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实验方案设计人：陈龙1．蛋白酶产生菌的分离1. 1 实验材料菌源：酱香型大曲1. 2 培养基的配制细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-25g、水1000ml；称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。
溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。
调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。
反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。
分装、包扎、灭菌。
霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1000ml；量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。
分装、包扎、灭菌。
产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.0g，Na2CO3 0.1g，自来水100ml PH 9.0（灭菌前）。
pH7．0。
配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。
选择培养基：豆粕粉10．0 g，琼脂15．0 g，蒸馏水1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30 min。
固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。
筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。
1. 3 试剂和溶液1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃珠。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行：1.样品收集：从环境样品（如土壤、水样、发酵物等）中收集样品，注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。
2.分离菌株： a. 样品处理：将样品进行适当的稀释处理，以获得适量的单菌落。
b. 培养基选择：根据目标酶的特性，选择合适的培养基进行菌株分离。
常用的培养基有LB（大肠杆菌培养基）、TSA（琼脂糖营养平板培养基）等。
也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。
c. 接种和分离：将处理后的样品接种在选定的培养基上，并进行营养和环境条件的适当调整。
通过稀释分离法，将单菌落分离至不同的培养皿中，得到纯培养的菌株。
3.酶活性测定： a. 初步筛选：将分离的菌株进行初步筛选，通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。
b. 液体培养：将筛选出的菌株进行液体培养，收集培养物用于后续的酶活性测定。
c. 酶活性测定：通过适当的酶活性测定方法（如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等）来评估菌株的酶活性。
4.酶产量测定： a. 最优菌株筛选：根据酶活性测定结果，选择酶活性较高的菌株。
b. 酶产量测定：对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验，通过酶活性和菌体生长曲线的测定，估计菌株的酶产量。
5.菌株鉴定： a. 形态学特征：观察菌落的形态学特征，如形状、颜色、质地等。
b. 生理生化特性：进行生理生化测试，包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。
c. 分子生物学鉴定：通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因，进行菌株的分子鉴定，并与已知菌株进行比对。
这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。
根据筛选结果，选择高酶活性和高酶产量的菌株，可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。
在实践中，根据具体实验条件和要求，可能需要进行适当的优化和调整。
腐乳中毛霉的分离筛选及工业育种摘要：对自然界分离纯化工业生产腐乳用毛霉技术进行了综述，并概括了工业发酵中毛霉种子的扩培及菌种保质防衰退的方法，为工业生产腐乳提供了理论基础。
关键词：腐乳毛霉，分离纯化，工业育种，菌种保藏Fermented bean curd of mucor separation screening andbreeding industryAbstract:The nature purification industrial production fermented bean curd with mucor technology were summarized, and generalizes the industrial fermentation medium wool mildew seed expansion of the culture and culture quality and prevent the decline of the methods for industrial production of fermented bean curd provides a theoretical basis. Keywords:fermented bean curd mucor, separation and purification, industrial breeding, culture collection.0前言腐乳具有很好的营养功能,富含有机酸、醇、酯等风味物质；含有大量水解蛋白质、游离氨基酸、游离脂肪、碳水化合物、硫胺素、核黄素、烟酸、钙、磷等营养成分,不含胆固醇。
其中蛋白质含量高达12%-22%,而且18种氨酸齐全。
腐乳生产历史悠久,依据生产使用菌种不同可分为细菌型、根霉型和毛霉型。
目前,工业生产中运用最多的是毛霉,主要因其具有菌丛细长柔软,能包裹豆坯形成块状完整的腐乳;其酶系丰富,主要含有内肽酶和端肽酶的复合酶,水解蛋白质无苦味,且无毒无害、不产生怪味和异色等。
实验⼀腐乳产蛋⽩酶菌株的筛选1实验⼀腐乳产蛋⽩酶菌株的分离⼀、实验⽬的与要求了解涂布分离和平板划线法从⾷物中分离⾷源性微⽣物的原理和⽅法，并熟练掌握该操作⽅法。
⼆、实验原理微⽣物是蛋⽩酶的最佳来源，与动物和植物相⽐，微⽣物作为蛋⽩酶的来源具有更多⽣理⽣化上的优越性。
微⽣物来源的蛋⽩酶都是胞外酶，易于分离纯化，更重要的是微⽣物易于培养和发酵，有⼴泛的⽣物化学多样性和遗传操作的感受性。
通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋⽩酶菌株进⾏分离。
