｉ：ｌＯ．１１６５４￣ａｅｓ．２０１３．１１．１１．０２７　

液相色谱-串联质谱法测定水产品中酰胺醇类药物及其代谢物残留

液相色谱-串联质谱法测定水产品中酰胺醇类药物及其代谢物残留

液相色谱-串联质谱法测定水产品中酰胺醇类药物及其代谢物残留

目的：基于标准GB31658.20-2022，优化液质测定水产品中酰胺醇类药物的前处理步骤，补充该标准的适用范围。方法：搅碎混匀的鱼肉试样，经过不同提取液、净化液以及定容液，得到18组实验结果，内标法定量，确定最佳组合，进行方法验证。结果：在优化前处理条件后氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的线性范围为0.10～100ng/mL，相关系数均大于0.998，方法的回收率为83.1%～103.6%，相对标准偏差在0.66%～4.89%。结论：本方法可为标准GB31658.20-2022的适用范围补充提供参考依据，适用于水产品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定。

关键词：酰胺醇类药物；液相色谱串联质谱；水产品；前处理优化

酰胺醇类药物又称氯霉素类抗生素，是一类在兽医临床上用于治疗畜禽以及水产动物细菌性疾病的广谱抗生素，主要包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考。氯霉素和甲砜霉素在兽医临床抗感染的治疗中发挥了重要作用，但近年来，随着公众对其潜在毒性，残留和耐药性的广泛关注，许多国家陆续禁止了它们在兽医临床上的使用，以及禁用于食源性动物，氟苯尼考逐渐成为氯霉素和甲砜霉素的替代品[1,2]。酰胺醇类药物常见的检验方法有ELISA，HPLC，GC，GC-MS[3]，LC-MS/MS等等，ELISA具有半定量，假阳性概率，LC，GC无法提供结构确证，干扰物质较多，定性不够准确，GC-MS，GC-MS/MS需衍生，前处理较繁琐，进样时间长，定量不够准确，LC-MS/MS快速，简便，定性定量准确，灵敏度高。

氟苯尼考在动物体内有多种代谢产物，但大部分以氟苯尼考和氟苯尼考胺的形式存在，因此部分国家规定氟苯尼考的标志残留物为氟苯尼考和氟苯尼考胺之和[4,5]。氟苯尼考胺是氟苯尼考在动物体内的代谢物，农业部235号公告将氟苯尼考胺作为标志残留物计算氟苯尼考残留量，氟苯尼考残留量是以氟苯尼考胺和氟苯尼考残留总量计在欧盟(EU)No37/2010号法规中也有规定，另外，氟苯尼考残留标志物在GB31650中规定为氟苯尼考和氟苯尼考胺之和。

超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚的含量

超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚的含量

超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚的含量

肖永华; 许开冰; 王胜; 毛翔; 卢圆圆

【期刊名称】《《理化检验-化学分册》》

【年(卷),期】2019(055)010

【总页数】6页(P1151-1156)

