实验64_尼龙固定化木瓜蛋白酶(何平)

木瓜蛋白酶的固定方法摘要：木瓜蛋白酶[ EC 3. 4. 22. 2 ]是一种重要的生化产品，在食品、医药工业中有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域[ 1 ]。

由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。

此研究始于20世纪60年代初, 至今已有许多文献报道[ 2 ] 。

酶的固定化方法主要有：包埋法、吸附法、共价键结合法、交联法等,这些方法各有利弊[ 3 ]。

木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。

是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。

它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。

最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

一、木瓜蛋白酶的固定方法1包埋法固定包埋法:将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中,使酶固定化的方法称为包埋法。

凝胶包埋法是将酶包埋在各种凝胶内部的微孔中,制成一定形状的固定化酶的方法。

最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。

微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中,制成微胶囊固定化酶的方法。

1. 1 海藻酸钠- 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶( Immobilized papain on sodium alginate - chitosan,IPSAC)海藻酸是从褐藻提取的,是甘露糖醛酸以β-1, 4键相连接的多糖类物质,它是包埋酶较为理想的载体,其固定化方法较为简单,条件温和,操作可在室温下进行,酶很少失活。

高分子膜载体固定化木瓜蛋白酶吸附动力学
夏葵;曾虹燕;杨常桥;王橙;赵芳芳
【期刊名称】《高分子材料科学与工程》
【年(卷),期】2009(25)11
【摘要】采用静态吸附法研究了高分子膜载体尼龙6固定化木瓜蛋白酶的吸附特性,从热力学和动力学角度探讨了吸附机理。

结果表明,等温吸附过程符合Freundlich模型,283 K、pH 6.0时,尼龙6对木瓜蛋白酶的饱和吸附量为1.692 mg/g。

动力学吸附过程符合准二级动力学方程,在283 K2、93 K和303 K时,平衡吸附量的计算值(qe,cal)分别为1.778 mg/g、1.780 mg/g和1.800 mg/g,与实验值接近。

【总页数】4页(P49-52)
【关键词】尼龙6;木瓜蛋白酶;动力学;热力学
【作者】夏葵;曾虹燕;杨常桥;王橙;赵芳芳
【作者单位】湘潭大学化工学院生物技术研究所
【正文语种】中文
【中图分类】TB383
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琳;杨旭;邓乐
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热带亚热带植物学报　2008,16(4):334～338Journal of Tr op ical and Subtr op ical Botany收稿日期:2007-05-23 接受日期:2008-04-09基金项目:国家自然科学基金项目(10074016);广东省自然科学基金项目(7006655)资助3通讯作者Corres ponding author木瓜蛋白酶的固定化及其性质研究何平1,黄卓烈13,黎春怡2,巫光宏1,初志战1,詹福建1(1.华南农业大学生命科学学院,广州510642; 2.茂名职业技术学院,广东茂名525000)摘要:在海藻酸钠2壳聚糖固定化木瓜蛋白酶(i m mobilized papain on s odiu m alginate 2chit osan,I PS AC )的实验中,当给酶量为1mg g 21载体时,酶活性为39.2U,酶活力回收为21.1%。

在尼龙布固定化木瓜蛋白酶(i m mobilizedpapain on nyl on,I P N )的实验中,当每块尼龙布(3c m ×3c m )给酶量为1mg 时,酶活性为35.6U,酶活力回收为19.2%。