稀释涂布平板法是⼀种将菌体按⽐例制备成若⼲个稀释度，再分别经涂棒涂布培养⽽进⾏微⽣物分离纯化的⽅法；平板划线分离法是指把混杂在⼀起的微⽣物或同⼀微⽣物群体中的不同细胞⽤接种环在平板培养基表⾯通过分区划线稀释⽽得到较多独⽴分布的单个细胞，经培养后⽣长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微⽣物的“纯种”。
有时这种单菌落并⾮都由单个细胞繁殖⽽来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微⽣物样品在固体培养基表⾯多次作“由点到线”稀释⽽达到分离⽬的的。
根据透明圈的⼤⼩来筛选⽬的菌株，透明圈越⼤的菌具有较强的产酶能⼒。
对分离到的菌株进⾏纯化，得到⾼产蛋⽩酶菌株。
三、试验材料1、材料与试剂⾖腐乳：市购⾖腐乳2、主要仪器与设备⽆菌操作箱、恒温⽔浴锅、⽣化培养箱、⾼压灭菌锅、振荡培养箱四、实验步骤与⽅法1、培养基的制备可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋⽩1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性配制⽅法：称取酪蛋⽩1.0g，先⽤少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏⽔，在沸⽔浴中加热并搅拌，⾄完全溶解，补⾜⽔量⾄100mL，加⼊其他成分，调整pH，灭菌备⽤。
2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选⼀种⽅法进⾏操作）（1）稀释法分离：采⽤⽆菌⽔，10倍梯度稀释⾖腐乳的菌悬液到10-8，吸取10-6到10-8梯度（按照这三个梯度涂布，前两个组基本都没有菌⽣长，是否后⾯的实验考虑⽤较⾼浓度的梯度涂布？）的菌悬液各1mL，注⼊初筛培养基平板中，每个梯度做2个平⾏平板，涂布均匀。
实验八毛霉的分离和豆腐乳的生产一、实验目的1、学习毛霉的分离和纯化方法。
2、掌握豆腐乳发酵的工艺过程。
二、实验原理豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成。
民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。
豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间后发酵中与淹坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸，与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。
三、试剂与器材3.1菌种：毛霉斜面菌种。
3.2 培养基（料）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），无，菌水、豆腐坯、红曲米、面曲、甜酒酿、白酒、黄酒、食盐。
3.3仪器和器具培养皿、500mL三角瓶、接种针、小笼格、喷枪、小刀、带盖广口玻瓶、显微镜、恒温培养箱。
四、实验内容4.1毛霉的分离：配制培养基→毛霉分离→观察菌落→显微镜检。
4.2豆腐乳的制备悬液制备→接种孢子→培养与晾花→装瓶与压坯→装坛发酵→感官鉴定五、实验步骤5.1毛霉的分离5.1.1配制培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。
经配制、灭菌后倒平板备用。
5.1.2 毛霉的分离从长满毛霉菌丝的豆腐坯上取小块于5mL无菌水中，振摇，制成孢子悬液，用接种环取该孢子悬液在PDA平板表面作划线分离，于20℃培养1～2d，以获取单菌落。
5.1.3 初步鉴定5.1.3.1菌落观察：呈白色棉絮状，菌丝发达。
5.1.3.2显微镜检：于载玻片上加1滴石碳酸液，用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝于载玻片上，轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、梗的着生情况。
若无假根和匍匐菌丝、或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。
5.2 豆腐乳的制备5.2.1 悬液制备5.2.1.1毛霉菌种的扩繁将毛霉菌种接入斜面培养基，于25℃培养2d；将斜面菌种转接到种子培养基中，于同样温度下培养至菌丝和孢子生长旺盛，备用。
高产蛋白酶菌株的分离、筛选及鉴定王伟;王世英;李佳;朱宝成【摘要】为了降解豆粕中的大分子蛋白为大豆肽,利用酪蛋白平板法作为筛选模型,从土壤中分离和筛选高产蛋白酶的菌株,选取水解圈直径与菌落直径比值较大的菌株液体发酵后进行蛋白酶活力和大豆肽转化率的测定,结果得到1株蛋白酶活力和大豆肽转化率较高的菌株B1,其酶活力达到111.8 U/mL,大豆肽转化率达到37.2％.对该菌株进行形态观察和生理生化特征分析,初步将其鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.).【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2014(041)007【总页数】4页(P146-148,161)【关键词】豆粕;筛选;鉴定;蛋白酶活力;大豆肽转化率【作者】王伟;王世英;李佳;朱宝成【作者单位】河北农业大学生命科学学院,河北保定 071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定 071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定 071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定 071001【正文语种】中文【中图分类】Q93.331近年来，植物蛋白质资源的开发利用得到了蓬勃发展。
大豆肽是大豆蛋白经过水解后得到的多种肽的混合物，因其丰富的营养价值以及多功能的生理作用而引起了广泛关注。
微生物发酵豆粕是利用菌株在发酵过程中分泌的蛋白酶使大豆蛋白被分解成多肽或小肽分子、游离氨基酸和未知生长因子（UGF）等物质，同时能消减抗营养因子的一些作用，使其易被畜禽尤其是幼龄动物消化吸收，提高了饲料的利用率[1]。
李丽立等[2]研究表明，饲喂肽较饲喂游离氨基酸能显著提高氮沉积；饲喂小肽与灌注小肽能显著提高能量和钙的消化率。
李祖华等[3]研究发现，在高比例鱼粉的鳗鱼饲料中，大豆多肽可以等量替代3%～5%的红鱼粉，不仅能获得较好的饲料效率，同时也能获得较好的经济效益。
特性优良的发酵菌株的获得则是进行豆粕发酵的前提，其功能特性和生长特性对于豆粕发酵的成功是非常必要的。
产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
浅析腐乳毛霉菌种的选育及产酶条件
谢小本
【期刊名称】《现代食品》
【年(卷),期】2024(30)6
【摘要】本文分析了腐乳毛霉菌种的选育及产酶条件,提出了提高腐乳毛霉菌种选育及产酶质量的措施,旨在为腐乳产业提供科学的技术支持,促进传统腐乳的工业化发展。
【总页数】3页(P190-192)
【作者】谢小本
【作者单位】绍兴咸亨食品股份有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3
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