木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告

木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究木瓜蛋白酶（Papain）是一种广泛存在于木瓜中的天然酶，具有优异的蛋白水解能力和广泛的应用领域。

对于木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法的研究，可以为其在食品、药物和生物技术等领域的应用提供重要的理论和实践基础。

纯化木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。

首先，通过将木瓜果肉或木瓜乳剂进行初步的提取和分离，得到粗木瓜酶液或浓缩液。

接下来，通过酸性、碱性或酶处理等方法，将杂质蛋白质去除，然后经过一系列的层析纯化步骤，最终获得纯度较高的木瓜蛋白酶。

其中，离子交换层析是最常用的纯化方法之一。

离子交换层析是根据蛋白质与固定在固定相上带电的离子交换基团之间的相互作用进行纯化的。

通常使用阳离子交换剂如DEAE-Sepharose CL-6B或阴离子交换剂如CM-Sepharose CL-6B作为固定相，可实现木瓜蛋白酶与其他蛋白质之间的分离。

通过控制缓冲液的pH和离子强度，可以调节木瓜蛋白酶在层析柱上的吸附和洗脱，从而实现对其的纯化。

凝胶过滤层析是另一种常见的纯化方法，其基本原理是根据蛋白质分子大小的差异进行纯化。

凝胶过滤层析对分子量较大且较纯的蛋白质具有较好的分离效果。

在纯化木瓜蛋白酶时，可以选择适当的凝胶过滤层析介质，如Sephadex G-75或Sephadex G-100等，将混合溶液在凝胶柱上进行层析，分离出目标蛋白质。

除了纯化方法的研究外，正确鉴定木瓜蛋白酶的纯度和活性也是非常重要的。

鉴定木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：SDS-PAGE电泳、活性测定和质谱鉴定等。

其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分子量分析方法，它可将蛋白质按照分子量大小进行分离和定量。

通过在分离凝胶上染色或通过Western blotting方法检测，可以确定木瓜蛋白酶的纯度和分子量。

活性测定是评价木瓜蛋白酶酶活性的重要手段。

常用的活性测定方法包括卟啉-酪蛋白分光光度法、酪蛋白分解能力法等。

食品添加剂木瓜蛋白酶学院:食品与营养工程学院专业:食品加工班级:食工102学号:010*******姓名:王瑞真木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类疏基蛋白酶。

广泛存在与番木瓜的根、茎、叶和果实内，在未成熟的乳汁中含量最丰富。

它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特色，因此在食品、医药、饲料、皮革及纺织等行业得到广泛应用[1]。

一、木瓜蛋白的组分工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。

由木瓜乳胶提取粗制酶,除含有木瓜蛋白酶外,还含有半耽氨酸蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、谷氨酞胺以及低相对分子质量的疏基化合物,还有葡萄糖酶等。