木瓜蛋白酶(papain,P A )、I PS AC 、I P N 的最适pH 分别为7.2、7.2和6.8。

P A 及I PS AC 在70℃以下活性稳定;I P N 在50℃以下活性稳定。

I PS AC 与I P N 半衰期分别为59d 和66d 。

关键词:木瓜蛋白酶;固定化酶;海藻酸钠;尼龙布中图分类号:Q946.563文献标识码:A文章编号:1005-3395(2008)04-0334-05Studi es on Immobili zati on of Papa i n and the Properti es ofImmobili zed Enzy meHE Ping 1,HUANG Zhuo 2lie 13,L I Chun 2yi 2,WU Guang 2hong 1,CHU Zhi 2zhan 1,ZHAN Fu 2jian1(1.College of L ife Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Maom ing Vocati onal and Technol ogical College,Maom ing 525000,China )Abstract:Papain was i m mobilized on s odium alginate 2hit osan and nyl on,res pectively .The i m mobiliati onconditi ons and characterizati on of the i m mobilizde enzy me were studied .W hen 1mg g 21carrier papain (P A )wasl oaded on s odiu m alginate 2chit osan (I PS AC ),the I PS AC activity was 39.2U,and the recovery of activity was 21.1%.A s P A was l oaded 1mg on one bl ock nyl on (3c m ×3c m ),the I P N activity was 35.6U ,and the recovery of activity was 19.2%.The op ti m um pH of P A,I PS AC and I P N were 7.2,7.2and 6.8,res pectively .P A and I PS AC were stable when the te mperature was l ower than 70℃,while I P N was stable bel ow 50℃.The half 2life of I PS AC and I P N were 59d and 66d,res pectively .Key words:Papain;I m mobilized enzy me;A lginate;Nyl on木瓜蛋白酶(papain,P A )大量存在于番木瓜(Carica papaya )的未成熟果实的乳汁中,是一种含巯基(2SH )的肽链内切酶。

有机溶剂中酶催化活性研究进展摘要：酶在有机溶剂中催化作用的研究日益受到重视，其应用范围也越来越广。

本文就有机介质中酶催化的影响因素进行了探讨，并归纳出提高酶活性的一系列方法，最后简要介绍了有机溶剂中酶的应用。

关键词：有机溶剂；酶催化一直以来，人们认为“生物催化必须在水溶液中进行”、“有机溶剂是酶的变性剂、失活剂”，而1984年，Klibanov[1]提出:“只要条件合适，酶在非生物体系的有机溶剂中同样具有催化功能”的理论使酶学概念发生了革命性的改变，并由此开创了非水相生物催化（非水酶学）的新时代。

1 有机溶剂中酶催化反应的优势研究表明，有机溶剂中的酶和水溶液中的酶一样具有高度的底物选择性。

此外，还有以下一些特点[2, 3]: （1）绝大多数有机化合物在非水系统内溶解度很高；（2）根据热力学原理，一些在水中不可能进行的反应，有可能在非水系统内进行；（3）有机溶剂可促使热力学平衡向合成方向（如酯合成、肽合成等）移动，如脂肪酶在水中催化脂肪水解，而在有机溶剂中则催化酯合成；（4）在有机溶剂中，所有有水参与的副反应（如酸酐水解）将受到抑制；（5）在有机溶剂中酶的热稳定性显著提高，可通过提高温度加速催化反应进行；（6）从非水系统内回收反应产物比水中容易；（7）在非水系统内酶很容易回收和反复使用，不需要进行固定化；（8）在有机溶剂中不易发生微生物污染；（9）更为重要的是，低水环境可用于稳定具有未知催化性质的构象异构体，以及在水中寿命极短的酶反应中间体。

目前，有机溶剂中酶催化的上述优势使得非水酶学研究成为生物化学、有机化学、生物工程等多种学科交叉的研究热点。

迄今发现能在有机溶剂中发挥催化功能的酶有十几种，主要集中于脂肪酶研究，催化的反应类型包括氧化、还原、酯合成和酯交换、脱氧、酞胺化、甲基化、羟化、磷酸化、脱氨、异构化、环氧化、开环聚合、侧链切除、缩合及卤代等。

