实验六 质粒DNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒
二、实验原理
质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS（十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
三、实验材料与试剂
1、实验材料 大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）
2、实验试剂
(1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；
(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；
(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；
(4) 氯仿－异戊醇（24：1）；
(5) 异丙醇、70%乙醇；
四、实验步骤
（一）提取质粒
1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。（由老师完成）
2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。
3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm离心1min。
4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。 6. 加200μl新配制的溶液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,注意动作一定要轻柔缓和，切勿振荡!将离心管放置于冰上(2min)。
实验一 质粒DNA的提取
[实验目的]
通过本实验掌握碱裂解法提取质粒。
[实验原理]
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
[仪器、材料与试剂]
（一） 仪器
1、 恒温培养箱
2、 恒温摇床
3、 台式离心机
4、 高压灭菌锅
（二） 材料
1.葡萄糖
2.三羟甲基氨基甲烷（Tris）
3.乙二胺四乙酸（EDTA）
4.氢氧化钠
5.十二烷基硫酸钠（SDS）
6.乙酸钾
7.冰乙酸
8.乙醇
9.盐酸（HCl）
10.Bt菌株
11.吸头、小指管
（三） 试剂
1、 溶液I
50mmol/L 葡萄糖
5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl
10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0） 2、 溶液II
0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合
3、 溶液III
5mol/L乙酸钾 60mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
4、 TE缓冲液
10mmol/L Tris·HCl
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5、 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）
[实验步骤]
质粒DNA的提取
一、原理
采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的
差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋
结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链
不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又
恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过
离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除
去。
二、方法
1. 挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μ
g/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过
夜。
2. 将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。反复数次，收
集全部菌体。
3. 倾去上清，滤纸吸干。
4. 加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5. 加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L
NaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染
色体DNA。
7. 上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8. 上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混
§2 质粒DNA的提取
一、实验目的
本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒pET22b的抽提，掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。
二、实验原理
载体是基因工程所必需的工具，它用于将目的基因运载到宿主细胞内的克隆与表达。自然界的质粒经改造以后，常被用作基因工程技术的基因载体。常用的载体有质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、逆转录病毒DNA和昆虫病毒DNA等，而质粒是最常用的载体。细菌质粒是存在于细菌染色体外，能够独立复制的环状DNA。
质粒DNA小量制备是基因工程操作中的常规技术，提取的质粒DNA可用于酶切、连接与转化等。从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离可依据并选择利用DNA分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构等特点来进行。常用的有碱变性抽提法，羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法，两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上各种方法均有利弊，因此在制备质粒DNA时，要根据以下几个方面进行比较，选择最佳的实验方法：（1）质粒特性：如质粒宿主的菌属，是否需要用溶菌措施。质粒DNA的大小，分子量大的在制备过程中易受损伤，DNA易产生缺口；拷贝数、构型、复制型是否需要氯霉素扩增等。（2）提取质粒DNA的用量与用途：如用于初筛比较分子量大小、进行酶切、作探针或测序等。（3）提取方法的成本、程序、重复性、纯度以及实验室具备的条件等。
目前实验室中最常用、最有效的方法为碱变性抽提法和溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法两种。碱变性抽提法效果良好，既经济且收得率较高。提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。但该法如操作不慎，会影响纯度，且步骤复杂，费时较多。对于分子量较大拷贝较少的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用氯化铯密度梯度超离心法抽提DNA，该法具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质粒DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用小量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于后续的操作。
