科学研究 懿 究舄拜发
棚养和塘养甲鱼肌肉中
呈味核苷酸的含量变化及比较
方燕，过世东
（江南大学食品学院，江苏无锡２１４０３６） ｉ ７＝＝
摘要：采用紫外分光光度法和高效液相色谱法，对宰后２４ ｈ内，甲鱼肌肉中肌酸酐、肌苷酸、肌苷的含量变化进行 了定性和定量测定。结果表明：紫外分光光度法定性测定，甲鱼肌肉样品紫外吸收比（２６０／２５０）在８ ｈ后显著降低，肌 肉代谢生成呈味肌苷酸、无味肌苷及苦味次黄嘌呤的总量显著增加；高效液相色谱法定量测定，肌苷的含量在８ ｈ后 显著增加，肌苷酸含量在宰后２４ｈ内逐渐增加；高效液相色谱法定量结果验证了紫外分光光度法定性结果的可靠 性。根据宰后肌苷酸等含量变化规律，进一步对宰后于５℃下冷藏１２ ｈ，棚养、塘养１年、塘养２年甲鱼肌肉中肌酸 酐、鸟苷酸、肌苷、肌苷酸含量进行定量测定。结果显示：棚养、塘养１年、塘养２年甲鱼肌肉肌苷酸含量分别为 ０．０５１ ２ ｍｇ／ｇ、０，１２７ ２ ｍｇ／ｇ、０．２０１ １ ｍｇＣｇ，乌苷酸含量分别为０、０１６ ５ ｍｇＣｇ、０．０１３ ２ ｍｇ／ｇ、０．０１９ ２ ｍｇ／ｇ。棚养甲鱼鲜 味核苷酸含量显著低于塘养甲鱼的含量。 关键词：甲鱼；呈味核苷酸；高效液相；紫外吸收比（２６０／２５０）
ＴＨＥ ＣＨＡＮＧＥＳ ＯＦ ＦＬＡＶＯＲ ＲＩＢ０ＮＵＣＬＥ０ＴＩＤＥ Ｃ０ＮＴＥＮＴＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮ ＢＥＴＷＥＥＮ
ＧＲＥＥＮＨＯＵＳＥ ＡＮＤ ＰＯＵＮＤ ＴＲＩＯＮＹＸ ＳＩＮＥＮＳＩＳ ＭＵＳＣＬＥ
ＦＡＮＧ Ｙａｎ，ＧＵＯ Ｓｈｉ－ｄｏｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４０３６，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（ＣＲＥ），ｉｎｏｓｉｎｅ（ＨｘＲ）ａｎｄ ｉｎｓｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＩＭＰ）ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｏｎｙｘ ｓｉｎｅｎｓｉｓ
一、实验目的
1. 掌握核酸含量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法和定磷法在核酸含量测定中的应用。
3. 通过实验操作，提高实验技能和数据分析能力。
二、实验原理
核酸是一类重要的生物大分子，包括DNA和RNA。核酸含量的测定对于生物学研究具有重要意义。本实验采用紫外分光光度法和定磷法两种方法测定核酸含量。
1. 紫外分光光度法
核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，在紫外光照射下具有特定的吸收峰。通过测定核酸溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出核酸含量。
2. 定磷法
核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为5%，DNA中含磷量为9%。通过测定核酸溶液中磷的含量，可以推算出核酸含量。
三、实验材料与仪器
1. 实验材料
核酸样品、标准核酸溶液、标准磷溶液、定磷试剂、浓硫酸、蒸馏水、移液管、容量瓶、试管、紫外分光光度计、电炉、水浴锅等。
2. 实验仪器
紫外分光光度计、电子天平、移液器、试管架、试管、烧杯、滴定管、酒精灯、玻璃棒等。
四、实验步骤
1. 紫外分光光度法测定核酸含量
（1）配制核酸溶液：准确称取一定量的核酸样品，用蒸馏水溶解并定容至一定体积。
（2）测定吸光度：取一定量的核酸溶液，在特定波长下测定吸光度。 （3）计算核酸含量：根据吸光度值和标准曲线，计算核酸含量。
2. 定磷法测定核酸含量
（1）配制核酸溶液：同紫外分光光度法。
（2）消化：将核酸溶液加入浓硫酸，在电炉上加热至有机物分解，冷却后定容。
（3）测定磷含量：取一定量的消化液，加入定磷试剂，在特定波长下测定吸光度。
（4）计算核酸含量：根据吸光度值和标准曲线，计算核酸含量。
五、实验结果与分析
1. 紫外分光光度法测定核酸含量
根据实验数据，绘制标准曲线，计算样品中核酸含量。
2. 定磷法测定核酸含量
根据实验数据，绘制标准曲线，计算样品中核酸含量。
六、实验讨论
