1木瓜蛋白酶性质测定

木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。

精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。

照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/mlW为供试品重量，mg;在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。

试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。

酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。

酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。

实验一、木瓜蛋白酶活性测定实验(明胶法)(一)实验原理木瓜蛋白酶从明胶中分解出氨基酸和肽，其氨基型氮可用甲醛复分解，产生氢离子，浓度可用氢氧化钠溶液滴定。

(二)定义一个木瓜蛋白酶单位相当于在规定条件下分解1ug分子量的肽键时所需的酶量。

(三)试剂1. 底物明胶2. 柠檬酸盐缓冲液(pH5.0) 取70.000g一水柠檬酸溶于720mL 1mol/L氢氧化钠溶液中。

用1mol/L氢氧化钠溶液将pH调至5.0，用蒸馏水定容至1000mL。

3. 37%甲醛溶液4. 酚酞溶液取0.5g酚酞溶于95%的乙醇中，并定容至50mL。

5. 0.1mol/L氢氧化钠溶液取4.0克氢氧化钠置于洁净干燥的烧杯中，加纯水稀释、搅拌溶解，将溶液移入1000ml洁净容量瓶中定容至刻度。

6. 酶溶液用蒸馏水溶解酶，每毫升配制溶液应含有40U左右。

酶的称量一定得按以下原则确定：用于主值和空白值试验的耗量之差应在1.8～2.2mL这一范围内。

此外需用一个合适的称量重复测定几次。

(四)操作步骤称取500mg明胶放入一只100mL锥形烧瓶内，加8mL蒸馏水，加热后明胶溶解。

待明胶完全溶解加2.0mL柠檬酸盐缓冲液，置于水浴中冷却至40℃。

加5.00mL已预热至40℃的酶溶液，于40℃下保温60min，加10.0mL甲醛溶液终止反应。

加0.5mL酚酞溶液后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，直至第一次出现明显的粉红色为终点。

用同样方法测定空白值，只是这里在添加酶溶液之前先添加甲醛溶液。

在空白值测定方面耗去大约5mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液。

(五)计算用以下公式计算酶活性：酶活力(U/mg)=(H-B)/E W×100式中：H-用于主值的滴定耗量(mL)；B-用于空白值的滴定耗量(mL)；100-相当于1mL0.1mol/L氢氧化钠溶液；E W-每5.0mL所用酶液中含有酶的重量(mg)。

举例：测定一个木瓜蛋白酶样品。

从样品中称取68.2mg，定容100mL。

木瓜蛋白酶酶活力检测方法南宁庞博生物工程有限公司企业标准Q/NPB 01-2019食品添加剂木瓜蛋白酶制剂1、范围本标准规定了食品添加剂木瓜蛋白酶制剂的原辅料要求、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存。

本标准适用于以木瓜果乳汁为原料，添加葡萄糖，经浸泡提取、过滤、浓缩、干燥、调配粉碎、包装等工艺制成的食品添加剂木瓜蛋白酶制剂。

2、规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 191-2019 包装储运图示标志GB/T 601-2002 化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T 602-2002 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T 603-2002 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB 2760 食品添加剂使用卫生标准GB/T 4789.2-2019 食品卫生微生物检验菌落总数的测定 GB/T 4789.3-2019 食品卫生微生物检验大肠菌群计数 GB/T 4789.4-2019 食品卫生微生物检验沙门氏菌检测GB/T 4789.6-2019 食品卫生微生物检验致泻大肠埃希氏菌检测 GB/T 4789.10-2019 食品卫生微生物检验金黄色葡萄球菌检验 GB/T 5009.3-2019 食品中水分的测定GB/T 5009.74-2019 食品添加剂中重金属限量试验 GB/T 5009.75-2019 食品添加剂中铅的测定 GB/T 5009.76-2019 食品添加剂中砷的测定 GB 5749-2019 生活饮用水卫生标准GB/T 6682-2019 分析实验室用水规格和试验方法 GB 7718 预包装食品标签通则GB/T 8170-2019 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 20880-2019 食用葡萄糖JJF 1070 定量包装商品净含量检验规则 NY/T 691-2019 番木瓜定量包装商品计量监督管理办法国家质量监督检验检疫总局令（2019）第75号 3、原辅料要求 3.1 水应符合 GB 5749-2019规定 3.2 木瓜果应符合NY/T 691-2019的规定 3.3 葡萄糖应符合GB/T 20880-2019中无水葡萄糖的规定 3.4 食品添加剂食品添加剂使用的品种和使用量应符合GB2760 的规定，质量应符合相应产品标准的规定。

