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第9章 酶免疫试验 PPT课件

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酶九章-核酶 PPT课件

酶九章-核酶 PPT课件
第九章
核 酶 工 程
1981年Cech等发现四膜虫的核 糖体前体RNA可以在没有蛋白 质存在的情况下自身催化切除 内含子，完成加工过程。
该具有催化活性的RNA的 发现改变了传统上“酶是蛋白 质” 的观念，从此对具有催化 活性的RNA，即核酶(ribozyme) 的结构、催化机制以及应用的 研究日益深入。
核酸酶
剪切型或 分子间催化剪切型 核酸酶
自身催化剪切型或 分子内催化剪切型 核酸酶
核酸酶
似乎最有应用前景，因为人们 对它的剪切机制和分子结构要 求已经有所了解，可以针对病 毒核酸、不良基因或恶性基因 进行人工设计、合成相应的各 种RNA或DNA片段作为核酸酶基 因，定向地剪切病毒核酸或不 良基因以及它们的转录中间产 物，抑制它们的表达，进行疾
三 蛋白质-RNA复合酶(RNaseP)
蛋白质-RNA复合酶主要催化 tRNA前体成熟过程。
——例如S. Altman和N. Pace两个 研究组合作发现的大肠杆菌 tRNA5’成熟酶。
蛋白质-RNA复合酶酶由蛋白质和 M1RNA两个组分构成．
——蛋白质的分子量为20kDa， ——M1RNA含有377个核苷酸。 M1RNA单独具有全酶活性， 蛋白质只是维护M1RNA的构 象。
实验证明来自不同原核细胞 RNaseP中的M1RNA具有相似的三维 结构。
——与前面几种剪切型核酶不同的是， RNaseP催化得到的产物的3’端是羟基， 5’端是磷酸。
四
组I内含子和组II内含子
组I内含子(group I intron)和组II 内含子(group II intron)
——这类核酶比较复杂，通常包 括200个以上核苷酸，主要催化 mRNA前体的拼接反应。
核酸分子在总体的催化潜 力上和蛋白质相差甚远，但由 于可以遗传和变异而被自然界 保留下来催化一些特殊的反应。

酶联免疫吸附实验ppt课件

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作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。

第九章 酶免疫技术.ppt

第九章 酶免疫技术.ppt
新方法。
2019-11-4
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6
一、酶和酶作用底物
标记酶的要求：
活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
2019-11-4
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7
酶和酶作用底物
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
17
酶标记抗体或抗原
戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别 与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法 有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。
2019-11-4
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18
酶标记抗体或抗原
纯化及鉴定
标记完成后应除去反应液中的游离酶、 游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体 或抗原聚合物，避免游离酶增加非特 异显色，以及游离抗体或抗原起竞争 作用而降低特异性染色强度
应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和
乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
2019-11-4
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43
ELISA检测抗体的方法
捕获法
应用：
病原体急性感染诊断中的IgM型抗体
甲型肝炎HAV-IgM抗体
乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
2019-11-4
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44
捕获法
原理：
抗人IgMμ链抗体包被
• 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定， 非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为 液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙 烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）, 其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。

酶联免疫吸附试验(ELISA)PPT课件

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6. 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓
度按加量及比色液的最终体积而异，在板 式ELISAБайду номын сангаас一般采用2mol/L。
7.参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作
标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可 检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋 白保护剂及防腐剂的缓冲液中。
ELISA测定方法
前两种方法主要用于测定抗体和大分子 抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测 定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食 品分析。
ELIZA 方法图示
间接法
“Indirect” ELISA
1.The steps of "indirect" ELISA follows the mechanism below: A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to
5. 洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性
缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是 疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团 ，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的 疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质 与固相载体的结合，并借助于亲水基团和 水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶 液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的 非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可 在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使 包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低 试验的灵敏度。
ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971 年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过 程简单易行并可以定量，从而使其在食品安 全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市 场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品 中抗生素检测的试剂盒产品。

临床检验免疫学酶免疫技术课件

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常用的供氢体(底物）： 邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）:反应显橙黄
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的 酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记 Ag（Ab）的浓度成反比
四）捕获法(capture ELISA )：
主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法
原理：
（三) 结果分析：
1、定性
• 间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关
4℃过夜
弃包被液，PBS清洗
保存备用。
三）封闭(blocking)
1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程
2、常用的封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白
二、酶免疫技术分类
Ag-E + Ab E-Ag Ab + Ag-E
EE
E
E
三、酶联免疫吸附试验
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
待测抗原或抗体量与产物量呈负相关
基本原理
测定抗原:
测定抗体
特点：
用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对 抗体进行测定
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是 固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与 非标记Ag（Ab）的分子数量和

