犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析Ξ董江丽1,李淑芬2,张鹤龄11(内蒙古大学生命科学院,呼和浩特010021)2(内蒙古农业大学生物工程系,呼和浩特010018)摘要:从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒(CPV )。

提取病毒基因组DNA ,并以此DNA 为模板,采用人工合成的引物进行PCR 扩增,PCR 产物经B am H I 、S ac I 双酶切后,克隆于pUC19质粒的B am H I/S ac I 位点。

重组质粒pUCVP2经PCR 鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明:获得了犬细小病毒内蒙株(CPV 2IM )VP2基因的全长克隆,VP2基因全长1755nt ,与国外报道的美国1株(CPV 2N )、美国2株(CPV 2B )和猫全白细胞减少症病毒(FPLV )的核苷酸序列同源性分别为99.32%、98.29%、98.52%,氨基酸序列同源性分别为98.87%、97.09%、97.77%。

关键词:犬细小病毒;VP2基因;序列分析中图分类号:S852.655 文献标识码:A 文章编号:1003-5125(2000)04-0379-09犬细小病毒(Canine Parvovirus ,CPV )属自主复制的细小病毒,该病毒可引起犬细小病毒病,又称犬细小病毒性肠炎。

本病以剧烈呕吐、出血性肠炎、白细胞显著减少为主要特征,不同品种和年龄的犬都易感,幼犬在16周出现心肌炎、死亡率高达20%～100%[1]。

目前,国内主要采用CPV 灭活疫苗和犬五联弱毒疫苗进行免疫预防,由于母源抗体的干扰及CPV 毒株在强大的免疫压力下产生抗原漂移,常导致免疫失败。

1993年,布日古德等用HA 和HI 调查内蒙警犬基地的CPV 感染,结果表明,在正常接种下,感染率高达26%[2]。

细小病毒是目前动物病毒中最小、最简单的一类单链线状DNA 病毒。

CPV 病毒粒体直径为25nm ,无囊膜,呈二十面体,其基因组为单链、负链DNA ,全长5323nt 。

犬细小病毒的分离鉴定及其VP2基因序列分析林鹏;赵航;王建科;程悦宁;任静强;易立;仝明薇;程世鹏【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)010【摘要】本试验从北京某动物医院疑似犬细小病毒(CPV)感染犬粪便中分离出一株病毒.通过电子显微镜观察、血凝试验、动物回归试验和分子生物学鉴定,本试验成功分离出一株CPV,命名为BJ-24.对BJ-24株的VP2基因序列分析发现该分离株为CPV-2a亚型,其VP2基因与GenBank中19株CPV VP2基因核苷酸序列有较高的同源性,均在98.7％以上,甚至与CPV-JS2株达到100.0％.系统进化分析结果表明所分离的BJ-24株属于中国分支,与CPV-JS2株遗传距离最近.本试验对进一步开展北京地区CPV的流行病学调查提供基础依据,并对防制病毒传播和疫苗研制奠定了坚实的基础.【总页数】7页(P2587-2593)【作者】林鹏;赵航;王建科;程悦宁;任静强;易立;仝明薇;程世鹏【作者单位】中国农业科学院特产研究所,吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,长春130112;中国农业科学院特产研究所,吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,长春130112;中国农业科学院特产研究所,吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,长春130112;中国农业科学院特产研究所,吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,长春130112;中国农业科学院特产研究所,吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,长春130112;中国农业科学院特产研究所,吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,长春130112;中国农业科学院特产研究所,吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,长春130112;中国农业科学院特产研究所,吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,长春130112【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.犬细小病毒YBYJ株的分离鉴定及VP2基因的序列分析 [J], 张立媛;高旭;陈海迪;于清洋;方爽2.犬细小病毒JN株的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 姜燕霞;张淑玲;王金良;申识川3.犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析 [J], 赵屹钦;曾梦颖;郭娟;张迪;高洪;严玉霖4.犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定 [J], 周宏专;苏霞;林路路;齐颀;张进;徐福洲;杨兵5.三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 陈延宗;钱晶;王晶宇;赵航;毕振威;夏兴霞;诸玉梅;芮荣;王永山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒VP2基因的克隆与生物信息学分析叶新慧;申魁魁;符欣蕙;王丽霞;李恭贺;张明;卢晟盛;卢克焕;郑喜邦【期刊名称】《基因组学与应用生物学》【年(卷),期】2012(31)6【摘要】本研究旨在克隆犬细小病毒VP2(Canine parvovirus VP2,CPV-VP2)基因,构建克隆载体pMD18-T-VP2,分析其生物信息学特征。

以犬细小病毒(CPV)阳性病犬血液基因组病毒DNA为模板,PCR扩增CPV-VP2基因,通过TA克隆获得pMD18-T-VP2重组质粒,测序后对其进行生物信息学分析。

