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质粒DNA的提取

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质粒DNA的提取

一、原理

采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的

差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋

结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链

不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又

恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过

离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除

去。

二、方法

1. 挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μ

g/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过

夜。

2. 将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。反复数次，收

集全部菌体。

3. 倾去上清，滤纸吸干。

4. 加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。

5. 加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L

NaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。

6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染

色体DNA。

7. 上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。

8. 上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。

9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。

10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。

lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。

12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混

匀。

13．37℃水浴30min。

14．样品放一20℃冰箱保存备用。

三、试剂

1．TE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)

配制方法：

Tris 1.211g

EDTA.Na 0.037g

用800ml重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整pH至8.0，加重蒸水定容至1000ml。

2．TENS溶液：(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L

NaOH,0.5%SDS) 配制方法：

NaOH O.4 g

SDS 0.5 g

加80mlTE缓冲液溶解。加TE缓冲液定容至lOOml.

3．3.0mol／1醋酸钠溶液(pH5.2)

配制方法：醋酸钠 24.6g

用70ml重蒸水溶解，再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。

纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体，使用之前必须重蒸，除去

能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解，重新进行蒸馏，当

温度升至183℃时，开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取

一瓶重蒸酚于分液漏斗中，加入等体积的lmol／L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液，立即加盖，激

烈振荡，并加入固体Tris摇匀调pH(一般100ml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相

pH至7.6一8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中，并加一定体积0.1mol／L Tris-

HCI(pH8．o)覆盖在酚相上，置4℃冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂，能引起腐蚀性损

伤，操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚，应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚

在空气极易氧化变红，要随时加盖，也可加入抗氧化剂o．1％8一羟基喹啉及o．2％β—

巯基乙醇。

5．无水乙醇

置-20℃冰箱中保存备用

6．70％乙醇

置-20℃冰箱中保存备用

7．核糖核酸酶(10mg／ml)

配制方法：称取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA，美国SIGMA或中科院上海生物化学研

究所东风试剂厂)。于灭菌的微离心管内，加1 ml 100mmol／pH5.0的NaAC溶液(完全溶

解)，即为10mg／ml RNase，为了破坏脱氧核糖核酸酶(DNase，置80℃水浴中10min或

100℃水浴2 min，然后置一20℃(或家用冰箱的冰格内)保存。

四、材料

1．菌种：

大肠杆菌(pUC57)

2．培养基

LB液体培养基

精解蛋白胨 3g

酵母浸出粉 1.5g

氯化钠 3 g

葡萄糖 0.6g 按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300ml。用10mol／LnaOH

调

pH至7．2～7．4。分装于15ml试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1．1kg／

cm2灭菌20min.

l抗菌素：

氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中，浓度为100mg／m1。

五、仪器：

恒温振荡器。

低温冰箱-20℃

真空泵。

台式高速离心机

六、说明

1．质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭一氯化铯

梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种，但基本原理

和步骤是一致的．包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体DNA的分离；(3)除

去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、

盐

等。

2．在基因操作实验中．保存或提取DNA过程中，一般都采用TE缓冲液，而不选用其它

的缓冲液。虽然很多缓冲系统．如磷酸盐缓冲系统，硼酸系统都符合细胞内环境的生理范

围，可以作为DNA的保存液，但在某些实验中，这些缓冲对会影响实验。如在转化实验

中，要用到Ca+，如果川磷酸盐缓冲液，磷酸根将与Ca2+产生Ca(PO4+沉淀；在各种工具

酶反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有的则要

求低盐浓度，采用Tris—HCI缓冲系统，不存在金属离子的干扰作用；作中的EDTA是二价

离子

Mg2+、Ca2+等的螯合剂，可降低系统中的这些离子浓度，而这些离产是脱氧核糖核酸酶的

辅

助因子，所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。

3、TENS中NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中稳定，怛当pH大于12或小于3

时，就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。TENS中有NaOH使其pH大于12，

因而

使染色体DNA与质粒DNA变性。

TENS中的SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂肪与

蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞中的核蛋白；(3)SDS能与蛋白质结合

成为R1一O一SO3…R2+一蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制

核

糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去干净，防止在下一步操作中(用 Rnase去除RNA时)受干扰。

4、3．0mol／L NaAC(pH5.2)使pH大于12的DNA抽提液回到中性，使变性的质粒

DNA

能够复性，并能稳定存在。染色体DNA不能复性(染色体DNA不存在超螺旋共价闭合环结

构) 而高盐的3mol/L NaAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、以及SDS—蛋白质

复合物凝聚沉淀。pH5．2也能中和核酸上的电荷，减少相互斥力而互相聚合。同时，钠盐

能与

SDS一蛋白质复合物作用后，形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

5．饱和酚：酚是一种表面变性剂，属非极性分子。水是极性分子。当蛋白质溶液与酚混

合合时，蛋白质分子之间的水分子被酚挤走，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心。变

性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，酚比重更大，保留在最

下层。酚作为变性剂．也有一些缺点：(1)酚与水有一定程度的互溶，酚相中水的溶解可达大

约10％～15％，溶解在这部分水相中有DNA会损失，(2)酚很容易氧化，变成粉红色，氧

化的酚容易降解DNA，解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸，除去氧化的部分，再用Tris