酶免疫测定技术PPT课件

酶免疫测定技术PPT课件
乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的 抗原或抗体，一直受到高度重视。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检 测方法， 绝大多数都是ELISA 法。80％ 原发性肝细胞癌患者的， 血清甲胎蛋白（AFP）含量增高。临床借助对AFP的检测作为对原发 性肝细胞癌的辅助诊断。
HIV 抗体初筛：抗体测定必须区分初筛和确认两个步骤, 目前常用的 初筛实验方法为第3 代ELISA试剂, 其敏感性和特异性均可达99%以 上。现已发展到抗原加抗体联合检测第四代试剂, 包被和标记的分别 是HIV1/2 O 抗原和HIV- l P 2 4 抗原的单克隆抗体, 可同时检测 HIV抗原和抗体, 检出时间提前大约七天。
enzymeimmunoassayeia抗原抗体反应的特异性酶免疫测定技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定elisa酶免疫增强测定技术emit克隆酶供体免疫分析cedia酶免疫增强技术酶免疫增强技术emitemit克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析cediacedia均相酶免疫测定均相酶免疫测定酶免疫测定技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定elisa酶免疫增强测定技术emit克隆酶供体免疫分析cedia酶免疫增强技术酶免疫增强技术emitemit捕获法异相酶免疫测定类型异相酶免疫测定类型10双抗体夹心法双抗体夹心法此法常用于测定抗原适用于多价大分子抗原的检测而不能用于测定半抗原等小分子物质
5
均相酶免疫测定
测定快速、准确、专一、灵敏 试剂稳定 操作过程简便 数据处理简单
6
酶免疫增强测定技术EMIT
酶免疫测定技术
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫分析CEDIA 液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 ELISA
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第三节 酶联免疫吸附试验
一、基本原理
原理 1
包被
反应加入待测抗
体或抗原和酶标
2
抗原或抗体
3 洗涤使结合在
固相上的抗原 抗体复合物与 未结合的分离
底物显色
4 定性或定量 的分析
二、ELISA方法建立的基本步骤
（一）ELISA方法类型的建立 1 初步确定方法类型 2.工作条件的优化 3.ELISA检测结果测定 （二）对建立的方法进行评价
二、包被抗原或抗体
包被
coating 将抗原或抗体结合于固相载体
（直接包被、间接包被）
封闭 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～
block 20%小牛血清消除固相载体表面未 ing 结合的位点，消除非特异性吸附
直接包被
稀释抗原或抗体（用0.05mol/LPH9.6的碳酸
盐缓冲液稀释抗原或抗体到3-10µg/mL）
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
4、加酶标抗体
与特异性抗原结
合，加底物显色
+
捕获法原理
EE E
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
4、加酶标抗体 无抗原结合，
- 加底物不显色
第三节 习 题
1 下列哪一种ELISA最常用于抗原的测定（ ）
小结
酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标 记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法， 在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底 物的作用进一步提高敏感性。
均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的 测定，异相酶免疫测定根据是否使用固相支持物， 又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。
标记酶的要求：
E ELISA间接法
5 关于ELISA竞争法，下列叙述正确的是（ ）
A 用于检测抗原
B 被测物与酶标记物的免疫活性各不相同
C 被测物多则标记物被结合的机会少
D 待测管的颜色比对照管的浅则表示被测物量少
E 结合于固相的酶标记抗原量与被测抗原量成正比
第四节 酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)
包被有待测细胞因子抗体的微孔板
基
+
分泌相应细胞因子的待测细胞
本
有或无刺激物培养
原 细胞因子被板上的特异性抗体捕获
理
后续的反应如同ELISA
一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜
色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关
酶联免疫斑点试验(ELISPOT)
第五节 发光酶免疫试验（LEIA）
原理：参与催化某一发光反应的酶来标记抗 体（或抗原），在抗原-抗体反应后加入发光 物，酶催化和分解底物发光，由光检测仪检 测发光强度，最后通过标准曲线计算出被测 物的含量。
EE E
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
3、加酶作用
EE E
E
的底物不显色
3、加酶作用
或显色弱
的底物显色
+
竞争法测抗原 -
ELISA检测抗体的方法
间接法 方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的
抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常测定HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等
间接法测抗体 -
E EE
+
E EE E EE
ELISA检测抗体的方法
双抗原夹心法 ➢原理：类似双抗体夹心法 ➢操作步骤：类似 ➢应用：乙型肝炎表面抗体
ELISA检测抗体的方法 竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：HBcAb和HBeAb的检测
竞争法
非经典竞争法
非经典竞争法
ELISA检测抗体的方法 捕获法 应用：
酶和酶作用底物
常用底物
ALP 底物
对-硝基苯 磷酸酯（ pNPP ）
经AP作用后的产物 为黄色对硝基酚， 最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基 酶作用后，生成 β-D半-乳糖 高强度荧光物 ， 苷（ 4MUG ） 用荧光计 测量。
第二节 酶免疫试验的分类
酶
酶免疫组化 组织切片或其它标 本中抗原的定位
一、固 相 载 体
➢固相抗体或抗原就是把抗体或抗原 结合到固相载体的表面
➢固相抗体或抗原是非均相酶免疫 技术中将游离和结合的酶标记物 迅速分离的最常用方法
固相载体
要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性
•利于反应充分进行
种类
•固相方法简便易行，快速经济 •微孔板 •磁微粒 •膜载体
A 双抗体夹心法ELISA B 间接法ELISA
C 竞争法ELISA D 捕获法ELISA E 补体结合法
2 捕获法主要用于何种物质的测定（ ）
A IgG B IgA C IgM
D IgD
E IgE
3 下列关于双抗体夹心法原理，不正确的是（ ）
A 使用分别针对抗原不同决定簇的两种单克隆抗体作 为酶标记物
原理及特点
原理： ➢酶标抗体（抗原）与抗原（抗体） 的特异性反应 ➢酶对底物的显色反应 ➢对抗原或抗体进行定位、定性或 定量的测定分析
原理及特点
特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。
第一节 酶免疫试验的组成要素
均相酶免疫测定 最具代表性的两种技术：
酶放大免疫分析技术EMIT enzyme-mutiplied
immunoassay technique
克隆酶供体免疫分析 CEDIA cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫分析技术EMIT示意图
常用酶：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和溶菌酶
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基）
与275nm（主酶） OD ELISA中应用最为广
值之比
泛的标记用酶
酶和酶作用底物
常用酶 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP
病原体急性感染诊断中的IgM型抗 体
甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
原理：
捕获法
抗人IgMμ链抗体包被
捕获待测标本中IgM类 抗体
加入特异性抗原和酶 标记特异性抗原的抗 体
底物显色
EE
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
B 一种单克隆抗体作为固相抗体，另一种作为酶标抗 体
C 可使标本和酶标抗体同时加入成为一步法
D 用于检测二价或二价以上的抗原
E 采用高亲和力的单克隆抗体可提高检测的灵敏度和 特异性
4 下列何种方法用一种标记物可检测多种被测物（ ）
A ELISA双抗体夹心法 B ELISA竞争法
C 放射免疫法 D ELISA捕获法
邻苯二胺 (OPD)
HRP的常见底物 5-氨基水杨酸 (5-ASA )
2,2′-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS)
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
胺 (OPD)
(5-ASA )
2,2′-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS)
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
免
疫
均相：不需要分离
试
验 酶免疫测定技术
液体标本中抗原或
固相酶免疫试验 异相
抗体的定性和定量
液相酶免疫试验
一、均相酶免疫试验
用于小分子激素和半抗原（如药
原
物）的测定
理 酶标记物与相应的抗原或抗体结
合后，标记酶的活性会发生改变，
不用分离结合和游离酶标记物，通
过测定标记酶的活性的改变，而确
定抗原或抗体的含量。
+
双抗体夹心法测抗原 -
ELISA检测抗原的方法
竞争法 方法：用已知抗体包被，同时加入待测血清 和酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被 物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半 抗原（药物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
三、方法类型及反应原理 三个必要试剂
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清 ，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗 原 测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、 HCG等
E EE
EEEE NhomakorabeaEA 多用于大分子物质的测定
B 酶标抗原和抗体在固相载体表面形成复合物，作用 于底物显色
C 需要分离结合和游离酶标记物
D 常利用酶标记抗原与抗体结合后的空间位阻降低酶 活性