1. 实验过程中，应注意避免核酸样品的污染，保证实验结果的准确性。
核酸定量的常用方法、原理、优缺点等。
紫外分光光度法：利用核酸中的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，在紫外光的照射下在260nm处有最大吸收峰的原理对核酸进行定量和定性的方法。是实验室内较为常用的方法。
优点：操作简单，设备要求低。
缺点：灵敏度不够高，只能测定总核酸量，不能区分核算种类；易受样品中其他杂质的干扰（如pH值、残留的提取剂等）。
荧光染料法：基于荧光染料与核酸分子结合，发出的荧光信号强度与结合的核酸分子数成正比的原理设计的。常用的荧光染料有嗅化乙锭、SYBR系列染料等。
优点：灵敏度高，所需样品量少，可重复性高。
缺点：染料一般都含有较高毒性，检测结果受染料与核酸的结合率影响。
实时荧光定量PCR法：
在反应体系内加入荧光基团，通过荧光基团发出荧光信号经积累来实时检测PCR的反应过程，最后通过相对定量或者绝对定量的方法对未知浓度的核酸进行定量分析。常用的检测方法有TaqMan探针和荧光染料两种。
TaqMan探针法：利用Taqman酶在特异性引物上增加一条荧光双标记的探针，分别标记有荧光信号基团R和淬灭基团Q，当二者都存在的时候R基团受Q基团影响不发出荧光信号，而在PCR反应过程中，聚合酶将探针的碱基水解，R与Q基团分离，R基团发出荧光信号，模板每扩增一次，就产生一次荧光信号，通过对荧光信号的检测和绘制荧光信号曲线，与标准曲线对比分析，可对核酸进行定量。优点是特异性强，缺点是探针序列设计时需要强特异性，以及成本相对较高。
DNA结合荧光染料法：常用的荧光染料为SYBR Green Ⅰ，该技术通过在PCR反应体系中加入过量的荧光染料，染料会特异性的与dsDNA结合并发出荧光信号，而未与dsDNA结合的不会发出荧光信号，在PCR过程中仪器通过检测荧光信号增强的曲线图，与标准品进行对比分析进行核酸定量。优点是成本相对于Taqman探针法较低，可以做熔解曲线了解引物的Tm值，缺点是染料能与非特异性的dsDNA结合对实验结果产生干扰。特异性比探针法低。
第42卷第1期李春等：紫外分光光度法测定核酸含量的影响因素分析53
DOI： 10.13822/ki.hxsj.2020007049
化学试剂,2020,42(1) ,53-57
产Y Ay AY AY
j分析与测试
j
紫外分光光度法测定核酸含量的影响因素分析
李春'，刘建涛▽，高运华「，王治栋-段学欣$
(1•中国计量科学研究院前沿计量科学中心，北京100029；
2.天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津300072)
摘要：选择寡聚核昔酸、鮭鱼精单链DNA、小牛胸腺双链DNA标准物质为样本，系统研究了溶液pH、苯酚、丙酮、蛋白质、
多糖等对紫外分光光度法测量结果的影响情况，另外考察了核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的相互影响情况。
研究发现基于分光光度法的核酸定量分析，易受溶液pH、苯酚、丙酮、蛋白质、多糖等的影响，另外，DNA和RNA之间也
会相互干扰。因此，紫外分光光度法测定核酸含量时，特别是该方法用于核酸标准物质特性量值确定时，需要样品高度
纯化，pH确定的条件下才能保证测量结果的准确可靠。
关键词：紫外分光光度法；核酸；含量；影响因素；pH；有机试剂
中图分类号:0657.32 文献标识码：A 文章编号:0258-3283(2020)01 -0053-05
Influencing Factors of Determination of Nucleic Acid Content by Ultraviolet Spectrophotometry LI Chun' , LIU Jian-
taoi,2, GAO Yun-hua *1 , WANG Zhi-dong' , DUAN Xue-xin2 ( 1. Center for Advanced Measurement Science, College of Precision
Instrument and Optoelectronics Engineering,National Institute of Metrology,Beijing 100029,China；2.College of Precision Instru