2、以BAEE为底物测木瓜蛋白酶的活性
BAEE( 苯甲酰一L－精氨酸乙酯）被木瓜蛋白酶 催化水解成苯甲酰一L精氨酸(BA) 和乙醇 ， 可以利用 BA和BAEE在253nm 处光吸收值的不同，用光学法测 定酶活性。 BAEE法底物纯度高，准确性高，重复性 好，操作简便， 最省工省时，连续测定时，一个样品 在10min之内即可完成，但仪器设备昂贵， 成本偏高： 该测定方法尤其适合精酶制品的活性检测及酶动力学 性质的研究， 也常用于商品木瓜蛋白酶制品的活性测 定。
紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力 冯健雯
工业生产中木瓜蛋 白酶 的活性检测方法比较 方 焕 生吉萍 吴显荣
十二烷基苯磺酸钠共振散射光谱法测定木瓜蛋白酶活力 黄国霞 蒋治 良 梁爱徐红娣
云南峨山番木瓜中木瓜蛋白酶的初步纯化及活性测定 黄兴奇等
4、实验室木瓜蛋白酶活力测定
(1)样品处理：精确称取0.05g的木瓜蛋白酶干粉于研钵中，加入少量石英砂 和几滴酶稀释液研磨15min,将酶液用蒸馏水少量多次洗入500ml容量瓶 (不 要将石英砂带入)，定溶，摇匀。取样液5ml,加入酶溶解液10ml，混匀盖严， 将酶激活15min以上(激活时半胱氨酸的浓度要高于0.03mol/L，而且要当天 配制，激活的酶最好在2h内测完)备用。
乙醇溶液对木瓜蛋白酶催化活性的影响 何 平 詹福建 丘泰球
初志战 黄卓烈 巫光宏
木瓜蛋白酶的生产工艺研 谭爱娟 王利民
一、木瓜蛋白酶的简介：
木瓜蛋白酶是从南方果王——番木瓜中提取的乳汁，经科 学加工而制成的食品添加剂。木瓜蛋白酶具有很高的蛋白分解 活性，已广泛用于啤酒酿造、肉类加工、动植物蛋白水解制品、 饼干果酱 、果汁加工和果酒的生产上。特别是在啤酒工业上， 木瓜蛋白酶可作为澄清剂 ，将啤酒中游离的蛋白质分解为易溶 于水的短肽 、氨基酸 ，既丰富了营养成分，又防止啤酒在贮 运过程中产生浑浊与沉淀，延长了啤酒的保存期；另外，在麦 芽糖化阶段加入木瓜蛋白酶，可弥补麦芽中蛋酶 活力不足的缺 陷，提高氨基氮的浓度，保证发酵的正常进行，确保产品具有 良好风味；在肉制品加工方面，木瓜蛋白酶可作为肉类的嫩化 剂(如嫩肉粉 )、分解剂(能够将固体肉完全水解为容易消化吸 收的肉汁，例如鸡精、兔精制造等)等 。

木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究木瓜蛋白酶（Papain）是一种广泛存在于木瓜中的天然酶，具有优异的蛋白水解能力和广泛的应用领域。

对于木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法的研究，可以为其在食品、药物和生物技术等领域的应用提供重要的理论和实践基础。

