推荐-单链抗体研究进展

01-治疗性抗体研发的进展和关键技术治疗性抗体是一种通过靶向特定分子或细胞表面分子来治疗疾病的生物药物。

近年来，随着生物技术和基因工程技术的进步，治疗性抗体研发取得了显著的进展。

本文将介绍治疗性抗体研发的进展和关键技术。

一、治疗性抗体研发的进展治疗性抗体研发的进展主要体现在以下几个方面。

1.抗体工程技术的发展抗体工程技术是治疗性抗体研发的核心技术，它包括人源化抗体、重链抗体、单链抗体等多种技术。

人源化抗体通过将小鼠抗体人源化，使其更适合在人体内使用。

重链抗体通过只表达重链而不表达轻链来减小分子的体积，提高肿瘤渗透性。

单链抗体则通过将两个链的抗原结合位点连接成一个链来提高抗体药物的渗透性和稳定性。

2.靶向治疗策略的发展单一抗体治疗已经不能满足临床需求，因此，针对不同靶点同时应用多种治疗性抗体的组合治疗策略逐渐被采用。

此外，还出现了针对癌症干细胞、免疫抑制分子等新靶点的治疗性抗体。

3.抗体药物研发的快速发展抗体药物的研发速度逐渐提高，成功开发出多种治疗性抗体，如临床上已经应用的西妥昔单抗、曲妥珠单抗等。

此外，抗体药物的研发不仅局限于单一的治疗领域，还涉及到多种疾病的治疗。

二、治疗性抗体研发的关键技术治疗性抗体研发的关键技术是保证其临床应用效果的重要因素。

1.高通量筛选技术高通量筛选技术是寻找高活性和高亲和力的抗体的关键技术。

通过结合自动化设备和大规模结果分析，可以快速筛选出具有良好生物学活性和亲和力的抗体药物候选物。

2.重组蛋白质表达技术重组蛋白质表达技术是治疗性抗体研发的核心技术之一、通过重组DNA技术可以在大规模中表达抗体的重链和轻链，从而获得一定量的治疗性抗体。

3.稳定性改进技术抗体药物的稳定性是影响其临床应用效果的关键因素之一、因此，开发稳定性改进技术是治疗性抗体研发中的关键问题。

目前，已经出现了多种稳定性改进技术，如PEG化、Fc片段工程等。

4.靶向破坏靶标技术靶向破坏靶标技术是治疗性抗体研发的重要技术之一、通过研发针对不同分子靶标的治疗性抗体，可以实现对特定细胞或分子的靶向杀灭，从而达到治疗的目的。

利用烟草和豌豆瞬时表达抗aFGF单链抗体单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)是利用DNA重组技术和蛋白质工程技术合成的一种小分子基因工程抗体,最近在肿瘤的诊断和治疗上得到广泛应用。

本研究利用改造的植物病毒载体在烟草(Nicotiana benthamiana)和豌豆(Pisum sativum L.)中瞬时表达抗人酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,a FGF)的单链抗体,旨在建立一种安全、高效,易于规模化生产的单链抗体瞬时表达体系。

本研究首先利用基于烟草花叶病毒(TMV)的p35S-30B表达载体,建立烟草瞬时表达体系并表达抗a FGF单链抗体,验证sc Fv在植物中表达的可行性;接着利用基于豌豆早褐病毒(PEBV)的p CAPE1和p CAPE2-GFP载体建立豌豆瞬时表达体系,通过叶片注射法在豌豆中瞬时表达sc Fv,寻找更适于sc Fv表达的受体植物;最后建立一种基于豌豆芽苗菜无土栽培的规模化植物瞬时表达系统,并对该系统表达的sc Fv进行纯化及生物学活性分析。

本研究的主要结论:(1)利用p35S-30B-GFP载体建立了基于叶片注射法的烟草瞬时表达体系,绿色荧光蛋白(GFP)在病毒侵染后8-10天达到峰值;利用含p35S-30B-sc Fv重组质粒的农杆菌EHA105侵染烟草,瞬时表达的sc Fv具有较强的抗原结合能力。

(2)利用p CAPE1和p CAPE2-GFP载体通过叶片注射法建立了豌豆瞬时表达体系,病毒侵染后的10-12天GFP达到最大量累积;成功构建了p CAPE2-sc Fv 和p CAPE2-GFP-sc Fv瞬时表达载体,利用叶片注射法侵染豌豆后,分别在RNA 和蛋白水平上检测到sc Fv基因的表达,ELISA检测证明sc Fv和GFP-sc Fv与抗原具有较好的结合能力。

纳米抗体研究进展综述摘要：单域抗体因其独特的优势，如水溶性好、分子量小、稳定性好、免疫原性小等一系列特点，在生物研究和医学领域中的作用愈发广泛。

在疾病诊断、病原检测、癌症疾病治疗、药物残留检测分析，坏境检测，用作sdAbs分子探针、分子诊断和显影等等领域具有广阔的应用前景。

纳米抗体因其优势，可实现重组表达，从而使得生产周期和生产成本均可大幅下降，是目前国内外研发的热点。

作者重点介绍了纳米抗体的特点，然后简述了纳米抗体的制备流程，简述了纳米抗体在疾病诊断、疾病治疗、食品安全和环境监测等领域的应用，最后对纳米抗体的应用前景进行了分析和展望。