2 影响酶催化活性的因素一直以来有机相酶催化的研究非常活跃，但到目前为止仍处于实验研究阶段，离工业化应用还有一定的距离，最大的原因就是酶在有机溶剂中活性较低。

木瓜蛋白酶应用及研究进展摘要本文主要介绍了木瓜蛋白酶的作用机理，在医药、食品、化工、科研等方面的应用，以及在木瓜蛋白酶的固定等方面的最新研究进展。

关键字木瓜蛋白酶应用酶的固定化发展一、简介木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。

是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，主要应用于啤酒及食品工业。

二、作用机理木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜木瓜蛋白酶氨酸残基羧基参与形成的肽键。

这种酶属于内肽酶，能切开蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。

是一种存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。

作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。

木瓜蛋白酶主要是以内肽酶的形态起作用。

活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。

木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。

它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。

这种酶是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。

它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。

最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

三、制备及保存木瓜蛋白酶的制备是将未成熟番木瓜果实割取乳液去杂，在室温下加入半胱氨酸溶液在研钵中充分磨匀，静置后取上清液即为粗制酶，其水溶液呈混浊状，然后在通过离心去杂的上清液中加入硫酸铵分级分离得沉淀，加入半胱氨酸溶液后经盐析重结晶干燥得精制酶，木瓜蛋白酶室温贮存活力稳定性与活力高低呈反比，正常使用时造成活力下降的主要因素为干燥失重，温度和空气氧化，粗制的酶比精制的酶稳定，热风吹干和喷雾干燥的酶比冷冻干燥的酶稳定，因此，酶应存放在低于10℃条件下。

木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化木瓜蛋白酶固定化的方法有很多种，利用纳米材料作为载体具有更好的特点，如大比表面积、优异的稳定性、较高的再生性、可控的孔隙结构等。

一些研究表明，利用纳米材料作为载体，可以提高木瓜蛋白酶的活性和稳定性，延长其生物催化寿命。

本文将着重介绍木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化方法及其在催化反应中的应用。

纳米材料固定化木瓜蛋白酶的方法主要包括物理吸附法、化学偶联法、共价键结合法等。

物理吸附法是将木瓜蛋白酶溶液和纳米材料混合后，通过静置或离心等方法使其吸附在纳米材料表面，这种方法简单易行，但固定效果不稳定，易受溶液条件的影响。

化学偶联法是利用纳米材料表面的官能团与木瓜蛋白酶上的氨基酸残基形成共价键结合，这种方法固定效果较好，但对木瓜蛋白酶的活性影响较大。

共价键结合法是通过交联剂将木瓜蛋白酶与纳米材料上的官能团进行交联，这种方法能使木瓜蛋白酶在纳米材料上获得较好的固定效果，并且对木瓜蛋白酶活性影响较小。

共价键结合法被认为是最适合木瓜蛋白酶在纳米材料上固定化的方法。

固定化木瓜蛋白酶在纳米材料上主要包括纳米金属、纳米炭材料、纳米多孔材料等几类。

纳米金属如纳米银、纳米金等，具有优异的导电性和高比表面积，能够提高木瓜蛋白酶的电子传递速率和反应活性。

纳米炭材料如碳纳米管、石墨烯等，具有优异的力学性能和化学稳定性，能够提高木瓜蛋白酶的稳定性和再生性。

纳米多孔材料如金属有机骨架材料（MOFs）、纳米孔硅等，具有可调控的孔隙结构和大比表面积，能够提高木瓜蛋白酶的催化效率和选择性。

选择合适的纳米材料作为木瓜蛋白酶的载体，对于提高其催化性能具有重要意义。

固定化木瓜蛋白酶在纳米材料上的应用主要包括生物催化反应和生物传感器等方面。

生物催化反应是指利用木瓜蛋白酶在纳米材料上的催化作用来进行化学反应，如酶促反应、酶联免疫分析等。

生物传感器是指利用木瓜蛋白酶在纳米材料上对底物的选择性和灵敏性来进行分析检测，如生物传感器、生物芯片等。

一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。

2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。

3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。

二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。

木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。

本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。

三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。

（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。

（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。

（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。

2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。

（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。

（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。

3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。

尼龙亲和膜的制备及其对木瓜蛋白酶的分离纯化研究尼龙亲和膜的制备材料：1. 尼龙膜（待修饰）2. 正己基氯硅烷（APTES）3. 初级胺（如三乙醇胺）4. 碳酸二乙酯5. 己二酸二酐6. 液氨7. 甲醛8. 乙醇9. 氯化苯胺10. 三氯甲烷11. 磷酸二钾12. 脱离剂制备步骤：1. 将尼龙膜切割成合适的大小，并在无尘室中清洗。