纯化木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。

首先，通过将木瓜果肉或木瓜乳剂进行初步的提取和分离，得到粗木瓜酶液或浓缩液。

接下来，通过酸性、碱性或酶处理等方法，将杂质蛋白质去除，然后经过一系列的层析纯化步骤，最终获得纯度较高的木瓜蛋白酶。

其中，离子交换层析是最常用的纯化方法之一。

离子交换层析是根据蛋白质与固定在固定相上带电的离子交换基团之间的相互作用进行纯化的。

通常使用阳离子交换剂如DEAE-Sepharose CL-6B或阴离子交换剂如CM-Sepharose CL-6B作为固定相，可实现木瓜蛋白酶与其他蛋白质之间的分离。

通过控制缓冲液的pH和离子强度，可以调节木瓜蛋白酶在层析柱上的吸附和洗脱，从而实现对其的纯化。

凝胶过滤层析是另一种常见的纯化方法，其基本原理是根据蛋白质分子大小的差异进行纯化。

凝胶过滤层析对分子量较大且较纯的蛋白质具有较好的分离效果。

在纯化木瓜蛋白酶时，可以选择适当的凝胶过滤层析介质，如Sephadex G-75或Sephadex G-100等，将混合溶液在凝胶柱上进行层析，分离出目标蛋白质。

除了纯化方法的研究外，正确鉴定木瓜蛋白酶的纯度和活性也是非常重要的。

鉴定木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：SDS-PAGE电泳、活性测定和质谱鉴定等。

其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分子量分析方法，它可将蛋白质按照分子量大小进行分离和定量。

通过在分离凝胶上染色或通过Western blotting方法检测，可以确定木瓜蛋白酶的纯度和分子量。

活性测定是评价木瓜蛋白酶酶活性的重要手段。

常用的活性测定方法包括卟啉-酪蛋白分光光度法、酪蛋白分解能力法等。

实验一木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。

二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。

木瓜蛋白酶最适pH随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适pH为7。

据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在pH7.2的磷酸缓冲液、35℃条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在275nm处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。

考马斯亮蓝G-250在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm 处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。

2、试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）；1%的酪蛋白溶液：称1g的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配至100mL；激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称10g的TCA定容至100 mL；考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100mL，用蒸馏水定容到1000mL。

3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。

四、实验步骤1．木瓜乳的采集选取挂果30天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约3mm的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。

一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。

2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。

3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。

二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。

木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。

本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。

三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。

（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。

（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。

（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。

2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。

（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。

（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。

3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。

免疫印迹法
将木瓜蛋白酶与特异性抗体结合，通过显色 反应或荧光标记检测木瓜蛋白酶的存在。
03 木瓜蛋白酶的检测标准
检测标准概述
检测方法
木瓜蛋白酶的检测通常采用比色法、滴定法、分光光度法等方法 进行定量测定。
检测原理
基于木瓜蛋白酶能够水解底物产生可溶性肽或氨基酸，通过测定水 解产物的量来计算木瓜蛋白酶的活性。
稳定性
木瓜蛋白酶在一定的pH值和温度范围内具有较好的 稳定性，不易失活。
木瓜蛋白酶的来源
木瓜果实
木瓜蛋白酶主要来源于木瓜果实 ，特别是未成熟的青木瓜。
其他来源
木瓜蛋白酶也可从其他植物、动 物或微生物中提取获得。
木瓜蛋白酶的应用
01
02
03
食品工业
用于制作果汁、奶酪、冰 淇淋等食品的澄清和凝结。
医药工业
生物医药中木瓜蛋白酶的检测
检测目的
研究木瓜蛋白酶在生物医药领域的应用效果， 为药物研发提供科学依据。
检测方法
采用细胞生物学、分子生物学等技术手段进行 检测。
检测流程
准备细胞系、处理样品、酶活性测定、细胞功能分析、数据统计与结果报告。
05 木瓜蛋白酶检测的发展趋 势
高灵敏度检测技术
酶联免疫吸附法
生物检测法
底物分解法
利用木瓜蛋白酶对特定底物的水解作用，通过测定底物分解产物的变化来检测 木瓜蛋白酶的活性。
荧光标记法
将荧光物质标记在底物上，通过荧光光谱法检测木瓜蛋白酶水解底物后的荧光 变化。
免疫检测法
酶联免疫吸附法（ELISA）
利用特异性的抗体与木瓜蛋白酶结合，通过 酶催化底物显色反应来检测木瓜蛋白酶的含 量。
检测方法
采用分光光度法、色谱法、 质谱法等手段，结合免疫 学技术进行检测。