1 介绍自1890年，第一种抗体——抗毒素，这是在血清中发现的第一种抗体［１］。

这是一种可中和外毒素的物质，1975年，杂交瘤技术的诞生开始了抗体研究和应用快速发展的时代。

由于抗体可特异性识别和结合抗原的特性，使其在疾病诊断、疾病治疗、药物运载、病原、毒素和小分子化合物检测等领域具有广泛的应用［２］。

但通过单克隆抗体技术制备的传统单克隆抗体有其不可忽视的缺点：生产耗时长、成本高、在组织和肿瘤中穿透力差、长期使用会引起机体免疫排斥反应以及动物道德问题等。

相比于传统抗体，纳米抗体具备传统抗体不具备的分子质量小和穿透性强的优势而成为现在抗体研究的主要方向之一。

单链抗体（single chain antibody fragment,scFv）就是新型小分子抗体的一种，其穿透力更强、生产成本更低，但scFv抗体存在溶解度低、稳定性较差、表达量低、易聚合和亲和力低的缺点［３］。

1989年，比利时免疫学家Hamers-Casterman 在骆驼血清中的偶然发现一种天然缺失轻链的重链抗体（HcAbs）可以解决scFv所存在的问题，重链抗体只包含２个常规的CH2与CH3区和１个重链可变区（ＶＨＨ），重链可变区具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位，其分子质量只有单克隆抗体的1/10，是迄今为止获得的结构稳定且具有抗原结合活性的最小抗体单位，因此也被称作纳米抗体（nanobody,Nb）［４］。

单链抗体的表达代鹏;周广青;马军武【摘要】单链抗体(scFv)是具有抗体活性的最小功能结构单位,是基因工程抗体研究领域中的热点,具有比单克隆抗体在生物病原体、微生物污染和寄生虫病等预防、检测和治疗的独特优点和应用前景.鉴于其重要性,单键抗体在不同的表达系统中得到表达与研究.简要综速了scFv的表达.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)010【总页数】6页(P60-65)【关键词】单链抗体;表速系统;外源基因【作者】代鹏;周广青;马军武【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心,兰州730046【正文语种】中文单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)是由一段适当的寡核苷酸(Linker)在DNA水平上将抗体轻链和重链可变区基因连接起来，使之在生物体内表现为单一肽链，具有抗体活性的最小功能结构单位，并能与多种效应分子相连构建成新功能抗体分子的理想元件，是基因工程抗体研究领域中的热点之一[1] 。

如今，scFv逐渐替代单克隆抗体(mAb)成为治疗和检测肿瘤、炎症、自身免疫病、乙肝及艾滋病等疾病的有价值分子，在生物病原体、寄生虫和微生物污染等预防和检测具有很大的应用前景。

Kim等[2] 将超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)和scFv组成 abf-SPIONs，对治疗癌胚抗原(CEA)具有潜在作用。

Shanta等[3] 应用针对淀粉样前体蛋白(APP)的scFv抑制阿尔茨海默氏病细胞β-分泌酶的活性，解决了 mAb在治疗过程的困难。

RP215单链抗体的构建、表达及其生物活性鉴定的
开题报告
一、研究背景与意义
单链抗体是由单个变异段连接桥接的不含Fc片段的适体，具有小分子抗原结合特异性高、生物稳定性高等优点，在抗肿瘤、抗病毒、临床
诊断等领域得到广泛应用。

RP215是一种针对乳腺癌组织中酸性糖蛋白（TAG-72）上的多克隆抗体，其作用机制尚不清楚，但已证实其在肿瘤
治疗中的应用前景广阔。

在RP215多克隆抗体的基础上，研究人员利用
软件模拟、分子克隆等技术获得了相应的单链抗体RP215scFv，但其构建、表达及其生物活性鉴定尚未进行深入研究。

基于以上情况，本研究旨在构建RP215单链抗体，并对其表达和生
物活性进行鉴定，为其在乳腺癌治疗上的应用提供科学依据和实验基础。

二、研究内容和步骤
1. RP215单链抗体的构建
通过软件模拟、分子克隆等技术，构建出RP215单链抗体的DNA序列，并插入到适宜的表达载体中。

2. RP215单链抗体的表达
将构建好的RP215单链抗体载体转染至细胞，并进行培养，收集细
胞上清液并进行纯化、浓缩等步骤，获得纯净的RP215单链抗体。

3. RP215单链抗体的生物活性鉴定
对纯净的RP215单链抗体进行活性鉴定，包括结合ELISA、Western blot、免疫荧光等方法，确定其在抗肿瘤治疗中的生物学特性和效能。

三、研究预期结果
本研究预期获得RP215单链抗体的构建、表达以及其在抗肿瘤治疗中的生物活性鉴定结果，为其在临床应用中提供实验基础和科学依据，对开发针对乳腺癌的新型治疗手段具有重要的理论和实践意义。