其中大部分都是疏基蛋白酶,主要的两种组分是木瓜凝乳酶和木瓜蛋白酶[2]。

二、木瓜蛋白的结构木瓜乳汁中四种已知半肤氨酸蛋白酶的一级结构具有高度同源性,其氨基酸数目和同源性比较如表1所示。

除chymopapain含有8个半肤氨酸外,其余三种酶都只含有7个半肤氨酸。

25位的流基是活性位点,不参与二硫键的形成（chymopapain的117位琉基也不参与二硫键的形成 ）,其余疏基以相同的方式形成三个二硫键，具有同样的保守性。

人们在不同清晰下得到了四种酶的X 一射线结构。

四种酶的肤链折叠方式相似,形成两个大小相、构型不同的区域。

一个是由a一螺旋构成的L一区,另一个是由大量反向平行的片层构成的R一区。

活性位点氨基酸残基Cys25,Asn179和His159 就位于这些区域的表面,其中Cys25位于 L一区,起始a一螺旋上。

木瓜蛋白酶家族的Cys25 ，Gly23，Gly65 形成的S。

亚部位是一个大口袋，对底物专一性影响较小；S亚部位由于酶不同其氨基酸组成不同,几何形状亦不同,对酶的性质影响较大[3]。

三、木瓜蛋白酶的提取工艺1.过去的常规提取方法木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。

木瓜汁中提取木瓜蛋白酶一、粗酶制备（冻存、调整浓度）1.蛋白质浓度（考xx蓝法）二、纯化和固定化1.双水相（PEG/磷酸盐）萃取，再过阳离子纯化；2.粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化（咪唑梯度洗，电泳看效果）；3.先双水相，取PEG相（上清）用亲和磁珠纯化和固定化；三、纯度1.快速蛋白质液相色谱；2.非变性碱性蛋白质电泳；四、酶活性1.水解酪蛋白活性（固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重复使用）；2.水解IgG检测特异性；五、载体/相表征亲和磁珠：TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外；双水相：一、xx木瓜制备粗酶[1,2]1.新鲜的木瓜用去离子水洗干净，再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵向2-3mm深的切口，让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。

-20 ℃存放。

（或者10mL汁液加90mL pH 6.0的PBS，搅拌15min，4℃9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。

）2.将解冻后的乳胶与40mM半胱氨酸按3:1(w/v)的比例混合，用6MHCl将悬浮液调整为pH 5.6，在4 ℃搅拌15 min，过滤并用6 M NaOH将滤液pH调整为9.0，4 ℃ 9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定上清中的蛋白质含量，然后用水/PBS调节。

可省略。

3.[1]NitsawangS,Hatti-KaulR,KanasawudP.PurificationofpapainfromCaricapapayalatex:Aqueoustwo-phaseextractionversustwo-stepsaltprecipitation[J].Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioningprocess to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.。

实验一木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。

二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。

木瓜蛋白酶最适pH随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适pH为7。

据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在pH7.2的磷酸缓冲液、35℃条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在275nm处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。

考马斯亮蓝G-250在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm 处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。

2、试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）；1%的酪蛋白溶液：称1g的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配至100mL；激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称10g的TCA定容至100 mL；考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100mL，用蒸馏水定容到1000mL。

3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。

四、实验步骤1．木瓜乳的采集选取挂果30天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约3mm的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。

一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。

2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。

3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。

二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。

木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。

本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。

三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。

（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。

（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。

（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。

2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。

（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。

（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。

3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。

木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法木瓜蛋白酶（papain）是一种天然的蛋白酶，广泛应用于食品、制药等行业中。

其提取与分离纯化的方法可以分为以下几个步骤：1.选择合适的木瓜品种：不同品种的木瓜蛋白酶活性不同，因此选择具有较高酶活性的木瓜品种对提取纯化效果至关重要。

2.酶源准备：将选好的木瓜切成小块，去掉果肉，保留果实中的细胞浆和硬实质。

然后将木瓜块浸泡于缓冲液中，以提取木瓜蛋白酶。

3.离心分离：将浸泡木瓜块的混合液进行离心分离，以去除果肉等杂质，得到较为纯净的木瓜蛋白酶液。

4.澄清液处理：将离心分离得到的液体通过滤纸或滤膜进行澄清，去除悬浮的固体颗粒。

5.蛋白酶的分离：通过离心、超滤、透析等手段，将木瓜蛋白酶与其他蛋白质分离，得到较为纯净的蛋白酶液。

6.结晶纯化：可以采用醇沉淀、浓缩、结晶等方法对蛋白酶进行纯化。

其中，醇沉淀方法是常用的分离纯化方法之一，通过醇的添加，使蛋白酶蛋白质聚集并沉淀下来，然后进行洗涤、溶解等操作，最终得到纯净的木瓜蛋白酶。

7.洗脱：将获得的木瓜蛋白酶溶解于缓冲液中，使其达到所需的适宜酶活性和稳定性。

8.酶活性测定：用适当的方法测定提取分离纯化后的木瓜蛋白酶的活性，以确定其纯化程度和活性。

需要注意的是，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化过程中，应注意保持温度、pH值等参数的控制，以防止酶的失活或蛋白质的降解。

同时，在纯化过程中需要使用无菌操作，以防止细菌、病毒等污染物的引入。

总结起来，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法包括酶源准备、离心分离、澄清液处理、蛋白酶的分离、结晶纯化、洗脱和酶活性测定等步骤。

通过合理的步骤设置和操作，可以得到较为纯净、高活性的木瓜蛋白酶，以满足工业和科研的需求。

木瓜蛋白酶的提取一、实验内容与目的从青木瓜中提取木瓜蛋白酶，用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。