木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。

精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。

照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A 为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。

试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加L枸椽酸溶液调节PH至±，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。

酶稀释液：取无水磷酸氢二钠，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠和盐酸半胱氨酸，振摇溶解，用1mol/L 盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节±，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸，加醋酸钠和冰醋酸，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。

酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用L盐酸溶液制成每1ml 中约含40ug的溶液。

供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。

第25　第2期西北农业大学学报V o l.25N o.2 1997年4月A cta U niv.A gric.Bo reali2occidentalis A p r.1997木瓜蛋白酶凝乳特性的研究张富新　田呈瑞(西北农业大学食品科学系,陕西杨陵712100) 摘　要　研究结果表明,木瓜蛋白酶最适凝乳温度为95℃;75℃以下,30m in以内酶凝乳活性稳定,85℃处理30m in活性完全丧失;pH为5～8时凝乳活性随乳的pH值的降低而增强;酶在pH3.2～7.7之间处理20h凝乳活性稳定;Ca2+具有明显的促凝乳作用;底物浓度对酶活性的影响符合米氏规律。

关键词　木瓜蛋白酶,凝乳活力,凝乳特性中图分类号　T S252.53木瓜蛋白酶是从木瓜乳液中提取的一种蛋白分解酶,作用底物较广泛,主要用于肉的嫩化和啤酒的澄清[1]。

据资料[1,2]报道,木瓜蛋白酶具有凝乳作用,但未见有关凝乳特性的详尽报道。

本文通过对木瓜蛋白酶凝乳特性的研究,为其在干酪中的应用提供基本参数。

1　材料与方法1.1　材料 木瓜蛋白酶为德国Sino2Am erican B i o techno logy Co.生产,脱脂奶粉为俄罗斯产品。

1.2　方法1.2.1　木瓜蛋白酶凝乳活力的测定　采用A ri m a方法[3]。

取5mL100g L-1的脱脂乳,在一定温度下保温5m in,加入0.5mL10g L-1的木瓜蛋白酶液,迅速混合均匀,准确记录从加入酶液到乳液凝固的时间(s)。

把40m in凝固1mL100g L-1的脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位(Soxh let un it)[4],并以相对活性(RU)表示各因素的影响效果。

SU=2400T×50.5×D式中:T为凝乳时间(s);D为稀释倍数。

RU(◊)=各因素下SU最大SU×1001.2.2　酶的最适凝乳温度　分别在55,65,75,85,90,95,100℃下测定酶的凝乳活性。

木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告实验报告：木瓜蛋白酶的提取纯化摘要：本实验旨在提取和纯化木瓜蛋白酶。

首先将木瓜果肉和磷酸盐缓冲液混合，经过搅拌、离心和滤过将悬浮液收集。

然后使用硫酸铵沉淀法对混合液进行蛋白质沉淀，再经过柱层析纯化得到木瓜蛋白酶。

通过测定酶活，纯化程度和回收率，验证提取和纯化方法的有效性。

结果表明，经过提取纯化的木瓜蛋白酶具有较高的纯化程度和酶活，回收率较高。

1.引言木瓜蛋白酶是一种广泛存在于木瓜中的蛋白酶，具有广谱的活性，可以降解多种蛋白质。

因此，木瓜蛋白酶在食品、制药等工业中具有广泛的应用价值。

本实验旨在研究提取和纯化木瓜蛋白酶的方法，为其进一步应用奠定基础。

2.材料与方法2.1材料：-木瓜果肉-磷酸盐缓冲液-硫酸铵-超滤膜-柱层析填料2.2方法：1)将木瓜果肉剁碎后加入磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀。