抗体工程药物的研究进展抗体工程药物是一种新型的生物药物，其通过对抗体结构进行改造和优化，以增强抗体的治疗效果和稳定性，从而达到更好的疗效。

抗体工程药物研究具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

本文将从抗体工程的基本原理、研究进展和应用前景三个方面进行论述。

抗体工程药物的基本原理是通过对抗体的变异、选优和合成，来获得更好的结构和功能。

目前，主要的抗体工程技术包括人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、抗体片段和人源单链抗体等。

其中，人源化抗体是将小鼠抗体的人重链和人轻链进行融合，使其在人体中表达和产生，具有较好的免疫安全性和高效的药理学效果。

嵌合抗体则是将小鼠抗体的大部分外源血清亲和度肽段与人源抗体的框架结合，以提高其在人体内的稳定性和免疫原性。

与之相对的是，单克隆抗体通过克隆和筛选单一的抗体细胞，以获得对特定抗原具有高亲和性和高特异性的单克隆抗体。

抗体片段是指用于识别和结合抗原的抗体分子的功能片段，如Fab和F(ab')2等。

人源单链抗体是一种由单一多肽链组成的抗体分子，其通过变异库筛选和分子进化等技术手段，获得了对抗原具有高亲和性和特异性的人源单链抗体。

抗体工程药物在研究进展方面取得了很大的突破。

近年来，研究人员通过不断的技术创新和优化，使得抗体工程药物在多个领域有了广泛的应用。

例如，在肿瘤治疗方面，通过抗体工程药物可以实现针对癌细胞的精确治疗，抑制肿瘤的生长和扩散。

在自身免疫性疾病治疗方面，抗体工程药物可以针对特定的免疫反应靶点，抑制免疫系统的异常活化，达到治疗效果。

此外，抗体工程药物还可以在传染性疾病防治、心血管疾病治疗和神经系统疾病治疗等多个领域发挥重要作用。

总之，抗体工程药物是一种经过改造和优化的新型生物药物。

其具有广阔的应用前景，可以在多个疾病领域发挥重要作用。

通过不断的研究和发展，相信抗体工程药物将会在未来的医学领域中发挥越来越重要的作用，为人类健康事业做出更大的贡献。

基因工程单链抗体及其应用
何云燕;夏云
【期刊名称】《国际检验医学杂志》
【年(卷),期】2006(027)009
【摘要】利用噬菌体展示技术构建的基因工程单链抗体是一种小分子抗体.该抗体不仅具备单克隆抗体可与抗原特异结合的特征,更因其具有分子量小、组织穿透性好、免疫原性低、易于基因工程操作和构建抗体融合蛋白等诸多优点而凸显其在医学应用中的价值.现着重就基因工程单链抗体的特点及其在感染性疾病、肿瘤等方面的诊断和治疗应用作一简要介绍.
【总页数】3页(P801-803)
【作者】何云燕;夏云
【作者单位】400014,重庆中山医院检验科;400016,重庆医科大学附属第一医院检验科
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.基因工程单链抗体在传染病中的应用研究进展 [J], 汤正好;姚集鲁
2.基因工程单链抗体及其应用 [J], 何云燕
3.基因工程单链抗体及其应用 [J], 何云燕
4.基因工程单链抗体的研究进展及临床应用 [J], 马广鹏;王敏
5.基因工程单链抗体及其应用分析 [J], 孙洪雁
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双特异性单链抗体BiTE的研究进展周冲;于峰;韩邦兴;周阳;刘黎琼;施海峰【摘要】癌症是严重威胁人类生存的重大疾病.BiTE(bispecific T-cell engager)所代表的一类具有显著抗肿瘤效应的双特异抗体,能够靶向性激活自身T细胞杀伤肿瘤细胞.BiTE由两个单链可变片段(scFv)组成,通过柔性融合接头串联连接.一个scFv 识别T细胞表面蛋白CD3ε,而另一个scFv识别特异性肿瘤细胞表面抗原.BiTE的这种结构和特异性结合蛋白能力允许它将T细胞物理性地桥接肿瘤细胞而形成T 细胞-BiTE-肿瘤细胞复合物,诱导免疫突触形成,刺激T细胞活化,产生杀伤肿瘤的细胞因子.近年来,BiTE在抗肿瘤研究中取得了显著进展,在临床上取得了理想的治疗效果.因此,对BiTE的结构、作用机制、临床应用以及创新性运用进行阐述.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2018(035)004【总页数】5页(P76-80)【关键词】双特异性单链抗体;BiTE;免疫治疗【作者】周冲;于峰;韩邦兴;周阳;刘黎琼;施海峰【作者单位】江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;皖西学院生物与制药工程学院中药研究与开发工程技术研究中心,六安237012;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;深圳市南山区人民医院血液科,深圳518052;江苏大学生命科学研究院,镇江212013【正文语种】中文【中图分类】Q78癌症是严重威胁人类健康及社会发展的重大疾病。