通过本实验，掌握天然活性化合物的提取和蛋白质浓度的测定技术。

二、实验原理（一）木瓜天然酶木瓜蛋白酶（papain），简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。

他是一种含硫基（—SH）肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，它还具有合成功能，能把蛋白质水解物合称为蛋白质。

木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇。

氯仿和乙醚等有机溶剂。

其最适pH为5.7（一般3~9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适温度为55~60℃（一般10~85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，受还原性物质激活。

木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜（Carica papaya）茎叶和果实中，以未成熟果实的乳汁中为最高。

提取未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼可得纯天然生物酶制品。

（二）考马斯亮蓝结合法（Bradford法）测定蛋白质浓度的原理在一定范围内，考马斯亮蓝G250蛋白复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量关系呈线性关系，故可以用蛋白质浓度的测定。

三、实验材料1.材料青木瓜2.试剂氢氧化钠、磷酸、考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、95%乙醇3.主要仪器设备离心机、磁力搅拌器、刀片、电子天平、紫外可见分光光度计、冰箱、pH计。

四、实验步骤（一）木瓜蛋白酶的提取（1）用薄不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜过时的纵线将果皮割破，深度为2~3nm，根据果实大小的不同，每个果实可以切5~10条刀口。

（2）将木瓜放于一个大烧杯中，适度挤压木瓜，使木瓜乳汁流入大烧杯中。

（3）将手机的乳液按1:1量加入蒸馏水，搅拌1h，用NaOH将pH调至9.0。

（4）将乳液用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。

第２７卷第５期肇庆学院学报Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．５２００６年１０月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＺＨＡＯＱＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯｃｔ．２００６收稿日期：２００５－１２－２９作者简介：李妍（１９７８－），女，黑龙江肇东人，肇庆学院轻工化学系副教授，博士．木瓜蛋白酶的分离纯化———关于食品生物化学综合设计性实验的构思李妍，黄志明（肇庆学院轻工化学系，广东肇庆５２６０６１）食品生物化学是食品专业本科学生的一门专业基础课，为了将这门课的理论教学与实际应用结合起来，需要开设大量的实验课．目前已开设的实验多为基础验证性实验，为了强化学生分析和解决问题的能力，有必要在该课程实验中增加综合设计性实验．木瓜蛋白酶是一类巯基蛋白酶，广泛地存在于番木瓜（Ｃａｒｉｅａｐａｐａｙａ）的茎叶和果实中，未成熟的乳汁中含量最高．因其含量高、稳定性好、蛋白水解能力强，对多种蛋白质均具有很好的降解作用，目前已被广泛应用于各个行业［１］．在食品中，木瓜蛋白酶被用于肉类嫩化、啤酒澄清和鱼类加工等工艺中．由于此酶为纯天然产物，其开发前景广阔．在本科实验中引入这一综合设计性实验，可以使学生通过实验熟悉酶和蛋白质的提取与纯化方法，掌握相关的实验技能和实验手段，加深对理论知识的理解和学习．１综合设计性实验的内容１．１木瓜蛋白酶粗酶的分离制备实验以未成熟的木瓜为原料．木瓜蛋白酶是一种胞外酶，能分泌到乳汁中，可直接将木瓜乳汁进行低温真空干燥，再经粉碎就可以得到木瓜蛋白酶的粗品．为了避免干燥过程中木瓜蛋白酶失活，可在木瓜乳汁中加入适量的保护剂，保护木瓜蛋白酶中的活性巯基，常用的保护剂有ＥＤＴＡ、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等．本实验的关键是选择适宜的保护剂．教师可指导学生通过查阅文献，对保护剂的种类和使用量进行筛选，以保证良好的分离效果．实验可以粗酶的提取率和酶的比活力作为评价指标．１．２粗酶的纯化粗酶中除了含有木瓜蛋白酶外，还含有其他的蛋白质和小分子物质，需要通过盐析等方法对其进一步纯化．对于木瓜蛋白酶纯化的研究报道也较多，乙引等［２］对木瓜乳汁进行真空干燥，用（ＮＨ４）２Ｓ０４沉淀方法分别得到了木瓜蛋白酶的粗品和精品．