结果表明:(1)CPV-VP2完整的开放阅读框由1755个核苷酸组成,共编码585个氨基酸残基,其序列同源性与浣熊最高,达97.6%;(2)信号肽在线预测认为,CPV-VP2基因无信号肽;(3)CPV-VP2大多数氨基酸偏好以T、A结尾的密码子;(4)CPV-VP2蛋白可能存在7个糖基化位点,其丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸分别存在8个、10个和7个磷酸化位点;(5)CPV-VP2可能存在76个B细胞抗原表位;(6)CPV-VP2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;(7)CPV-VP2蛋白二级结构的α-螺旋区域占9.93%、β-折叠区域占24.49%、无规则卷曲区域占65.58%;(8)CPV-VP2蛋白三级结构存在多个螺旋和折叠区域,主要以无规则卷曲为主。

本研究为制定CPV-VP2基因原核或真核高效表达策略提供了参考资料,并为进一步制备CPV胶体金快速诊断试纸条和基因工程疫苗奠定了基础。

【总页数】5页(P554-558)【关键词】犬细小病毒;VP2基因;分子克隆;生物信息学分析【作者】叶新慧;申魁魁;符欣蕙;王丽霞;李恭贺;张明;卢晟盛;卢克焕;郑喜邦【作者单位】广西大学动物科技学院;亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S858.315.3【相关文献】1.猪细小病毒SC-1株VP2基因的克隆及生物信息学分析 [J], 罗燕;郭万柱;刘艳丽;殷华平2.成都地区犬细小病毒VP2基因克隆分析及基因型鉴定 [J], 杨晓农;王成东;项振义;王斌;张焕容;杨发龙;于学辉;龙虎;刘群;陈世界;严玉宝;余华3.南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析 [J], 徐闰;黄华旭;徐小明;李政泰;马麟;劳小香;吴显实4.猫细小病毒VP2基因克隆与生物信息学分析 [J], 姜伟;郭明佳;吴树康5.猪细小病毒自然弱毒N株VP2基因的克隆、测序及生物信息学分析 [J], 李斌;梁家幸;赵武;苏乾莲;何颖;梁保忠;秦毅斌;何苹萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定王铮;王铁成;冯娜;虞一聪;高玉伟;杨松涛;夏咸柱【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2014(000)003【摘要】用纯化后的犬瘟热病毒免疫Balb/c小鼠，采用间接ELISA方法筛选分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株，并挑选阳性孔进行亚克隆，用Vero细胞交叉反应试验及间接免疫荧光检测单克隆抗体的特异性。

结果获得2株能稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体细胞株，分别命名为062-1、062-2。

实验室已有的一株单克隆抗体为6 H8。

交叉反应试验及间接免疫荧光染色检测表明，3株单克隆抗体的特异性较好；经过体外连续传代及反复冻存、复苏，杂交瘤细胞均能稳定分泌特异性单克隆抗体。

培养上清液及小鼠腹水间接 ELISA效价分别为1∶105和1∶108。

相加试验表明，单克隆抗体062-1、062-2具有共同的表位，而单克隆抗体6 H8识别的位点与其他两株不同。

%Canine distemper virus was purified and used to immunize Balb/c mice.The hybridoma culture su-pernants were screened by indirect ELISA.The positive cells were subcloned until all clones were positive. The specificity of monoclonal antibodies was confirmed by Vero cross-reaction test and IFA.The results showed that three hybridoma cells secreting anti-CDV McAb were obtained.These two cells were named 062-1,062-2.The lab had one McAb called 6H8.All the three McAbs confirmed by cross-reaction test and IFA were specific against CDV.The positive hybridomas were also able to secrete McAbs stably by series passage in vitro with freezing and recovering.The titers of cell culture supernant andascites tested by ELISA were 1∶105 and 1∶108 ,respectively.Additivity ELISA results showed that epitopes recognized by 2 McAbs(062-1,062-2)differed from that of by McAb 6H8.【总页数】5页(P73-77)【作者】王铮;王铁成;冯娜;虞一聪;高玉伟;杨松涛;夏咸柱【作者单位】吉林农业大学，吉林长春130062; 军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130062;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130062; 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130062;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130062; 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春130062;吉林农业大学，吉林长春 130062; 军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130062;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130062; 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130062;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130062; 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春130062;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130062; 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130062【正文语种】中文【中图分类】S852.655【相关文献】1.犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及特性鉴定 [J], 苏建青;岳妙姝;王化磊;薛琳;夏咸柱2.犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及鉴定 [J], 孙玮;靳晓霞;夏咸柱;王铁成;杨松涛;高玉伟;王承宇;张涛;杨玉姣;刘玉秀;阮洋3.犬瘟热病毒截短P蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 [J], 袁维峰;贾红;于萍萍;侯绍华;郭晓宇;史利军;赵占中;朱鸿飞4.抗犬瘟热病毒核蛋白单克隆抗体的制备及其线性抗原表位鉴定 [J], 曹智刚;易立;程悦宁;仝明薇;李爽;王建科;林鹏;孙亚茹;程世鹏5.抗犬瘟热病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 [J], 赵爽爽; 刘云; 李彤彤; 王文静; 薛雨佳; 刘明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为了解犬细小病毒的临床流行及变异情况，本研究于河南省方城县采集了8份疑似CPV 感染犬粪便样品，经过PCR 检测、CRFK 细胞增殖培养、透射电镜观察和病毒滴度测定后，对其VP2基因进行序列分析。