据中国2013年癌症统计数据显示，中国新发病例368万，占世界癌症新发病例的四分之一，且发病率总体呈增长趋势[1]。

现有常规治疗方案存在的非特异性、副作用大等问题推动了特异靶向治疗癌症的新型战略发展。

近年来，以BiTE为代表的一类具有显著抗肿瘤效应的双特异抗体技术迅速发展。

BiTE又称双特异性T细胞接合器(bispecific T cell engager)，属于双特性单链抗体，可同时识别T细胞与表达特定的肿瘤表面抗原的靶细胞，帮助T细胞重定向到肿瘤病灶区[2]。

单链抗体在治疗肿瘤中的应用肿瘤的治疗是一个漫长且困难的过程，现代医学也在不断地寻求更好的治疗方法。

近年来，单链抗体作为一种新型治疗肿瘤的药物，引起了广泛的关注和研究。

本文将介绍单链抗体在治疗肿瘤中的应用及其优势。

一、什么是单链抗体单链抗体是从普通抗体中精简而来的一种蛋白质分子，具有如同传统抗体一样的特异性，能够识别并结合到肿瘤细胞表面的抗原上，同时具有更小的分子体积和更高的可渗透性，可以更容易地穿过血液脑屏障和肿瘤组织，提高药物的疗效。

由于单链抗体的制备工艺较为简单，所以制备成本也相对较低，这些优势使得单链抗体成为当今治疗肿瘤的一种趋势。

二、单链抗体在治疗肿瘤中的应用1.抑制肿瘤生长单链抗体可以通过与肿瘤细胞表面的抗原结合来抑制其生长，同时还可以调节免疫反应，激活机体的细胞免疫和体液免疫，提高肿瘤细胞被识别和杀伤的效率，达到治疗肿瘤的目的。

2.靶向治疗单链抗体能够靶向地识别和结合到肿瘤细胞表面的特定抗原，使肿瘤细胞受到有效的攻击，同时减少对健康细胞的损伤。

研究表明，单链抗体可以被用于针对癌细胞的靶向治疗，提高了治疗的有效性和安全性。

3.治疗药物载体单链抗体还可以成为药物的载体，将药物传递到肿瘤细胞内，提高治疗效果。

另外，受制于传统抗体的分子量较大，不易渗透，单链抗体可以更容易地穿过肿瘤微环境，达到细胞内的局部治疗效果。

三、单链抗体的优势1. 高度特异性单链抗体具有与传统抗体相当的特异性，可以针对特定的抗原进行识别和结合，减少对健康细胞的影响。

2. 更好的渗透性单链抗体分子体积较小，更容易穿过血液脑屏障和肿瘤细胞，实现治疗的目的。

3. 制备成本低相比传统抗体，单链抗体的制备工艺较为简单，所需的原材料和成本也相对较低，有助于成本的控制。

四、单链抗体的研究与发展1. 个性化治疗随着人们对肿瘤治疗及生物学的不断深入研究，单链抗体的应用范围也在不断拓展。

个性化治疗也被包括在单链抗体研究发展中，利用单链抗体针对不同的肿瘤抗原和分子标志，为不同肿瘤患者提供特定的治疗方案。

基因工程抗体的研究进展及临床应用单克隆抗体技术自1975年问世至今，已被广泛地应用于疾病的诊断及治疗中，但是，目前应用的单克隆抗体绝大数是鼠源性的，临床重复给药时机体会产生免疫反应。

应用于临床的理想抗体应该是人源性的，而人-人杂交瘤技术目前进展缓慢，即使研制成功，仍存在杂交瘤细胞体外传代不稳定，产量不高及抗体亲合力低等缺陷。

迄今为止，解决这一问题最理想的途径就是研制基因工程抗体。

基因工程抗体的研究兴起于20世纪80年代早期，这一技术是将对免疫球蛋白（immunogloblin，简称Ig）基因结构与功能的认识与DNA重组技术有机结合，在基因水平上对Ig分子进行重组后导入受体细胞表达出来的，继多克隆血清和单克隆抗体之后，基因工程抗体也被称为第三代抗体。

1 基因工程抗体的研究进展基因工程抗体按分子结构可以分为嵌合抗体、重构抗体、单链抗体及单域抗体等。

其中以嵌合抗体研究的较多，技术也较为成熟。

而单链抗体、单区抗体等小分子抗体，具有结构简单、分子小、免疫源性低的优点，虽然技术还不够成熟，但其临床应用前景十分广阔。

抗体基因组文库技术的出现，从根本上改变了单抗的制备流程，操作简便、成本低、产量大，被称为抗体发展史上的一次革命。

各种基因工程抗体各具特点，下以我们分类加以介绍。

1.1 完整抗体此类抗体结构与天然抗体相似，具有完整的轻链和重链，只是将抗体中部分鼠源性成分人源化，从而降低其免疫源性。

目前研究较多的是嵌合抗体和重构抗体。

1.1.1 嵌合抗体在基因水平上连接鼠抗体可变区（variable region，简称V区）和人抗体稳定区（constant region，简称C区），插入表达质粒在转染细胞表达所产生的抗体，称之为嵌合抗体［1］（chimeric antibody）。

其中V区具有结合抗原的功能，而C区则具有抗体效应功能、免疫原性和种属特异性。

在构建嵌合抗体时，要有目的地选择抗体C区，这是因为每种Ig亚类与可形成蛋白结晶片段（fragmentcrystazable，简称Fc）受体和补体作用，触发细胞溶解的功能不同。