本实验选择饱和硫酸铵盐析法纯化木瓜蛋白酶，纯化期间仍要注意对酶活性的保护．盐析是目前常用的蛋白质分离技术，采用这种方法进行酶的纯化，不仅可将酶与蛋白质联系起来，而且可以使学生掌握蛋白质分离常用方法的原理和操作步骤．盐析是通过中和蛋白质表面的电荷和破坏蛋白质的水化层实现分离，实验的关键是饱和硫酸铵添加浓度的确定．学生不仅要通过查阅资料确定实验条件，还要了解分离原理，以便对实验进行充分的准备．在此基础上，学生还要学摘要：针对食品生物化学课的实际情况，提出了开设综合设计性实验的思路，初步给出了木瓜蛋白酶分离纯化实验的内容，旨在为今后的实验提供理论指导．关键词：食品生物化学；综合设计性实验；酶的分离纯化中图分类号：Ｇ６４２文献标志码：Ａ文章编号：１００９－８４４５（２００６）０５－００３６－０３第５期李妍等：木瓜蛋白酶的分离纯化３７会积极思考，注意实验操作过程中的问题和细节，以逐渐增强科研意识及解决问题的能力．１．３木瓜蛋白酶性质的测定得到纯化酶后，需要对其性质进行测定．首先，通过蛋白质的凝胶电泳测定蛋白质的分子量分布，电泳是基于蛋白质的两性解离和等电点的性质加以分离的方法．实验中应用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳，对上述不同分离阶段的酶样均进行测定，比较纯化的效果．根据实验中应用的已知分子量的蛋白质和木瓜蛋白酶对照样，可以推算分离得到的木瓜蛋白酶的分子量情况．在实验过程中，需要学生配制电泳用分离胶和浓缩胶，要灌胶、操作电泳仪，并进行胶的染色和脱色．由此加深学生对电泳原理、电泳仪操作原理和方法的了解，掌握电泳法测定蛋白质分子量的一般操作步骤，发现并解决实验过程中出现的问题．根据实验不同分离阶段所得样品的电泳带，学生可以直观地看到酶纯化的情况．木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，本实验中要对木瓜蛋白酶的自由巯基进行测定，我们采用ＤＴＮＢ（硝基苯甲酸二硫化合物），反应后测定产物在４１２ｎｍ的吸光度．这是测定半胱氨酸巯基的常用方法．１．４蛋白质浓度和木瓜蛋白酶酶活力的测定方法蛋白质浓度可以采用Ｆｏｌｉｎ－酚比色法、考马斯亮蓝比色法和双缩脲比色法进行测定，相比而言，双缩脲比色法的灵敏度要低于前２种方法．本实验选用考马斯亮蓝比色法进行蛋白质含量的测定，显色后测定波长为５９５ｎｍ．此方法不受酚类、游离氨基酸和小分子肽的影响，在０．０１～１．０ｇ6Ｌ蛋白质含量范围内均可使用．木瓜蛋白酶活力的测定采用酪蛋白为底物，加入酶的保护剂，用Ｆｏｌｉｎ－酚试剂显色，测定６８０ｎｍ波长下的吸光度后计算得到酶活力．酶的比活力是指酶总活力与蛋白质含量的比值．蛋白质和酶是食品生物化学课中２项重要的内容．通过这部分实验，不仅可以使学生熟悉测定蛋白质浓度和酶活力的方法，而且可以将实验现象与课本的理论知识结合起来，提高学生学习的积极性和效率．２开设综合设计性实验的意义综合设计性实验是将基础理论知识与多种实验技能和方法归纳、分析并相互渗透的一种有效的实验形式．它在一定程度上弥补了传统实验的缺陷，具体说来，它有以下特点：实验技能的综合性、实验操作的独立性和实验过程的可思考性［３］．开设综合性实验的意义有如下５点．１）增加理论教学与实践的联系，培养学生应用知识的能力．综合性实验的开设，既可使学生将理论知识通过实验与应用过程结合起来，还可使他们将本来分散的知识块联系起来，将各部分的学习通过实验有效地融合在一起，从而强化他们对这门课的整体认识和应用能力．木瓜蛋白酶的分离纯化实验就综合了多方面知识，包括蛋白质含量测定、分离纯化方法和酶活力测定等内容，而且涉及的理论均为本课程的重点知识，这有利于激发学生对理论知识学习的兴趣，从而达到更好的学习和应用效果．２）多种实验过程综合，增强了学生的综合实验操作技能．传统实验多针对某一部分的知识进行实验应用，而综合设计性实验是将多个部分的知识有机地串联起来，给予学生综合实验技能的训练．开设上述实验，既能有效利用实验室的现有资源，还能将多个实验结合起来训练学生的综合技能，有利于提高学生的综合素质．３）学生独立设计完成实验，增强了学生的科学研究意识．通过实验，学生开始能够灵活运用所学知识分析和解决实际问题，同时提高了他们通过查阅资料获取信息的能力，培养了学生独立、认真、严谨的科研和工作态度．在上述实验中，学生需要通过查阅资料选择实验参数，设计实验方案，还要独立开展物质的制备及性质分析．这使学生了解了科学研究的一般程序，提高了对科学研究的肇庆学院学报第２７卷３８认识和兴趣，为今后的研究和工作打下坚实的基础．４）培养了学生的创新性．木瓜蛋白酶分离纯化实验是目前食品科学领域研究的热门问题，它的开设有利于培养学生的开拓和创新精神．综合设计性化学实验的开设方式打破了多年来传统实验教学模式的禁锢，改变了过去各基础实验自成体系、相互脱节的状况，有利于增强学生的现代实验意识和创新意识，对贯彻素质教育和实现学生的全面发展具有重要意义．５）强化了学生的语言文字表达能力．