结果表明5株分离株为犬细小病毒，病毒滴度分别为10-4.22/0.1 mL （China-HN-01株）、10-3.56/0.1 mL （China-HN-02株）、10-3.78/0.1 mL （China-HN-05株）、10-4.47/0.1 mL （China-HN-06株）、10-4.4/0.1 mL （China-HN-07株）。

VP2基因序列比对和遗传进化树分析结果显示，4株分离株基因型为New CPV-2a ，1株分离株基因型为CPV-2c ，5株分离株与疫苗株的同源性为97.8%~98.7%，与国内外参考毒株的同源性为94.0%~99.0%，4株New CPV-2a 基因型毒株与四川的Canine/China/24/2017株亲缘关系最近，CPV-2c 基因型毒株与蒙古国5-MGL 分离株位于同一分支，与我国河南地区的3株CPV-2c 毒株亲缘关系较远。

对河南方城地区CPV 毒株的分析，为研究CPV 变异株在河南地区的传播和宠物疫病防控提供了理论依据。

关键词：犬细小病毒；分离；VP2基因；进化分析中图分类号：S852.65文献标志码： A文章编号：1674-6422（2023）03-0054-08Isolation and Sequence Analysis of VP2 Gene of Canine Parvovirus from Fangcheng, HenanLIN Yuting 1,2, ZHAI Qi 2, ZHAI Shaolun 2, LYU Dianhong 2, ZHOU Xiurong 2, JIA Chunling 2, HUO Wei 2,WEN Xiaohui 2, Wei Wenkang 1,2,3(1. College of Animal Science & Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2. Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong Province, Scientific Observation and Experiment Station of Veterinary Drugs and Diagnostic Techniques of Guangdong Province, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510640, China; 3. Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of AgriculturalSciences, Guangzhou 510640, China)收稿日期：2021-01-11基金项目：国家重点研发计划（2016YFD0501000）；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金（2019KJ119）；广东省农业科学院学科团队建设（201634TD）；广东省农业科学院院长基金（202024）作者简介：林瑜婷，女，硕士研究生，预防兽医学专业；翟颀，男，助理研究员，主要从事动物疫病诊断技术研究 通信作者：温肖会，E-mail：*******************；魏文康，E-mail：**************犬细小病毒河南方城株分离及VP2基因序列分析林瑜婷1,2，翟 颀2，翟少伦2，吕殿红2，周秀蓉2，贾春玲2，霍 玮2，温肖会2，魏文康1,2,3（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广州510225；2.广东省农业科学院动物卫生研究所 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州510640；3.广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广州510640）2023,31(3):54-61Abstract: In order to investigate the prevalence and variation of Canine parvovirus, 8 fecal samples were collected from dogs suspected of CPV infection from Fangcheng county, Henan province. Five CPV isolates were obtained based on PCR amplifi cation, growth on CRFK cells, transmission electron microscopy and virus titration. The TCID 50 titers of these isolates were 10-4.22/0.1 mL (China-HN-01 strain), 10-3.56/0.1 mL (China-HN-02 strain), 10-3.78/0.1 mL (China-HN-05 strain), 10-4.47/0.1 mL (China-HN-06 strain) and 10-4.4/0.1 mL· 55 ·林瑜婷等：犬细小病毒河南方城株分离及VP2基因序列分析第31卷第3期犬细小病毒病是由细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parvovirus ）的犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）感染犬只引起的致命性传染病[1]，该病常以出血性肠炎、白细胞含量显著减少、腥臭血便和严重脱水等为主要临床特征，部分表现为突然死亡的急性心肌炎型[2]。