动物医学进展,2003,24(2):24-26Prog ress in Veterinary Medicine单链抗体的研究进展尹惠琼　综述,范泉水　审校(成都军区联勤部军事医学研究所,云南昆明650032)中图分类号:Q343.1 文献标识码:A文章编号:1007-5038(2003)02-0024-03摘　要:抗体在疾病的诊断、治疗和预防中发挥着重要的作用,其生产制备经历了抗血清多克隆抗体和单克隆抗体(M onoclo nal antibodies, M cAb)阶段,现已进入了基因工程抗体的时代。

基因工程抗体主要包括单链抗体(ScFv)、Fab抗体、F(ab`)2抗体等小分子抗体、嵌合抗体和改形抗体。

本文就单链抗体的研究进展作了综述。

关键词:基因工程抗体;单链抗体;噬菌体展示技术自从20世纪70年代德国学者Kohler和英国学者Milstein利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体[1]以来,其在医学、生物学、免疫学等诸多学科发挥了巨大的作用。

然而,由于目前制备的单克隆抗体绝大多数为鼠源性的,鼠源性单抗在临床治疗中由于反复使用,在体内易引起人抗鼠抗体(hunam a nti-mouse anti-body,HAM A)反应,而且其分子量大,血管通透性差,给临床应用带来了一定的困难。

而人源性单抗的制备尚存在许多困难。

基因工程抗体的研究开始于80年代初期,其最重要的进展是噬菌体抗体库技术的建立[2],其表面展示技术的创建,被誉为又一次革命性进展。

1989年,Huge第一次从噬菌体表达的重组抗体库中分离出单克隆抗体[3],由于丝状噬菌体展示技术[4],使得该技术得到了迅速的发展。

收稿日期:2002-09-12作者简介:尹惠琼(1973-),女,云南曲靖人,云南大学生化实验室在读硕士。

1　单链抗体的基因构建单链抗体(sing le chain Fv,Sc Fv)是一个重要的基因工程抗体,是利用基因工程方法使抗体重链可变区(V H)和轻链可变区(V L)通过一段约5～25个aa的连接肽,首尾拼接而形成的重组蛋白。

单链抗体（single-chain antibody fragment，scFv）由抗体重链可变区和轻链可变区通过１５～２０个氨基酸的短肽（linker）连接而成。

在目标特定的scFv上连接放射性核素、生物毒素、药物，将极大增强对靶细胞的杀伤能力。

Kanter等［１］研究发现将个体基因型scFv和细胞因子粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子或免疫刺激肽组成融合蛋白，是一种有效治疗淋巴瘤的疫苗。

Wang等［２］通过抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和抗单端孢霉毒素（ZEN）scFv基因融合，表达为抗DON和抗ZEN scFv，结果显示双功能抗体成功构建，并可应用于DON和ZEN检测。

scFv表达是scFv制备的关键步骤。

将基因通过表达载体整合入受体宿主基因内，依靠宿主的转录和翻译系统，scFv 片断完整表达于产物中。

本文将就scFv 表达技术及其进展做一综述。

１表达载体常用的scFv表达载体包括：质粒载体、噬菌体载体、腺病毒载体等。

１．１质粒载体质粒（plasmid）是以超螺旋状态存在于细菌细胞质中的一种能够自主复制的遗传成分，多以共价闭合环状的DNA（covalently closed circular DNA）分子形式存在［３］。

质粒载体借助于物理或化学的作用导入细胞内，依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力分为整合型和附加体型两种。

Jurado等［４］以Sigma-５４依赖的分解性TOL质粒为表达载体，在M１３噬菌体文库中表达的scFV 含量增高且与受体结合活性增强。

１．２噬菌体载体噬菌体表面呈现展示技术（phage display techniques），是近年来建立和发展的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术。

它以改建的噬菌体为载体，将编码外源肽或抗体可变区的DNA片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，并得到大量富集，然后进行DNA序列测定。