综合实验的目标是将理论知识与实际操作进行有机结合，因此实验报告中应包括对实验结果和存在问题的讨论，还应指出改进实验方案的措施．学生在提出问题和论述观点的过程中，语言文字表达能力得到了训练和强化．３结语木瓜蛋白酶来源于木瓜，而木瓜目前主要作为食物来食用，对于其中存在的蛋白酶进行分离、纯化和检测，恰好属于食品生物化学研究的范畴．在木瓜蛋白酶分离纯化这个综合设计性实验中，涉及到多个生物化学的常用实验技术，这一实验对学生实验技能的训练是综合的、多方面的，而且实验以学生为主体，能以一种更为直观能动的方式使学生达到学习的目的．当然，学生在实验过程中还需要教师的指导、协助，教师要负责编写实验指导书、审定实验方案和准备工作，使学生能够顺利开展实验．此外，教师还要对学生进行实验方向的指导并修改学生的实验报告，这样才可保质保量地开设综合设计性实验．实验教学是高等教育的一个重要环节，综合设计性实验的开设不仅是培养研究型和应用型人才的基本需要，而且是高等教育改革的重要内容，对高校教育水平的提高具有重要的现实意义．参考文献：［１］邓静，吴华昌，周健．木瓜蛋白酶研究进展［Ｊ］．广西轻工业，２００３（３）：５－７．［２］乙引，张显强，唐金刚，等．木瓜蛋白酶的纯化和性质［Ｊ］．贵州师范大学学报：自然科学版，２００２，２０（ｌ）：１１－１４．［３］黄丽群，彭悦．综合设计性化学实验探讨［Ｊ］．江西化工，２００４（４）：６９－７８．ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰａｐａｉｎ—ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＤｅｓｉｇｎｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｒｏｊｅｃｔｏｆＦｏｏｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ——ＬＩＹａｎ，ＨＵＡＮＧＺｈｉｍｉｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＺｈａｏｑｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＺｈａｏｑｉｎｇ５２６０６１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｄｅｓｉｇｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｒｏｊｅｃｔｈａｓｂｅｅｎｐｒｏｐｏｓｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏａｃｔｕａｌｓｉｔｕａｔｉｏｎｏｆｆｏｏｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｃｏｕｒｓｅ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｐａｉｎｈａｖｅｂｅｅｎｓｉｍｐｌｙｌｉｓｔｅｄ．Ｉｔｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｙｇｕｉｄｅｆｏｒｆｕｔｕｒｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｏｏｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｄｅｓｉｇｎｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅ（责任编辑：陈静）。

实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。

是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。

现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。

木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。

它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。

有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。

有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。

使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。

高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。

硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。