【关键词】超高效液相色谱-串联质谱法; 硫酸吲哚酚; 硫酸对甲酚; 人尿

【作 者】肖永华; 许开冰; 王胜; 毛翔; 卢圆圆

【作者单位】武汉市疾病预防控制中心 武汉 430022; 华中科技大学同济医学院附属同济医院 武汉 430030

【正文语种】中 文

【中图分类】O657.63

硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚分别为色氨酸和酪氨酸在肠道细菌作用下的代谢产物。食物中的色氨酸经大肠埃希菌分解产生吲哚,吲哚经过门静脉进入肝脏经羟化、硫酸化过程,最终生成硫酸吲哚酚[1-2];肠道厌氧菌将食物中的酪氨酸转变为4-羟基苯乙酸,4-羟基苯乙酸脱羧成为对甲酚,大部分对甲酚经肠道黏膜吸收,在肠道上皮细胞磺基转移酶的作用下转化为硫酸对甲酚。有研究表明,硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚具有肾脏毒性和心血管毒性,能促进心肌细胞凋亡,加重动脉钙化使动脉壁变厚以及心室肥大[3-7],同时,心血管疾病是慢性肾病患者最主要的影响因素之一[8]。硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚还能促进肾间质细胞向成纤维细胞转化,引起肾脏的纤维化,属于尿毒症毒素[9-11]。当人体肾功能出现障碍时,硫酸对甲酚和硫酸吲哚酚不能有效排除体外,导致在人体内蓄积,从而对人体带来毒副作用。我国慢性肾病的发病率高达11%,发病率和血液透析人数呈逐年上升趋势[12],在慢性肾病患者的队列研究中,发现游离的硫酸对甲酚是慢性肾病患者的一个重要的死亡率预测因子[13]。

目前,研究硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚的生物样本主要为血清和血浆[14-15],对尿液中硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚的研究较少。同时,研究对象主要为肾功能异常的患者,对正常人群研究较少,在国内仅有初启江等[16]研究了正常人血清及尿样中硫酸吲哚酚的含量的分析方法,但是对儿童和孕妇尿样中硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚的研究还未见报道。尿样相对于血液样本更易获得,在需要大批量样本时具有明显的成本优势。本工作通过研究武汉市学龄儿童和孕妇尿样中硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚的分布情况,弥补了目前在这一领域的研究空白,可为评价学龄儿童和孕妇肾功能情况提供可靠的数据支持。

儿茶酚胺测定方法

儿茶酚胺测定方法

儿茶酚胺测定方法

儿茶酚胺(也称为生物胺)是一类含有芳香胺结构的有机化合物，包括组胺、色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺等。它们在人体内起着重要的生理功能，包括调节血压、控制神经传递、参与免疫反应等。因此，准确测量儿茶酚胺的含量对于临床诊断、药物研发以及食品安全等方面具有重要意义。

目前，有多种方法可以用来测定儿茶酚胺的含量，其中最常用的方法包括高效液相色谱法、气相色谱法和电化学法。下面将详细介绍这些方法的原理和优缺点。

1. 高效液相色谱法(HPLC)是测定儿茶酚胺含量最常用的方法之一。它基于样品中的儿茶酚胺在液相中的化学行为进行分离和检测。首先，样品经过合适的前处理步骤，如固相萃取、酸解等，以提取出儿茶酚胺。然后，将提取液注入高效液相色谱仪中，通过固定相的相互作用与待测儿茶酚胺发生分离。最后，使用紫外光检测器或电化学检测器在特定波长下进行检测和定量。这种方法的优点是分离效果好、测量灵敏度高，具有较高的选择性和准确性。然而，HPLC方法需要复杂的仪器装置和操作技术，在分析过程中可能会受到杂质的干扰。

2. 气相色谱法(GC)是另一种常用的儿茶酚胺测定方法。与HPLC类似，样品需要经过前处理步骤来提取儿茶酚胺。然后，将提取液注入气相色谱仪中，通过气相载气流动相与待测儿茶酚胺发生分离。最后，使用火焰离子化检测器或电子捕获检测器进行检测和定量。气相色谱法的优点是分离效果好，分析速度快，且对样品矩阵的干扰较小。然而，这种方法对于热稳定性较差的儿茶酚胺样品可能会导致峰形变形或降解，同时需要较高的操作技术水平。

3. 电化学法是一种测定儿茶酚胺含量的简便方法。基于儿茶酚胺的电化学活性，在适当的电极上触发与儿茶酚胺的氧化或还原反应，并利用产生的电流或电势信号进行测定和定量。电化学法的优点是样品前处理简单，测量速度快，操作简便。同时，电化学法对儿茶酚胺的测量灵敏度较高，且具有良好的选择性。然而，由于儿茶酚胺具有不同的氧化还原性质，在不同pH值和电极材料条件下可能会出现不同的电化学行为，因此需要根据具体的分析对象选择适当的电极和工作条件。