#综述# 文章编号:100022790(2009)0520474203蛋白质定向进化技术在改进单链抗体亲和力方面的研究进展李 琦1,雷迎峰2(第四军医大学:1口腔医学系6队,2基础部病原生物学教研室,陕西西安710033)收稿日期:2008210215; 接受日期:2008211230基金项目:国家自然科学基金(30600564);第四军医大学学员课外科研项目通讯作者:雷迎峰.Te:l (029)84774526 Em ai:l bcv i rus @f m m u .edu .cn 作者简介:李 琦.本科,第四军医大学口腔医学系6队学员.Te:l (029)82502517 Em ai:l liqi_yang @yahoo .co m .cn=摘 要>蛋白质定向进化(DE)在蛋白质工程中取得了令人瞩目的成就,其核心技术)))随机突变库构建技术已成为近年来体外DE 研究的热点.在对单链抗体进行改进时可以通过引入有性PCR,易错PCR 和DNA 改组等蛋白质DE 技术进行突变和重组,对所得的抗体库进行DE ,增加分子遗传多样性,从而提高获得高亲和力、良好稳定性抗体的概率.我们综述了DE 的原理和基本方法,并阐述了研究意义和在改进单链抗体亲和力方面的最新研究成果.=关键词>定向进化;D NA 重组;易错PCR =中图号>R 392233 =文献标识码>A0 引言 定向进化(d i rected evol u tio n ,DE)是近20a 发展起来的一项新技术,是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用,分子生物学的突飞猛进,使得分子水平上的DE 成为可能.分子水平的DE 主要体现在蛋白质,蛋白质的DE 是蛋白质工程的新策略.DE 属于蛋白质的非理性没汁,它不用事先了解蛋白质的结构、保守位点、催化机制等,具有相当大的应用价值,将蛋白质DE 技术运用在单链抗体亲和力方面的改造,将在生物工程、人类疾病的治疗研究等重要领域具有广阔的应用开发前景.1 蛋白质的体外DE DE 的原理是对目的基因进行突变、重组、表达和筛选,在试管内模拟蛋白质的自然进化过程,获取人们需要的、具有特定性质和功能的蛋白质[1]第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子多样性;然后对该多样性文库的基因产物进行筛选,那些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化;重复这个过程直到达到目标.目前比较流行的方法有以下几种:1.1 易错PCR 易错PCR (error .pro ne PCR,ep PCR )是指通过改变PCR 的反应条件[2-3],如:调整反应体系中4种d NTP的浓度、增加M 的浓度、加入Mn2+或使用低保真度Taq 酶等,使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变,构建突变库,筛选出所需的突变体.易错PCR 的关键是控制D NA 的突变频率.如果DNA 的突变频率太高,产生的绝大多数酶将失去活性;如果突变频率太低,野生型的背景太高,样品的多样性则较少.对于每一DNA 序列来说,合理的碱基突变数是1~3[4].理想的碱基置换率和易错PCR 的最佳条件则依赖于随机突变的目标D NA 片段的长度.在该方法中,遗传变化只发生在单一分子内部,所以属于无性进化.由于它较为费力、耗时,一般多用于较小基因片段(<800bp)的改造.在通常情况下,经一轮的易错PCR,定向筛选,很难获得令人满意的结果,由此发展出了连续易错PCR (sequenti a l error 2pro ne PCR ),该方法是将一次PCR 扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR 扩增的模板,连续反复进行随机诱变,使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变.1.2D NA 改组 D NA 改组(D NA s huffli ng)又称有性PCR (sex ua l PCR ),是将一群密切相关的序列(如多种同源而有差异的基因或一组突变基因文库)在D Nase I 的作用下随机酶切成小片段,这些小片段之间有部分的碱基序列重叠,它们通过自身引导PCR (se lf 2prl m i ng PCR )延伸,并重新组装成全长的基因(reasse m bly PCR )[2-3].该过程所产生的相关序列间的交换归因于模板的转换,其目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会,导致更大的变异.最终获取最佳突变组合的蛋白质,同时也可实现目的蛋白多种特性的共进化.Forti n 等[5]运用易错PCR,饱和突变和D NA shu ffli ng 对加双氧酶(Do x G)进行D E,得到Dox G 的变异体Do x Gs M A2,其专一性常数明显提高.比野生型加双氧酶提高了770倍.当D NA shu ffli ng 用来重组一套进化上相关的基因时,又被称为fa m ily shuffli ng .N i 等[6]用fam il y shuffli ng 对同源性为78.5%~96.0%4种白蚁的B 21,42葡聚糖酶构建了嵌合基因文库,使其活性较野生型基因提高了20~30倍.1.3 体外随机引发重组 体外随机引发重组(rando m 2pr i m 2i ng in vitro reco m bina ti on ,RPR )[7]是用一套随机序列引物,产生互补于模板不同位置的短DN A 片段库(由于碱基错配,这些短DNA 片段也含有少量的点突变).然后进行类似于DNA shuffli ng 的全长基因装配反应,获得多样性文库.其特点在于:¹RPR 可以利用单链DN A 或mRNA 为模板,故可10~20倍地降低亲本DN A 量;º在DNA 改组中,片段重新组装前必须彻底除去D Nase I ,故R PR 方法更简单;»合成的随机引物具有同样长度,无顺序倾向性,在理论上,PCR 扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变;¼随机引发的D NA 合成不受D NA 模板长度的限制.这给小肽的改造提供了机会.Shao 等[7]利用此方法成功地对枯草杆菌蛋白酶E 进行DE 得到突变酶,其热稳定性提高了8倍.1.4 交错延伸 交错延伸(staggered extens i on process ,St EP)[8]是一种简化的D NA shuffli ng 方法,它不是由短片段组装全长基因,而是在PCR 反应中,将含不同点突变的模板混合,随之进行多轮变性、短暂复性及延伸反应,在每一轮中,那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸,由于模板转换而实现不同模板间的重组,如此重复直至获得全长基因片段.Edd ie 等[9]运用DNA shuffli ng 和S t EP 技术使大肠杆菌B 2葡糖苷酸酶的活力提高了200倍.并且具有高频率、高密度的交叉水平.1.5过渡模板随机嵌合生长过渡模板随机嵌合生长(ran2 do m chi m eragenesis o n transient te mp l a tes.RACH1T T)技术[10-11]是与D NA s huffli ng概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术.它不包括热循环、链转移或交错延伸反应,而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时D NA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接.