2. 将切割好的膜放入磷酸二钾溶液中煮沸5分钟，取出后用去离子水冲洗干净并晾干。

3. 将晾干的膜分别放入甲醛和液氨中浸泡1小时，然后用去离子水冲洗干净。

4. 在无尘室中，将APTES和己二酸二酐按1:1的比例混合，添加到碳酸二乙酯中形成修饰液。

5. 将膜完全浸泡在修饰液中，静置6小时。

取出膜后，用乙醇洗涤去除未反应的修饰剂。

6. 将修饰过后的膜放入三氯甲烷中，再加入20％氯化苯胺的三氯甲烷溶液中，静置12小时。

7. 将膜取出后用乙醇洗涤，晾干至完全干燥。

8. 将干燥的尼龙膜存放在密封袋中，并添加适量的脱离剂，储存在冰箱中备用。

尼龙亲和膜对木瓜蛋白酶的分离纯化研究实验方法：1. 将制备好的尼龙亲和膜放入萃取柱中，并预先用适宜缓冲液（如Tris-HCl缓冲液）平衡柱床。

2. 用待测样品（如木瓜蛋白酶）溶液按一定速度加入到平衡好的柱床中，让样品通过膜床。

3. 清洗柱床，以去除非特异性结合的杂质。

4. 用合适的洗脱缓冲液，在不同的pH值和NaCl浓度条件下进行洗脱实验，以逐步分离目标酶。

5. 采集不同洗脱阶段的洗脱液，并进行酶活测定以评估纯化程度。

6. 将高活性的洗脱液收集并浓缩，可采用沉淀提纯或色谱技术进一步纯化木瓜蛋白酶。

结果和讨论：通过尼龙亲和膜的制备，我们成功地制备了一种具有亲和特性的膜。

在对木瓜蛋白酶的分离纯化实验中，经过不同pH值和NaCl浓度条件下的洗脱实验，最终得到了高纯度的木瓜蛋白酶。

这表明尼龙亲和膜对于木瓜蛋白酶的分离纯化具有较高的选择性和纯化效果。

结论：尼龙亲和膜可成功应用于木瓜蛋白酶的分离纯化研究。

固定化木瓜蛋白酶的研究进展刘嘉俊;李汴生【摘要】木瓜蛋白酶具有水解蛋白质能力强的特点,但游离的木瓜蛋白酶稳定性差,难以回收利用；固定化木瓜蛋白酶既保持了酶的催化性质,又克服了游离酶的不足,具有广泛的发展前景.【期刊名称】《食品工程》【年(卷),期】2011(000)002【总页数】3页(P8-10)【关键词】木瓜蛋白酶;固定化;应用【作者】刘嘉俊;李汴生【作者单位】华南理工大学轻工与食品学院,广州510641;广东轻工职业技术学院食品与生物工程系,广州510300;华南理工大学轻工与食品学院,广州510641【正文语种】中文【中图分类】TS261.1木瓜蛋白酶别名为木瓜酶，纯木瓜蛋白酶是有由212个氨基酸组成的单链蛋白质，相对分子质量为23 406。

制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶，为乳白色至微黄色粉末，具有木瓜特有的气味，稍具有吸湿性。

水解蛋白质能力强，但几乎不能分解蛋白胨。

最适作用温度65℃，最适作用pH为5.0，易溶于水、甘油，不溶于一般的有机溶剂，等电点为pH8.75。

虽然木瓜蛋白酶具有催化能力强，作用底物专一，反应条件温和等优点，但稳定性差，在温度、pH和无机离子等外界因素影响下，容易变性失活，而且木瓜蛋白酶一般都是在水溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有较高活力，也难以回收利用。

