基因表达检测RTPCRppt课件
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逆转录pcrrt-pcr)和及时为反转录rcr ( reverse transcription pcrpcr ( real time pcr)共同的缩写。
逆转录pcr ,或许称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr) ,是聚合酶链式反响 (pcr) 中,一条 rna 链被逆转录成为互补 dna ,再以此为模板经过的一种宽泛应用的变形。
在pcr 进行dna 扩增。
rt-pcr由一条rna 单链转录为互补dna(cdna) 称作“逆转录” ,由依靠rna 的dna 聚合酶(逆转录酶)来达成。
随后,dna 的另一条链经过脱氧核苷酸引物和依靠rna 的dna 聚合酶达成,随每个循环倍增,即往常的pcr 。
原来的rt-pcr的指数扩增是一种很敏捷的技术,于遗传病的诊疗,并且能够用于定量监测某种rna 模板被rna 酶 h 降解,留下互补dna 。
能够检测很低拷贝数的rna 。
rt-pcr宽泛应用rna的含量。
(检测基因表达的方法,拜见northern blot 法。
)rt-pcr 作“ 定量有时也会指代及时pcr ” (quantitative pcr)pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录或许rtq-pcr(real-time quantitative pcr)pcr 相差别,往常被写。
及时pcr及时为基础进行pcr(real-time pcr)dna 的定量剖析。
,属于定量pcrreal time pcr( q-pcr)的一种,以一准时间内dna 的增幅量的定量使用萤光色素,当前有二种方法。
一种是在ds dna 中插入特异的萤光色素;另一种使用一种能与增幅dna 序列中特定寡核酸序列相联合的一种萤光探针(probe )。
real time pcr 与reverse transcription pcr 相联合,能用微量的rna 来找出特准时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
RT-PCR详细图文解析一、实时荧光定量PCR原理(一)定义:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
(二)实时原理1、常规PCR技术:对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术:利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量?通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念:(1)扩增曲线:(2)荧光阈值:(3)Ct值:CT值的重现性:5、定量原理:理想的PCR反应: X=X0*2n非理想的PCR反应: X=X0 (1+Ex)n n:扩增反应的循环次数X:第n次循环后的产物量X0:初始模板量Ex:扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1)确定未知样品的 C(t)值2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记:二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一:SYBR Green法(一)工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时,DNA双链分开,无荧光4、复性和延伸时,形成双链DNA, SYBR Green 发荧光,在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测2、Primer:引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到 1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同(二)应用范围1、起始模板的测定;2、基因型的分析;3、融解曲线分析:可以优化PCR反应的条件,对常规PCR有指导意义,如对primer的评价;可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。