犬细小病毒VP2基因乳酸菌表达载体的构建及蛋白检测段欣强;张洪亮;周保琨;杨瑞梅;单虎【摘要】本研究旨在克隆犬细小病毒VP2 (CPV-VP2)基因,构建乳酸菌重组表达载体,以乳酸菌表达CPV-VP2目的蛋白,通过重组目的蛋白检测及分析,为CPV乳酸菌口服疫苗研究提供支撑.以PCR方法扩增CPV-VP2编码目的基因,纯化后连接表达载体pMG36e,构建重组乳酸菌表达载体pMG36e-VP2,电转至乳酸球菌MG1363感受态,经PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析,挑选阳性重组菌株,命名为:pMG36e-VP2-MG1363.使用诱导剂Nisin诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting鉴定重组蛋白.结果显示,成功构建重组表达载体pMG36e-VP2,SDS-PAGE,结果表明,重组目的蛋白分子大小约65 kD,与理论值相符;Western Blotting结果表明,重组目的蛋白可被犬源CPV阳性血清所识别,具有良好免疫反应性.本研究用乳酸菌成功表达犬细小病毒蛋白,为该病新型疫苗的研究提供基础.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2018(054)010【总页数】5页(P7-10,15)【关键词】犬细小病毒;VP2;活乳酸菌载体;原核表达【作者】段欣强;张洪亮;周保琨;杨瑞梅;单虎【作者单位】青岛农业大学动物医学院山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109;青岛农业大学动物医学院山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109;山东省即墨区畜牧兽医局,山东青岛266200;青岛农业大学动物医学院山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109;青岛农业大学动物医学院山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109【正文语种】中文【中图分类】S852.69犬细小病毒病(CPD),是由犬细小病毒(CPV)感染犬的一种致死性、急性、高传染性疾病。

CPV是细小病毒科,细小病毒属成员,该属成员有水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)等,相似性达到90%[1]。

犬细小病毒VP2基因的克隆表达与免疫印迹分析
陈胜男;马素贞;陶玉成;申卫红;刘腾飞;简子健
【期刊名称】《新疆农业大学学报》
【年(卷),期】2010(033)001
【摘要】根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,以细小病毒感染的犬粪样品中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增.把扩增产物克隆至pMD18-T载体进行测序、鉴定.将克隆的VP2基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,再将构建成功的原核表达质粒载体pGEX-4T-2-VP2转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行鉴定、测序、表达.结果表明,克隆的VP2基因片段全长1 755 bp,与13个VP2基因序列的同源性为98.4%～99.8%.系统进化树分析表明,所克隆的VP2 CSN830611序列同日本株(AB054222)、意大利株(AF306445)的进化途径一致.Western-blotting分析显示,表达产物为90 kD的融合蛋白,可被犬细小病毒阳性血清所识别,具有良好的反应原性.
【总页数】6页(P47-52)
【作者】陈胜男;马素贞;陶玉成;申卫红;刘腾飞;简子健
【作者单位】新疆农业大学,动物医学学院,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学,动物医学学院,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学,动物医学学院,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学,动物医学学院,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学,动物医学学院,乌鲁木
齐,830052;新疆农业大学,动物医学学院,乌鲁木齐,830052
【正文语种】中文
【中图分类】S851.659.2
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犬细小病毒单克隆抗体的制备和初步应用的开题报告一、研究背景犬细小病毒（CDV）是一种高度传染的病毒，可以引起犬类的免疫系统失调和多种疾病。

随着养犬数量的增加和犬场聚集性养殖的普及，CDV引起的犬瘟热病例数量不断上升。

因此，CDV的检测和治疗越来越受到重视。

目前，CDV的检测方法包括免疫荧光法、酶联免疫吸附测定法和聚合酶链反应法等。

其中，单克隆抗体是一种高度特异的检测试剂，可以用于CDV的快速鉴定。

二、研究目的本研究旨在制备CDV的单克隆抗体，用于CDV的鉴定。

三、研究内容和方法1. 收集CDV病毒株并获得CDV抗原我们将从犬类患者的病例中分离CDV病毒，并通过病毒培养和超速离心获得病毒粒子。

随后，我们将利用抗犬瘟热血清对病毒进行聚集，分离出CDV抗原。

2. 制备CDV单克隆抗体我们将采用杂交瘤技术制备CDV单克隆抗体。

具体方法如下：（1）将小鼠用CDV抗原免疫，刺激其免疫系统；（2）采集小鼠脾细胞并融合肿瘤细胞，形成杂交瘤；（3）筛选出能够特异性地结合CDV抗原的单克隆抗体。

3. 对CDV单克隆抗体进行初步应用我们将对制备出的CDV单克隆抗体进行初步应用，包括免疫荧光法和酶联免疫吸附测定法等。

四、预期成果与意义本研究将制备出高特异性、高灵敏度的CDV单克隆抗体，为CDV的迅速诊断提供可靠的工具。

同时，本研究也为其他病毒单克隆抗体的制备提供参考。

五、研究时间安排本研究计划在2年时间内完成，具体时间安排如下：第1年第1-4个月：研究背景和前期工作准备；第5-10个月：收集CDV病毒株并获得CDV抗原；第11-12个月：进行CDV单克隆抗体的制备。

