一、实验目的
1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。
3. 学会筛选和鉴定转化子。
二、实验原理
质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。
三、实验材料
1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）
2. 受体菌：大肠杆菌DH5α
3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等
4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等
四、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。
（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。
（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。
（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。
（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。
（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。 （7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。
2. 筛选和鉴定转化子
（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。
（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。
五、实验结果
1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。
2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。
一般普通质粒扩增：
先将质粒转化到DH5α等大肠杆菌中，通过扩大培养获取大量含有质粒的大肠杆菌。
大肠杆菌的培养需要用到LB液体培养基，配方见下文。根据质粒带有的抗生素抗性基因，还需要在LB中加入适量相应抗生素，如氨苄青霉素、卡那霉素等。
LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml 去离子水中，用NaOH 调 pH至7.5, 加去离子水至总体积 1 升,高压下蒸气灭菌 20 分钟。
质粒提取目前一般都有商业化生成的试剂盒销售，可按照相应试剂盒的说明书操作。
转化：
① 取出感受态细胞（也有商品化感受态销售），冰浴10分钟。
② 取连接产物10μl 放入感受态细胞中（100μl/管） ，轻轻旋转以混匀内容物，冰浴 30分
钟。
③ 42℃热休克 120 秒（按照需要加长或减少时间），不能摇动Ep管。冰浴 5 分钟，然后转移到事先预热至 37℃的无抗生素的普通LB培养基800ul，50~100rpm 37℃恒温振荡 1 小时 30 分钟。
④ 用无菌弯头玻棒铺菌器将150ul 菌液铺于含有抗生素的 LA平板。
⑤ 铺菌的LA 平板于 37℃正放 2~3 小时，然后倒置培养 16-24 小时。
⑥ 将疑似阳性克隆的白斑选出，接到新的含有抗生素的LB中培养14小时左右，做菌液PCR或抽提质粒酶切以进一步鉴定转化是否成功。
转染：
① 将3μl（约4μg）纯化好的经除菌的质粒DNA溶入250μl 无血清培养基 DMEM (无双抗) 中，轻轻混匀，室温放置 5 mim。
② 再吸取10 μl 脂质体溶入250 μl 无血清培养基 DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，室温放置5 mim。
③ 将制备好的DNA 与脂质体轻轻混合均匀，室温放置20 mim。然后加入1.5 ml 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，即为包裹好的脂质体/DNA。
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总结 质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定
一、实验目的
1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；
2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；
3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；
4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；
5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理
1.PCR(多聚酶链式反应)
在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：
A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备
(1).碱裂解法：
染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：
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总结 A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；
B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定
(2011-04-29 10:42:22)
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质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定
实验目的
1、学习和掌握限制性内切酶的特性
2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法
3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法
4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法
5、掌握α互补筛选法的原理
6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法
7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法
实验原理
重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。
限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。
DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。
目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：
（一）、具互补粘性末端片段之间的连接
大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。