其中的悬垂切割步骤使短片段(比DNase消化片段还短)得以重组,明显提高了重组频率;如果在片段重组前后采用错误倾向PCR还可引入额外点突变.2突变库构建策略在实际应用中,希望得到中等适合度和丰度的突变库,适合度与丰度相平衡,适合度与蛋白质筛选通量相匹配.虽然不同的蛋白质有不同的要求,但一般来说,随机点突变控制突变频率在每个序列2~3个碱基或1个氨基酸残基变异的水平,可以获得适当活性的基因文库[12];D NA 洗牌文库则可以依据实践经验和数学模型控制反应条件得到适当的突变频率.由单一亲本基因起始进行DE的典型策略有两种,一种是运用随机点突变技术构建起始基因文库,选择最好的克隆进入下一轮随机点突变[13];另一种是运用随机点突变技术构建起始基因文库后,选择适合度高于某一域值的所有良性克隆,以此为亲本构建DN A洗牌文库.前者构建的突变库大部分克隆适合度低于亲本基因,需要高通量筛选方法予以配合,定量筛选最好克隆也需较大工作量,同时有害突变容易积累.后者则可以在起始突变库的基础上,将多数良性克隆并行向前进化,避免丢掉局部的良性突变,同时快速消除有害突变,积累有益突变.对于多个原始亲本如蛋白质家族的DE,可以应用家族D NA洗牌方法构建突变库[14].D NA 洗牌最终获得高适合度克隆后,可采用回交的策略,将其与某一原始亲本基因再进行一次D NA洗牌,消除无贡献突变和影响其他特性的有害突变[15].3几种常见的蛋白质DE技术在改变单链抗体亲和力方面的实际应用3.1以D NA重组(D NA shuffli ng)为主的DE牛海绵状脑病(疯牛病)是一种致命的神经退行性疾病的影响朊病毒牛是传播给人类,被感染的牛肉中含有疯牛病朊病毒,高效率的将它们检验出来依赖于简单,高度敏感和非侵入性的诊断试验,高亲和抗体是发展是能够检测出即使少量的疾病相关蛋白构象(朊病毒)的前提.提高朊病毒肽链非结构化区域尤其是对朊病毒(SC)进行蛋白质变性的预处理后与单链抗体的亲和力至关重要.Lugi nbuh l等[16]用易错PCR和DNA改组的方法,进行了几个回合的DE和用核糖体展示抗体库技术进行筛选后发现,得到的抗体与朊病毒肽链非结构化区域的亲和力增加.Fe r m er等[17]利用噬菌体展示和D NA改组的方法对与胃泌素释放肽低亲和力的抗体进行DE,使特异性的Ig M抗体的亲和力提高近3个数量级.我们选用杂交瘤细胞株生产的对胃泌素释放肽低亲和力的抗体作为起始原料,建设一个噬菌体展示技术的抗体库,从而得到特异性的Ig M抗体.然后引入体外随机突变引发重组(R PR),取得具有较高亲和力的抗体,接下来进行两轮的DN A改组,增加亲和力表现在第二轮突变后,序列分析表明突变主要是在互补决定区(CDR)上.P l ck t hu mx研究小组利用核糖体展示技术筛选到1.1 n m ol/L高亲和力的ScFv,之后又通过引入DN A重排技术,将其亲和力提高了30倍,得到了40p m ol/L亲和力的ScFv[18].3.2以易错PCR(e rror.pro ne PCR)为主的DE Lee等[19]利用核糖体展示技术制备出了专门针对HBV D NA多聚酶末端蛋白的特异性单链抗体,在兔子的网织红细胞裂解液中进行体外表达,然后通过随机突变进行分子进化,通过放射免疫分析,不同的突变单抗和HBV D NA多聚末端蛋白具有不同的亲和力,通过筛选得到了高亲和力的单链抗体.J uarez等[20]通过运用易错PCR的方法和噬菌体展示技术对单链抗体片段(抗体)的BCF2建造,并在大肠杆菌中表达,经测试不仅将对抗蝎子毒素中和抗体的亲和力提高了15倍,而且还提高了抗体的稳定性和使其能恢复失效的能力,表明了用易错PCR重组的抗体对抗蝎子蜇伤更加高效,稳定.此外,Fukuda等[21]用体外随机引发重组的方法(R PR)通过对mRNA展示方法取得的编码基因的碱基通过嘌呤突变,然后进行类似于D NA shuffli ng的全长基因装配,对单链抗体进行针对性地体外进化,对抗体库经过4轮挑选,获得了6个不同序列的编码基因,动力学分析显示,突变的scFvs的亲和力提高大约30倍.4展望自DE技术问世以来,已经多次成功地利用这一技术实现了对一些蛋白质的改造,如酶活力的提高、药物蛋白特性的改进、新代谢途径的获取等众多领域.因此,它是一种构建大型文库和获取分子的有力工具.同样,在基因工程抗体工程方面也具有十分广阔的应用开发前景,并且DE技术已逐步广泛用于抗体库的体外进化,它在短期内可以筛选到具有高亲和力的蛋白分子,它的出现为制备小分子抗体开辟了一条新途径.=参考文献>[1]Kol km an J A,Ste mm erWPC.D i rected evo l uti on of p rotei ns by exonshu ffli ng[J].Nat u re Bi otechno,l2001,19(5):423-428.[2]Neyl on C.Che m ical and b i och e m ical strat egi es for t h e rando m iz a2ti on of prote i n.en cod i n g DNA sequen ces;li brary con struction m eth2 od s f or d i rected evol u ti on[J].Nucleic A ci ds Res,2004,32(4):1448-1459.[3]CadwellRC,Joyce GF.M utagen ic PC R[J].PC R M ethod s A pp,l1994,3(6):S136-S140.[4]M oore J C,J i n HM,K uchn er O,et a.l Strategies f or the in vitroevoluti on of p rotei n f un cti on:E nzy m e evol u ti on by rand o m recom2b i nati on of i m p roved sequ ences[J].J M ol B i o,l1997,272(3):336-347.[5]Forti n P D,Macpherson I,N eau DB,et a.l D i rect 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乙醇或红花油按摩.按摩时,手掌应紧贴皮肤,用力要由轻到重,由重到轻做环形按摩[4].如发现患者局部已有红、肿、热、痛等压疮早期症状,按摩时不要在该处进行,如果皮肤未破损,应在发红之处按摩.经常用温水擦浴或用湿热毛巾敷于受压部位按摩,以改善局部血液循环.º护士长巡视病房时,通过观察患者皮肤情况,检查翻身卡填写的准确性和措施的合理性,从而保证卧床患者翻身卡的使用得到落实.»通过使用翻身卡应使患者及家属了解皮肤护理的方法和重要性,从而对护理工作起到监督作用,使卧床患者的护理得到全程、双重、有效的监督管理.3 讨论 卧床患者翻身护理是一个24h 连续护理过程,护理工作繁琐而又细致,如果缺乏监督机制,责任落实不到人,就会形成压疮甚至危及生命[5].我们通过使用翻身卡使压疮形成由2.8%降低至0%,有效提高了护理质量.我们认为有效的检查和监督机制是护理计划落实、措施持续的重要保证.=参考文献>[1]陈丽娜,董少勤,陈春燕.小型凉液垫在预防褥疮中的应用[J].中华护理杂志,2007,36(2):132.[2]张光明,胡凤云,杜 燕,等.急性损伤期和非急性损伤期患者褥疮的临床特点及护理[J].中华护理杂志,2002,37(7):491-493.[3]殷 磊.护理学基础[M ].北京:人民卫生出版社,2000:128.[4]蔡宝珠.褥疮预防策略[J ].国外医学#护理学分册,2004,17(6):272.[5]周 英.褥疮病患者的评估方法[J].中华护理杂志,2005,30(11):689-699.编辑 杨湘华。