第2年第1-6个月：对CDV单克隆抗体进行初步应用；第7-12个月：撰写毕业论文并进行答辩。

犬细小病毒VP2基因原核表达载体的构建与分析颜文卿;吴德峰;黄印尧;林永利;戴亚东;颜江华【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2006(035)001【摘要】从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamHI和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.【总页数】3页(P60-62)【作者】颜文卿;吴德峰;黄印尧;林永利;戴亚东;颜江华【作者单位】福建农林大学动物科学学院,福建,福州,350002;厦门大学抗癌研究中心,福建,厦门,361005;福建农林大学动物科学学院,福建,福州,350002;厦门出入境检验检疫局,福建,厦门,361012;福建农林大学动物科学学院,福建,福州,350002;福建农林大学动物科学学院,福建,福州,350002;厦门大学抗癌研究中心,福建,厦门,361005【正文语种】中文【中图分类】S852.65+5【相关文献】1.犬细小病毒HL-01株的分离鉴定及VP2基因真核表达质粒的构建 [J], 王玉玲;范京惠;边亚娟;张炳丽;唐丽杰;李一经2.犬细小病毒VP2主要抗原表位区的原核表达载体构建及诱导表达 [J], 马辉;赵绪永3.犬细小病毒VP2基因真核表达质粒的构建与瞬时表达 [J], 简子健;马素贞;陈胜男;翟少华;赵森4.犬细小病毒VP2基因乳酸菌表达载体的构建及蛋白检测 [J], 段欣强;张洪亮;周保琨;杨瑞梅;单虎5.三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 陈延宗;钱晶;王晶宇;赵航;毕振威;夏兴霞;诸玉梅;芮荣;王永山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬瘟热病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定冉皑;凌洪权;曾政;骆璐;吴胜昔;董春霞;李云;陈娅【期刊名称】《重庆理工大学学报:自然科学》【年(卷),期】2022(36)10【摘要】为了制备犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体,从而为建立CDV的诊断方法提供有效试剂。

将纯化后的CDV核蛋白作为免疫原注射至BALB/c小鼠腹腔中,取经4次长程免疫和1次加强免疫并达到融合标准的小鼠脾脏刮制成悬液,与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合制备杂交瘤细胞,利用间接ELISA 筛选,并对单抗进行生物特性鉴定。

结果表明:经过筛选后共获得2株可持续分泌抗CDV NP的单克隆细胞株,以3-3G、1-10B命名。

2株细胞株抗体经效价测定均可达到1∶2 048 000;经亚型鉴定,2株杂交瘤细胞均为IgG2型;经过protein A柱纯化,抗体纯度达到了90%以上;BCA法测得抗体浓度至少达2.78 mg/mL;通过Western blot鉴定,制备所得CDV NP单克隆抗体与纯化的CDV NP抗原在预期的60 kd处有蛋白免疫印迹条带。

该研究制备的单克隆抗体为后续犬瘟热的检测方法的研究奠定了基础。

【总页数】6页(P305-310)【作者】冉皑;凌洪权;曾政;骆璐;吴胜昔;董春霞;李云;陈娅【作者单位】重庆理工大学药学与生物工程学院;重庆市动物疫病预防控制中心【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.重组SARS-CoV核衣壳蛋白的表达纯化及其单克隆抗体的制备鉴定2.猪细小病毒核衣壳VP2蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定3.抗犬瘟热病毒重组核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定4.新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒南京株(CPV-GN)衣壳蛋白vp2基因的克隆与序列分析李希阳;缪勤;张汇东;张洪英;张海彬【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2007(29)8【摘要】通过对结构蛋白vp2基因序列的分析可以对犬细小病毒进行分型的确定.本文以常规PCR技术扩增犬细小病毒南京株CPV-GN衣壳蛋白VP2基因,并将之插入到pMD 18-T中,构建克隆载体pMD-vp2.经测序,目的片段长1 548 bp,编码516个氨基酸.与CPV-d、CPV-15、CPV-N等其它标准株和参考株进行序列比较,CPV-GN株vp2基因第1276碱基处发生了A→G替换,使天冬酰氨426变为天门冬氨酸,从而确定CPV-GN株为CPV-2b亚型;与其它CPV参考株CPV-2b亚型进行序列比较,CPV-GN株vp2基因第18、354、405、1465和1543碱基处的突变是独有的,在这几处分别发生了T→A、A→G、G→A、G→A和T→A替换.前三处替换并未改变所编码的氨基酸,而第1 465位的G→A点突变使缬氨酸489变为异亮氨酸,第1 543位的T→A点突变使丝氨酸515变为苏氨酸,推测这两处的突变很可能与该病毒株的毒力特性有关.【总页数】6页(P596-600,614)【作者】李希阳;缪勤;张汇东;张洪英;张海彬【作者单位】南京农业大学,动物医学院,江苏,南京,210095;公安部南京警犬研究所,江苏,南京,210012;公安部南京警犬研究所,江苏,南京,210012;南京农业大学,动物医学院,江苏,南京,210095;南京农业大学,动物医学院,江苏,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】S852.659;Q78L【相关文献】1.犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析 [J], 董江丽;李淑芬;张鹤龄2.犬细小病毒CPV-SHZ分离株VP2基因的克隆与序列分析 [J], 刘志强;钟发刚;王新华3.犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定 [J], 周宏专;苏霞;林路路;齐颀;张进;徐福洲;杨兵4.三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 陈延宗;钱晶;王晶宇;赵航;毕振威;夏兴霞;诸玉梅;芮荣;王永山5.犬细小病毒分离株VP2基因的克隆与序列分析 [J], 杨玲;徐向明;殷俊;宗卫峰;陈璐;李厚达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒NY株VP2蛋白多克隆抗体的制备与鉴定毛倩倩;崔尚金;周灵;唐青海;卜宾;唐存多;焦铸锦;姚伦广;阚云超;杨建伟【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)007【摘要】试验旨在制备犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2蛋白多克隆抗体。