这种一次性使用酶的方式，不仅成本较高，而且难以连续化生产。

因此，近年来一直在研究固定化木瓜蛋白酶技术，人们试图用固定化的方法使木瓜蛋白酶固定在载体上，并在一定空间范围内进行催化反应。

固定化酶既保持了酶的催化活性，又克服了游离酶的不足，具有增加稳定性、可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。

酶的固定化方法有吸附法、包埋法、交联法等，这些方法各有利弊。

载体材料作为固定化酶的重要部分，其结构和性能对固定化酶的酶学性质有很大的影响，因此很多学者一直致力于对载体的研究，以求获得适合于某种酶的价格低廉的载体，以及操作简便和酶活力回收更高的固定化方法。

木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化
木瓜蛋白酶是一种能够在不同温度和酸碱条件下保持活性的天然酶类。

它具有高效的
催化活性，广泛应用于食品、制药和生物工程等领域。

传统的酶催化反应往往存在反应底
物难以分离和回收的问题，限制了其在工业应用中的广泛应用。

将酶固定在材料表面，成
为提高酶催化反应效率和稳定性的一种有效方法。

纳米材料是一种表面积大、可调控的材料，具有优异的质子传导性质和化学活性。

纳
米材料被广泛用于酶的固定化研究中。

木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化不仅可以进一步
提高酶的稳定性和催化效率，还可以实现酶的可重复使用。

纳米材料的固定化方法通常包括吸附、化学键、交联等方法。

吸附是一种简单、易操
作的固定化方法，通常可以通过调节纳米材料和酶溶液的pH、温度和离子力等因素来实现酶的吸附。

由于吸附力较弱，酶容易在固定化过程中失活和流失，因此需要进一步优化。

化学键是一种常用的固定化方法，可以通过制备功能化纳米材料来与酶进行共价结合。

可以将纳米材料表面引入含有反应活性官能团的化合物，再与酶分子上的氨基酸残基进行
化学反应。

这种固定化方法具有较高的稳定性，但操作复杂，需要选择合适的化学反应条件。

在纳米材料上固定化木瓜蛋白酶的目的是提高酶的稳定性和催化效率，从而实现酶的
可重复使用。

通过优化固定化方法和反应条件，可以有效地固定化木瓜蛋白酶在纳米材料上，进一步拓展其应用领域。

固定化木瓜蛋白酶在纳米材料上的研究还可以为其他酶的固
定化提供借鉴和参考，促进酶技术的发展和应用。

尼龙固定化木瓜蛋白酶实验报告1、实验原理通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性的载体结合，固定在载体上，在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。

酶的固定化方法有：吸附法（物理吸附、离子吸附）、包埋法、共价键结合法、交联法。

固定化酶的优越性主要表现在：（1）在大多数情况下，可提高酶的稳定性；（2）提高酶的使用效率，降低生产成本；（3）酶不与产品混合，制品易于纯化；（4）利用固定化酶，工业上可以大批量、连续化生产。

本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。

尼龙长链中的酰胺键，经 HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙（载体）—戊二醛（交联剂）—酶，即尼龙固定化木瓜蛋白酶。

2、实验材料、试剂及仪器2.1 材料尼龙布(86)或(66)，100目，剪成3×3cm2。

2.2 试剂(1) 甲醇溶液(含18.6％CaCL2和18.6％水)（每组50mL）：称18.6克CaCL2溶于18.6 mL蒸馏水，冷却后，用甲醇定容至100 mL。

(2) 3.5mol／L HCl溶液（每组30mL）：取29.2 mL浓HCl，定容至100 mL。

(3) 0.2 mol／L硼酸缓冲液(pH 8.4) （每组30mL）：称取0.858克Na2B4O7·10H2O 和0.68克H3BO3用蒸馏水溶解，定容至100 mL。

(4) 5％戊二醛(以0.2mo1／L pH 8.4硼酸缓冲液配制，每组30mL）：取25％戊二醛20mL，用0.2mo1／L pH 8.4硼酸缓冲液定容至100 mL。

(5) 0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液（每组250mL）: 称取1.28克Na2HPO4·2H2O和1克NaH2PO4·12H2O用蒸馏水溶解，定容至100 mL。