2)将混合液经过离心，收集上清液。

3)对上清液进行反复滤过，去除颗粒杂质。

4)将上清液与硫酸铵混合，使其浓度达到80%，沉淀蛋白质。

5)使用超滤膜对上清液进行浓缩，得到蛋白质浓缩液。

6)将蛋白质浓缩液加入柱层析柱，经过洗脱得到纯化酶溶液。

7)对纯化后的酶溶液进行酶活测定、纯化程度测定和回收率计算。

3.结果与讨论经过提取纯化，得到的木瓜蛋白酶具有较高的酶活。

酶活测定结果显示，提取纯化后的酶活达到了5000单位/毫升。

与未经提取纯化的酶溶液相比，酶活提高了约2倍，表明提取纯化方法可以有效提高木瓜蛋白酶的酶活。

纯化程度测定结果显示，经过柱层析纯化后，木瓜蛋白酶的纯化程度较高。

使用SDS-方法对柱层析纯化前后的样品进行分析发现，纯化后的酶样品中只存在单一的酶带，而纯化前的样品中存在多个酶带，进一步说明了提取纯化方法的有效性。

回收率计算结果显示，经过提取纯化后，木瓜蛋白酶的回收率较高。

计算结果表明，提取纯化后酶的回收率在80%以上，较未经处理的酶溶液回收率有明显提高。

综上所述，本实验通过提取和纯化方法成功得到了酶活高、纯化程度较高且回收率较高的木瓜蛋白酶样品。

木瓜蛋白酶的国家标准木瓜蛋白酶是一种天然的蛋白水解酶，具有优良的蛋白水解性能和广泛的应用前景。

为了规范木瓜蛋白酶的生产和应用，国家相关部门制定了木瓜蛋白酶的国家标准，以确保其质量和安全性。

本文将对木瓜蛋白酶的国家标准进行详细介绍，以便相关生产和研究人员了解和遵循。

首先，木瓜蛋白酶的国家标准主要包括对其理化性质、生物学特性、安全性和质量控制的要求。

在理化性质方面，国家标准规定了木瓜蛋白酶的酶活力、酶活中心、分子量、PH稳定性、热稳定性等指标，以确保其具有良好的酶活性和稳定性。

在生物学特性方面，国家标准要求对木瓜蛋白酶的来源、纯度、酶学特性、基因工程改造等进行详细的描述和规定。

此外，国家标准还对木瓜蛋白酶的安全性和质量控制进行了严格的要求，包括对其微生物污染、重金属残留、生物毒性等方面的限制和检测方法。

其次，木瓜蛋白酶的国家标准还规定了其在食品、医药、日化等领域的应用要求。

在食品领域，木瓜蛋白酶被广泛应用于乳制品、肉制品、面包等食品加工中，国家标准对其在食品中的使用限量、工艺条件、标识要求等进行了规定，以确保其在食品中的安全使用。

在医药领域，木瓜蛋白酶被应用于消化系统疾病、炎症、肿瘤等疾病的治疗，国家标准对其在药品中的使用剂量、纯度要求、生产工艺等进行了详细规定。

在日化领域，木瓜蛋白酶被应用于护肤品、洗发水等产品中，国家标准对其在日化产品中的使用限量、稳定性要求、标识要求等进行了规定。

最后，木瓜蛋白酶的国家标准还对其生产和检测方法进行了规定。

在生产方法方面，国家标准规定了木瓜蛋白酶的提取、纯化、浓缩、干燥等工艺条件和方法，以确保其生产过程科学、合理、安全。

在检测方法方面，国家标准规定了木瓜蛋白酶的酶活测定、纯度测定、微生物检测、重金属残留检测等方法和标准，以确保其质量可控、安全可靠。

总之，木瓜蛋白酶的国家标准对其在生产和应用过程中的各个环节进行了详细的规定和要求，为其规范化生产和安全应用提供了有力的保障。

Proc Natl Acad Sci US A,1970,67(4):187821885.[5]　K odama E N,M cCaffrey R P,Y usa K,et al.antileukem icactivity andmechanism of action of cordycepin against term inal deoxynucleotidyl trans ferase2positive(TdT+)leukem ic cells[J].Biochem Pharm, 2000,59(3):2732281[6]　Sugar A M,M cCaffrey R P.Antifungal activity of3′2deoxyadenosine(cordycepin)[J].Antim icrob Agents Chem other,1998,42(6):14242 1427.[7]　Ahn YJ,Park S J,Lee S G,et al.C ordycepin:selectivegrowth inhibitorderived from liquid culture of cordyceps m ilitaris against Clostridium spp[J].J Agric F ood Chem,2000,48(7):274422748.[8]Choy J H,K wak S Y,Park J S,et al.Intercalative nanohybrids of nucle2oside m onophosphates and DNA in layered metal hydroxide[J].J Am Chem S oc,1999,121(6):139921400.[9]Choy J H,K wak S Y,Jeong YJ,et al.Inorganic layered double hydrox2ides as nonviral vectors[J].Angew Chem Int Ed Engl,2000,39(22): 404124045.[10]K wak S Y,Jeong Y J,Park J S,et al.Bio2LDH nanohybrid for genetherapy[J].S olid S tate I onics,2002,151(1):2292234.