构建 pET28a-CPV-VP2重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG 诱导,SDS-PAGE 鉴定融合蛋白的表达,纯化目的蛋白与佐剂混合、乳化制备后作为免疫原,免疫家兔制备 VP2蛋白多克隆抗体；采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)检测抗体的免疫活性、抗体滴度、病毒滴度及中和活性。

结果表明,重组 VP2蛋白(rVP2)以包涵体形式存在,分子质量约为72 ku；所制备的多克隆抗体滴度为1600倍,病毒滴度为107TCID50/mL,中和效价为1∶2884,该抗体与体外培养的 CPV 呈特异性反应,CPV VP2蛋白的多克隆抗体免疫活性和特异性良好,且中和活性高,为CPV基因工程疫苗的研究和临床治疗奠定了基础。

%This study was aimed to prepare canine parvovirus (CPV)VP2 protein polyclonal anti-body.The recombinant expression vector pET28a-CPV-VP2 was constructed and transfromed into E.coli BL21 (DE3),the expression of recombinant proteins was induced by IPTG from which the fusion protein was identified by SDS-PAGE.The target protein was purified and emulsify with ad-j uvant,the prepared immunogen was inoculated into rabbit by subcutaneous inj ections to prepare of VP2 protein specific polyclonal antibody.The immuno-activity,titers,neutralization titers of the prepared polyclonal antibody weredetermined by immunoperoxidase monolayer assay (IPMA).The results showed that the expressed recombinant protein VP2 (rVP2)existed in the form of inclusion body with a molecular weight of 72 ku.The prepared polyclonal antibody titer was 1 600 dilution,the virus titer was 107 TCID50/mL,the neutralizing titer was 1∶2 884.The antibodies showed specific reaction with CPV.In conclusion,rVP2 specific polyclonal antibody showed wonderful immunocompetence,specificity and neutralizing activity,providing foundation for the development of genetic vaccine and clinical therapeutic method.【总页数】8页(P1659-1666)【作者】毛倩倩;崔尚金;周灵;唐青海;卜宾;唐存多;焦铸锦;姚伦广;阚云超;杨建伟【作者单位】南阳师范学院，南阳市兽医生物工程技术研究中心，河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，昆虫生物反应器河南省工程实验室，南阳 473061;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193;吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118; 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193;南阳师范学院，南阳市兽医生物工程技术研究中心，河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，昆虫生物反应器河南省工程实验室，南阳 473061;南阳师范学院，南阳市兽医生物工程技术研究中心，河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，昆虫生物反应器河南省工程实验室，南阳 473061;南阳师范学院，南阳市兽医生物工程技术研究中心，河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，昆虫生物反应器河南省工程实验室，南阳473061;南阳师范学院，南阳市兽医生物工程技术研究中心，河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，昆虫生物反应器河南省工程实验室，南阳 473061;南阳师范学院，南阳市兽医生物工程技术研究中心，河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，昆虫生物反应器河南省工程实验室，南阳 473061;南阳师范学院，南阳市兽医生物工程技术研究中心，河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，昆虫生物反应器河南省工程实验室，南阳 473061;南阳师范学院，南阳市兽医生物工程技术研究中心，河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，昆虫生物反应器河南省工程实验室，南阳473061【正文语种】中文【中图分类】S852.65+5【相关文献】1.犬细小病毒NY株VP2蛋白的原核表达及反应原性鉴定 [J], 毛倩倩;卜宾;唐青海;阚云超;姚伦广;唐存多;焦铸锦;杨建伟2.一株抗猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定 [J], 张泉;张元峰;黄丽;王胜男;蔡雪辉;熊涛;翁长江3.A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备 [J], 张永宁;张舟;诸明欣;梅琳;王彩霞;吴绍强;林祥梅4.犬细小病毒南京株VP2蛋白免疫原性片段的克隆表达 [J], 李希阳;缪勤;张爱华;张洪英;张汇东;张海彬5.表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定 [J], 谢之景;夏咸柱;扈荣良;杨松涛;邹啸环;黄耕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及其应用一、本文概述犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus，CDV）是一种高度接触性、传染性的病毒性疾病，对犬科动物的生命健康构成严重威胁。