—HCl缓冲液饱和，使酚不至于夺去DNA中的水，带走部分DNA。饱和酚中加上8一羟

基硅啉及巯基乙醇，防止酚氧化，还是弱的螫合剂．可抑制DNase。由于有颜色．溶解在

酚中后，使酚带上

颜色，便于酚相与水相的分肉，酚饱和后，表面盖上一层Tris水溶液，隔绝空气，阻止酚氧

化。

6．关于无水乙醇沉淀DNA的说明：

用无水乙醇沉淀DNA，是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是具有极性，

可以以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起化学反应，对DNA很安全，因此是理想的

沉

淀剂。

乙醇之所以能沉淀DNA，是由于DNA溶液是以水合状态稳定存在的DNA，当加入乙

醇．乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合沉淀，一般实验中，用2倍

体积

的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的最终含量占67％左右。由此可预见，也可用95％乙

醇

沉淀DNA，但是用95％乙醇使总体积增大．而DNA在醇溶液中总有一定程度的溶解。因

而

DNA损失也增大，影响收率。

乙醇沉淀DNA溶液时，DNA溶液中应该有一定的盐浓度，中和DNA表面电荷。如果溶

液中盐浓度太低，要加NaAC或NaCl至最终浓度O.1一O.25mol／l在pH 8左右的DNA

溶液中，DNA分子带负电荷，加一定浓度的NaAC或NaCl使Na+中和DNA分子上的负

电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加

入的盐溶液浓度太低时。只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不

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质粒DNA的提取实验

质粒DNA的提取实验

实验六 质粒DNA的提取

一、实验目的

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒

二、实验原理

质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。

本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS（十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

三、实验材料与试剂

1、实验材料 大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）

2、实验试剂

(1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；

(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；

(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；

(4) 氯仿－异戊醇（24：1）；

(5) 异丙醇、70%乙醇；

四、实验步骤

（一）提取质粒

1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。（由老师完成）

2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。

3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm离心1min。

4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。 6. 加200μl新配制的溶液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,注意动作一定要轻柔缓和，切勿振荡!将离心管放置于冰上(2min)。

质粒DNA的提取

质粒DNA的提取

实验一 质粒DNA的提取

[实验目的]

通过本实验掌握碱裂解法提取质粒。

[实验原理]

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

[仪器、材料与试剂]

（一） 仪器

1、 恒温培养箱

2、 恒温摇床

3、 台式离心机

4、 高压灭菌锅

（二） 材料

1.葡萄糖

2.三羟甲基氨基甲烷（Tris）

3.乙二胺四乙酸（EDTA）

4.氢氧化钠

5.十二烷基硫酸钠（SDS）

6.乙酸钾

7.冰乙酸

8.乙醇

9.盐酸（HCl）

10.Bt菌株

11.吸头、小指管

（三） 试剂

1、 溶液I

50mmol/L 葡萄糖

5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl

10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0） 2、 溶液II

0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合

3、 溶液III

5mol/L乙酸钾 60mL

冰乙酸 11.5mL

水 28.5mL

4、 TE缓冲液

10mmol/L Tris·HCl

1mmol/L EDTA(pH8.0)

5、 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

[实验步骤]

质粒DNA的提取 2

质粒DNA的提取 2

质粒DNA的提取

一、原理

采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的

差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋

结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链

不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又

恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过

离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除

去。

二、方法

1. 挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μ

g/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过

夜。

2. 将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。反复数次，收

集全部菌体。

3. 倾去上清，滤纸吸干。

4. 加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。

5. 加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L

NaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。

6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染

色体DNA。

7. 上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。

8. 上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。

9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。

10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。

lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。

12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混

质粒DNA的提取 3

质粒DNA的提取 3

§2 质粒DNA的提取

一、实验目的

本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒pET22b的抽提，掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。

二、实验原理

载体是基因工程所必需的工具，它用于将目的基因运载到宿主细胞内的克隆与表达。自然界的质粒经改造以后，常被用作基因工程技术的基因载体。常用的载体有质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、逆转录病毒DNA和昆虫病毒DNA等，而质粒是最常用的载体。细菌质粒是存在于细菌染色体外，能够独立复制的环状DNA。

质粒DNA小量制备是基因工程操作中的常规技术，提取的质粒DNA可用于酶切、连接与转化等。从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离可依据并选择利用DNA分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构等特点来进行。常用的有碱变性抽提法，羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法，两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上各种方法均有利弊，因此在制备质粒DNA时，要根据以下几个方面进行比较，选择最佳的实验方法：（1）质粒特性：如质粒宿主的菌属，是否需要用溶菌措施。质粒DNA的大小，分子量大的在制备过程中易受损伤，DNA易产生缺口；拷贝数、构型、复制型是否需要氯霉素扩增等。（2）提取质粒DNA的用量与用途：如用于初筛比较分子量大小、进行酶切、作探针或测序等。（3）提取方法的成本、程序、重复性、纯度以及实验室具备的条件等。

目前实验室中最常用、最有效的方法为碱变性抽提法和溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法两种。碱变性抽提法效果良好，既经济且收得率较高。提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。但该法如操作不慎，会影响纯度，且步骤复杂，费时较多。对于分子量较大拷贝较少的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用氯化铯密度梯度超离心法抽提DNA，该法具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质粒DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用小量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于后续的操作。