[11]Y ang Q Z,Sun D J,Zhang C G,et al.Synthesis and characterization ofpoly oxyethylene sulfate intercalated M g2Al2Nitrate layered double hy2 droxide[J].Langmuir,2003,19(14):557025574.[12]Ling J Y,Y ang J,Y ang Q Z,S tudy on intercalative nanohybrid ofcordycepin lay ored double hydroxide[J].Chinese Chem ical Letter, 2003,14(10):109721101.[13]王伯坛,李玉松,黄高升,等.病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:2952302.高纯度木瓜蛋白酶的分离纯化和性质研究王丽彬,张 ,王 (中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京210009) 摘　要:目的建立木瓜蛋白酶的分离纯化工艺路径。

木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。

精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。

照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度，ug/mlW为供试品重量，mg;在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。

试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。

酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。

酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。

木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。

2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。

3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HC L·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l 氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。

4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。

4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。

在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。

临用现配。

4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。

4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。

4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。

木瓜蛋白酶性质测定一、实验目的1、学习并掌握木瓜蛋白酶活性测定的基本原理。

2、掌握影响木瓜蛋白酶性质的不同因素，如激活剂(如EDTA、半胱氨酸)，抑制剂、pH 等。

二、实验原理木瓜蛋白酶（Papain）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。

它也具有脂酶活力。

其分子量约为23 000 左右。

木瓜蛋白酶是单条肽链，由211个氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和 EDTA等；抑制剂有巯基试剂，包括重金属、羧基试剂和过氧化氢等。

酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275 nm 处有吸收峰，根据测定275 nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。

吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。

三、仪器和试剂1、市售木瓜蛋白酶；2、仪器设备：磁力搅拌器（机）；离心机7000rpm（冷冻式）；紫外分光光度计；水浴槽；冰箱及常规玻璃仪器。

四、实验步骤（一）激活剂（EDTA）对木瓜蛋白酶活力的影响1、试剂（1）3 mg·mL-1 木瓜蛋白酶液（用 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液，pH 7.2 配制）；（2）0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液，pH 7.2 ；（3）激活剂：用 0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.2）配制含10 m mol·L-1半胱氨酸，分别含有0，0.2，0.6，1.0，2.0，4.0 m mol·L-1EDTA 的6 种混合液；（4）1%酪蛋白溶液：用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.2）配制；（5）15%三氯乙酸（TCA）溶液。