由于其感染范围广、传播速度快、致死率高，犬瘟热病毒的防控一直是动物医学领域的研究热点。

单克隆抗体技术作为一种重要的生物学工具，在病毒性疾病的诊断、治疗和预防等方面具有广阔的应用前景。

本文旨在阐述犬瘟热病毒单克隆抗体的制备过程、纯化方法、特性鉴定及其在疾病诊断、治疗中的应用，以期为犬瘟热病毒的防控提供新的思路和技术支持。

通过本文的介绍，读者可以对犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及其应用有一个全面、深入的了解，为相关领域的研究和实践提供有益的参考。

二、材料与方法1 细胞株与病毒：选用经过验证的、可稳定产生犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus, CDV）的细胞株，以及纯化的犬瘟热病毒颗粒。

3 试剂：包括细胞培养基、胎牛血清、聚乙二醇（PEG）、HAT和HT培养基添加剂、酶标二抗、底物等。

4 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、酶标仪、超净工作台等。

1 免疫小鼠：将纯化的犬瘟热病毒颗粒注射到小鼠体内，按照预定的免疫方案进行多次免疫，以刺激小鼠产生足够的免疫应答。

2 细胞融合：取免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，利用聚乙二醇（PEG）作为融合剂，在适当的条件下进行细胞融合。

3 杂交瘤细胞的筛选与克隆：通过HAT和HT培养基选择性地筛选出能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞，并进行克隆化培养。

4 单克隆抗体的制备：对筛选出的杂交瘤细胞进行扩大培养，收集细胞上清液，通过亲和层析等方法纯化单克隆抗体。

5 单克隆抗体的鉴定：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法对制备的单克隆抗体进行特异性、亲和力等指标的鉴定。

26 单克隆抗体的应用：将制备的单克隆抗体应用于犬瘟热病毒的检测、诊断、免疫学研究等领域，评估其实际应用效果。

贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析陈强;嵇辛勤;段志强;阮涌;雷云;龙丹丹;胡焱;万彪【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)004【摘要】This study was aimed to investigate popular genotype and phylogenesis of VP2 gene of canine parvovirus (CPV) in Guiyang area.Ten strains of viruses were isolated from Guiyang and the VP2 gene was amplified by PCR, cloned and sequenced.Results showed that the isolate virus grew could produce typical CPE in F81 cells, seven strains of CPV were CPV type 2a and others were CPV type 2c, named as GY-1 to GY-10.The nucleotide homologies of the isolated strains compared with 3 vaccine strains were 98.4% to 99.4%, with others reference strains nucleotide homologies within 97.7% to 99.9%.This research firstly reported the prevalence of CPV genotype was CPV type 2a in Guiyang area with such CPV type 2c, this was very important for monitoring the trend of CPV genetic variation and the development of vaccine.%为研究贵阳地区犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的流行基因型及其遗传进化情况,本试验对从贵阳市分离的10株CPV的VP2基因进行PCR扩增和克隆并进行序列分析.结果显示,分离的病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变(CPE),分离的10株病毒中,7株为CPV-2a亚型,3株为CPV-2c亚型,命名为GY-1~GY-10.10株CPV分离株与疫苗株VP2基因的同源性98.4%~99.4%,与其他国内外参考株的同源性为97.7%~99.9%.本试验首次报道贵阳市CPV的流行基因型为CPV-2a亚型并伴随CPV-2c亚型存在,对监测CPV遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义.【总页数】8页(P1061-1068)【作者】陈强;嵇辛勤;段志强;阮涌;雷云;龙丹丹;胡焱;万彪【作者单位】贵州大学动物科学学院,贵阳 550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州省动物疫病研究室,贵阳 550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵阳 550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州省动物疫病研究室,贵阳 550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵阳 550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州省动物疫病研究室,贵阳 550025【正文语种】中文【中图分类】S852.65+5【相关文献】1.犬细小病毒山东分离株VP2基因的克隆与遗传变异分析 [J], 于永乐;张传美;张倩;杨海燕;杨瑞梅;张洪亮;单虎2.犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析 [J], 王洋;胡博;鲁荣光;吕爽;赵辉;廉士珍;闫喜军3.犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析 [J], 卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平4.南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析 [J], 徐闰;黄华旭;徐小明;李政泰;马麟;劳小香;吴显实5.犬细小病毒VP2基因的克隆与生物信息学分析 [J], 叶新慧;申魁魁;符欣蕙;王丽霞;李恭贺;张明;卢晟盛;卢克焕;郑喜邦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒VP2基因测序分析李世静;嵇辛勤;主性;阮涌;傅心亮;王修江【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2013(034)006【摘要】为了解贵阳市犬细小病毒(CPV) VP2基因的遗传变异情况,从贵阳市黔灵动物医院采集经试剂盒检测为阳性的患犬粪便13份,对粪样进行病毒DNA的提取,并以此DNA为模板,进行PCR扩增,随机选取3株PCR阳性产物对其VP2基因进行序列测定与遗传变异分析.结果显示,抗原快速检测试剂盒与PCR检测结果符合率达76.9％；3个试验毒株之间VP2基因同源性达96.5％～97.3％,与参考毒株同源性为95.2％～96.8％；由遗传进化树可见,与国内分离毒株的亲缘性略高于国外分离株.结果表明,CPV抗原快速检测试剂盒与PCR法符合率较高,3个试验毒株与国内外流行毒株之间差异性不大.【总页数】5页(P96-100)【作者】李世静;嵇辛勤;主性;阮涌;傅心亮;王修江【作者单位】贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵阳市黔灵动物医院,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2【相关文献】1.山东地区水貂肠炎病毒VP2基因的克隆和测序分析 [J], 陈童;杨瑞梅;单虎2.犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析 [J], 赵屹钦;曾梦颖;郭娟;张迪;高洪;严玉霖3.犬细小病毒临床分离株VP2基因进化分析 [J], 温峰琴;项海涛;郝宝成;邢小勇;包世俊;胡永浩4.犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定 [J], 周宏专;苏霞;林路路;齐颀;张进;徐福洲;杨兵5.三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 陈延宗;钱晶;王晶宇;赵航;毕振威;夏兴霞;诸玉梅;芮荣;王永山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