基因工程抗体的研究进展及临床应用摘要：基因工程抗体是指通过基因工程技术获得的具有抗体活性的蛋白质分子。

该技术的发展极大地推动了抗体的研究进展和临床应用。

本文将介绍基因工程抗体的研究进展，包括基因工程抗体的产生技术、改良技术和应用领域，并讨论其在临床上的应用前景。

一、介绍1.1抗体的研究历程1.2基因工程抗体的定义和发展二、基因工程抗体的产生技术2.1杂交瘤技术2.2非杂交瘤技术（全抗体、单链抗体、人源化抗体）三、基因工程抗体的改良技术3.1亲和力成熟3.2人源化和人源化基因工程抗体四、基因工程抗体的应用领域4.1医学诊断4.2生物治疗4.3药物研发五、基因工程抗体在临床上的应用前景5.1抗体药物市场的发展趋势5.2基因工程抗体的临床前景和挑战5.3未来可能的研究方向六、结论6.1基因工程抗体的研究进展6.2基因工程抗体的临床应用前景Abstract:Genetically engineered antibodies are protein molecules with antibody activity obtained through genetic engineering technology. The development of this technology has greatly promoted the research progress and clinical applications of antibodies. This article will introduce the research progress of genetically engineered antibodies, including the production technology, modification technology, and application fields of genetically engineered antibodies, and discuss their prospectsin clinical applications.1. Introduction1.1 Historical development of antibodies1.2 Definition and development of genetically engineered antibodies2. Production technology of genetically engineered antibodies2.1 Hybridoma technology2.2 Non-hybridoma technology (full antibody, single-chain antibody, humanized antibody)3. Modification technology of genetically engineered antibodies3.1 Affinity maturation3.2 Humanization and humanized genetically engineered antibodies4. Application fields of genetically engineered antibodies4.1 Medical diagnosis4.2 Biologic therapy4.3 Drug development5. Prospects of genetically engineered antibodies in clinical applications5.1 Development trends in the antibody drug market5.2 Clinical prospects and challenges of genetically engineered antibodies5.3 Possible future research directions6. Conclusion6.1 Research progress of genetically engineered antibodies。