(6) 0.5mo1／L NaCl溶液〔用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制〕（每组150mL）: 称取2.93NaCl，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL。

尼龙固定化木瓜蛋白酶一、目的：了解共价交联法固定酶的原理和步骤二、原理尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。

三、实验材料、仪器和试剂1、材料尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm2、仪器(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱3、试剂溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65mol/LHCl溶液(1)18.6%CaCl2(4) 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5(6) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8) (7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液(8) 0.5mol/L NaCl溶液 (9) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。

(11)0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。

(12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。

四、操作步骤1、固定化酶的制备溶液10s，再浸入18.6% (1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。

取出后用水洗涤，用滤纸吸干。

(2)将尼龙布用3.65mol/L HCI溶液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性（pH试纸检测）。

(3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。

(4)取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.8)洗涤3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml 1mg/mL的木瓜蛋白酶液，在室温下固定30min。

(5)从酶液中取出尼龙布，用0.5mol/L NaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。

酶工程实验报告指导老师：学号：20070830姓名：班级：生物技术班**师范大学生命科学学院07级2010-11-15生物工程实验指导（酶工程部分）实验一木瓜蛋白酶的分离纯化及酶活检测一、概述以半胱氨酸内肽酶为主（包括木瓜蛋白酶，简称PAP、木瓜蛋白酶Ω，简称CAR、木瓜凝乳蛋白酶，简称CHP和木瓜凝乳蛋白酶M，简称GEP）的木瓜蛋白酶是从植物番木瓜中分离纯化而得的一种混合酶。

这种酶广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中以为成熟的果实乳汁中含量最高，约占乳汁干中的40%。

其最大的用途是在食品工业方面，防除啤酒冷藏混浊，嫩化肉类，生产调味品，烘烤面包，乳酪制品及谷类和速溶食品的蛋白质强化生产。

在动物饲料加工方面，用于鱼蛋白浓缩物和油籽饼处理，能提高氮的可溶性指数和蛋白质的可分散指数。

少量在皮革工业作软化剂、纺织工业作丝织品脱胶清洁剂和废胶卷回收报等。

在医药方面，主要用于治胃炎、消化不良以及用于肉赘摘除、伤痕处理、脱毛、清洁皮肤和新近的裂腭整形外科及制木瓜凝乳蛋白酶注射剂治疗脊骨盘脱出症等。

木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，其专一性较差，能分解比胰脏蛋白酶更多的蛋白质。

木瓜蛋白酶是单条链，有211个氨基酸残基组，相对分子量23000。

木瓜凝乳蛋白酶，相对分子量36000，约占可溶性蛋白质的45%。

溶菌酶，相对分子量2500，约占可溶性蛋白质的20%。

木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定型粉末或颗粒。

略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。

水溶液无色至淡黄色，有时呈乳白色。

最适pH为5.0～8.0，微吸湿，有硫化氰臭。

最适温度65℃，易变性失活。

木瓜蛋白酶等电点pH＝9.6。

半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。

二、实验目的1、学习和掌握木瓜蛋白酶分离纯化的原理、方法和工艺过程，包括盐析、酶活力保护、结晶与重结晶。

2、掌握木瓜蛋白酶活力的测定方法和原理。

木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化木瓜蛋白酶是一种天然的水解酶，具有广泛的应用领域，包括食品、饲料、制药和纺织等行业。