成都地区犬细小病毒VP2基因克隆分析及基因型鉴定杨晓农;王成东;项振义;王斌;张焕容;杨发龙;于学辉;龙虎;刘群;陈世界;严玉宝;余华【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2011(38)9【摘要】According to the canine parvovirus(CPV) VP2 gene sequences in GenBank,two pairs of primers 1F/1R and 2F/ 2R were designed and synthesized. Taking the DNA extracted from the feces samples of dogs suspected to be infected with CPV as templates,two fragments covering VP2 gene with the length of 1325 and 758 bp were amplified respectively,after cloning and sequencing of the two fragments, eleven complete VP2 gene sequences with the length of 1755 bp were obtained through splicing. The analysis of nucleotide homology showed that compared with 21 reference strains of CPV at home and a-broad in GenBank.the nucleotide homologies of these eleven VP2 gene sequences were from 96. 2% to 99. 8%. By using the DNAStar software, the B cell epitopes of VP2 protein were predicted to be in the sections of Metl-Val38, Met73-Val82, Met96-Alal03, Lys151-Thrl70, Gly235-Phe243, Leu294-Phe303, Ala359-Thr399, IIe469-His483, Ala503-Arg520 and Lys570-Tyr584. Compared with the amino acid sequences of the reference CPV strains, the amino acid residues at the sites of 426 and 555 of the VP2 protein coding by these eleven VP2 genes were Asp and Val respectively, which indicated that the genotypes of these eleven CPV were all CPV type 2a and alsoprimarily proved that the CPV-2a was the main prevalent strain in Chengdu area.%根据GenBank中犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2基因序列设计合成两对特异性引物1F/1R和2F/2R,从疑似_CPV感染病犬的粪便病料中提取DNA作为模板,分段扩增涵盖VP2基因的两个片段,大小分别为1325和758 bp,并进行克隆、测序,通过拼接得到11条长度为1755 bp的VP2基因完整序列.核苷酸同源性分析表明,扩增得到的11个完整VP2基因序列与GenBank中发布的21株国内外参考毒株比较,核苷酸同源性为96.2％～99.8％.采用DNAStar软件分析,预测VP2蛋白可能成为B细胞表位的区段位于Metl-Va138、Met73-Va182、Met96-Ala103、Lys 151-Thr170、Gly235-Phe243、Leu294-Phe303、Ala359-Thr399 、Ile469-His483、Ala503-Arg520、Lys570-Tyr584.将扩增获得的VP2基因编码的氨基酸序列与CPV参考毒株进行比较,第426位和第555位氨基酸残基分别为Asp和Val,鉴定出本试验得到的CPV基因型均为2a型,初步证实成都地区仍以CPV-2a为主要流行毒株.【总页数】6页(P105-110)【作者】杨晓农;王成东;项振义;王斌;张焕容;杨发龙;于学辉;龙虎;刘群;陈世界;严玉宝;余华【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;成都大熊猫繁育研究基地,四川成都610081;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;四川出入境检验检疫局,四川成都610041;四川出入境检验检疫局,四川成都610041;四川出入境检验检疫局,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析 [J], 董江丽;李淑芬;张鹤龄2.鸡传染性支气管炎病毒地方-分离株S1基因克隆和基因型鉴定 [J], 祁贤;叶向阳;张婉华;朱永军;步志高;刘思国3.犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析 [J], 卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平4.犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定 [J], 周宏专;苏霞;林路路;齐颀;张进;徐福洲;杨兵5.18个甘肃地方梨品种S基因型鉴定及新S-RNase基因克隆 [J], 徐非凡;衡伟;周宏胜;张绍铃因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。