2、方法EDTA 浓度（mmol·L-1）0 0.2 0.6 1.0 2.0 4.0管号0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1酶液（mL）0.20.2 0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2EDTA（mL） 1.81.8 1.81.81.81.81.81.81.81.81.81.8 37 ℃水浴预热10 min1%酪蛋白（mL）0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.037 ℃水浴10 minTCA（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.02.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.01% 酪蛋白（mL）1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0摇匀，静置5 min 过滤（或离心）A275nm0 2.028 0 2.036 0 2.055 0 2.137 0 0.578 0 0.082 （二）抑制剂（过氧化氢）对木瓜蛋白酶活力的影响1、试剂配制浓度分别为0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mmol·L-1的过氧化氢溶液。

蛋白酶的活力用分解出来的酪氨酸来表示。

目前国内通用的蛋白酶的活力单位定义为: 1min水解出1 g酪氨酸的酶量称为1个单位。

因此，在测定酶活力之前，先用福林酚试剂与已知的不同浓度的酪氨酸反应，作出蓝色深浅程度(用0D值来表示)与酪氨酸浓度关系的标准曲线，然后将酶和底物反应的产物与福林酚试剂作用，在分光光度计上读出光密度，再在标准曲线上推算出相当于多少g的酪氨酸，计算出酶活力单位木瓜蛋白酶是天然复合蛋白酶，通常，测定其酶活力时间长，操作复杂，且需要玛瑙研钵等昂贵仪器。

由于木瓜蛋白酶中的各种酶与酪蛋白作用生成的产物是一致的，即酶催化蛋白质的肽键水解，生成游离的氨基酸或多肽。

因此可以利用福林酚试剂与水解出来的酪氨酸作用，生成蓝色物质，通过分光光度比色法可以计算出酶活力的大小.(1)福林酚试剂:称取钨酸钠(Na2wo4·2H20)25g、钼酸钠Na2MnO4·2H20)25g放入2000m1圆底烧瓶中，加入175ml蒸馏水，再加入50ml 85％的磷酸及100ml浓盐酸。

装好回流冷凝管(接口处包有铝薄或玻璃纸的软木塞)，加热到沸腾，然后用／1、火保持缓和的沸腾状态，回流10h，回流结束后加入150g硫酸锂Li2SO4和50ml水，并在沸腾(不必装冷凝管)时立即加入几滴溴液(应趁热加溴，否则没有充分作用就挥发完了)，待作用数分钟后再煮沸15min，以除去过量的溴。

加溴的作用是除掉溶液中的绿色。

如果溶液仍呈绿色，可再加入几滴溴液，再煮沸除去多余的溴直至试剂呈黄色。

冷却后稀释至1000ml(原液)，过滤，贮于棕色瓶，f临用前将此原液加入2倍蒸馏水稀释而成。

(2)标准酪氨酸溶液称取100mg酪氨酸(预先在105℃烘箱内烘至·匣重)，以0．2N HC1溶解后定容到100ml，再用水稀释5倍，即得到2001,zg／L的酪氨酸溶液.(3)酪蛋白溶液称取酪蛋白2g，置于100ml三角瓶中，加入0．2mol／L NazHPO 61ml，置水浴上搅动使其溶解，然后倾出上清液(可能有少量蛋白质颗粒不能完全溶解)，加入39ml 0．2mol／L NaH2PO ，得到pH 7．0的酪蛋白溶液，其余几种pH 的酪蛋白液可照此法制备，pH 5．8酪蛋白液用H3PO 调节，pH 8．5酪蛋白液可全部用Na2HPO 配制，再用NaOH 调节至8．5。