由于其易受到温度和酸碱条件的影响，限制了其在实际应用中的稳定性和活性。

为了克服这些限制，研究人员开始将木瓜蛋白酶固定在纳米材料上，以提高其稳定性和活性。

纳米材料具有特殊的表面特性，能够提供更多的固定化位点，从而增加酶的固定效率。

纳米材料还具有较大的比表面积和空隙结构，能够增加底物与酶的接触面积，提高酶反应的效率。

利用纳米材料作为载体来固定木瓜蛋白酶可以提高其稳定性和活性。

目前，研究人员已经在纳米材料上成功固定了木瓜蛋白酶，并对其催化性能进行了研究。

研究发现，在纳米材料上固定的木瓜蛋白酶具有较高的催化活性和稳定性。

纳米材料还能够保护酶免受温度和酸碱条件的影响，延长酶的使用寿命。

对于木瓜蛋白酶的固定化，研究人员主要采用物理吸附、化学交联和共价键结等方法。

物理吸附是最简单和常用的方法，通过静电相互作用或疏水效应将酶固定在纳米材料的表面。

化学交联方法则通过化学反应将酶共价结合在纳米材料上，具有更高的固定效率和稳定性。

共价键结方法由于反应条件较为严格，目前应用较少。

除了固定化方法，研究人员还尝试通过封装纳米材料来固定木瓜蛋白酶。

封装可以将酶包裹在纳米材料内部，形成酶-纳米材料复合体。

封装可以提高酶在极端条件下的稳定性，并保护酶免受外界环境的影响。

木瓜蛋白酶的固定化在纳米材料上具有重要的应用价值。

这不仅可以提高酶的稳定性和活性，还能够简化酶的回收和再利用过程。

随着纳米材料技术的不断发展，相信木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化会有更广阔的应用前景。

不同疏水参数有机溶剂中木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的变化何平;黄家乐;史清翠;巫光宏;初志战;黄卓烈【摘要】[目的]探寻疏水参数(logP)不同的有机溶剂对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的影响.[方法]制备同定化木瓜蛋白酶,在疏水参数不同(logP=-1.30,-1.10,-0.76,-0.33,-0.24,0.28,0.49,0.68,0.80,1.31,1.80,2.0,2.5,3.5和5.0)的15种有机溶剂及其不同体积分数(ψ=5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,50%,60%和70%)的溶液中,测定木瓜蛋白酶及其固定化酶的活性,以不含相应有机溶剂的0.1 mol/L pH 7.2磷酸缓冲液或Tris-盐酸缓冲液为对照,分析不同有机溶剂及其体积分数对酶活性的影响.[结果]在低疏水参数(10g P≤-0.24)的有机溶剂中,有机溶剂二甲基亚砜、1,4-二氧六环和乙腈具有在低体积分数(ψ≤10%)下.激活木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的特性,有机溶剂甲醇、乙醇虽然在低体积分数(ψ≤10%)下不能激活木瓜蛋白酶及其同定化酶活性,但其活性与对照(=0)相当;低疏水参数有机溶剂在高体积分数(ψ≥30%)下抑制酶活.当有机溶剂的疏水参数为0.28～1.3l时,其对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性有显著抑制作用.在有机溶剂疏水参数较高(10gP≥1.80)条件下,低体积分数(ψ≤10%)时酶活性下降较慢,超过一定体积分数(ψ≥30%)后,酶活性开始升高.[结论]低logP(logP≤-0.24)有机溶剂在低体积分数(ψ≤10%)时可激活或稳定木瓜蛋白酶及其固定化酶活性.而在高体积分数(ψ≥30%)时对酶活有抑制作用;中log P(0.28≤log P≤1.31)有机溶剂对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性具有显著抑制作用;高log P(10g P≥1.80)有机溶剂在低体积分数(ψ≤10%)时抑制木瓜蛋白酶及其同定化酶活性,但在高体积分数(ψ≥30%)时酶活性升高.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2009(037)003【总页数】8页(P223-229,234)【关键词】木瓜蛋白酶;固定化酶;有机溶剂;疏水参数;酶活性【作者】何平;黄家乐;史清翠;巫光宏;初志战;黄卓烈【作者单位】华南农业大学,生命科学学院,广东,广州,510642;华南农业大学,生命科学学院,广东,广州,510642;华南农业大学,生命科学学院,广东,广州,510642;华南农业大学,生命科学学院,广东,广州,510642;华南农业大学,生命科学学院,广东,广州,510642;华南农业大学,生命科学学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】Q556+.9近年来，针对非水酶学的研究十分活跃，显示了有机溶剂中酶的巨大应用潜力[1-5]。