质粒dna的提取

实验六 质粒DNA的提取

一、实验目的

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒

二、实验原理

质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。

本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS（十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

三、实验材料与试剂

1、实验材料 大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）

2、实验试剂

(1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；

(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；

(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；

(4) 氯仿－异戊醇（24：1）；

(5) 异丙醇、70%乙醇；

四、实验步骤

（一）提取质粒

1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。（由老师完成）

2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。

3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm离心1min。

4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。 6. 加200μl新配制的溶液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,注意动作一定要轻柔缓和，切勿振荡!将离心管放置于冰上(2min)。

service@ 质粒DNA的提取与电泳鉴定

质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一

种最常用的方法：

碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银

染序列分析。方法如下：

1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管

8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中

煮沸法

1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

质粒DNA的大量提取和纯化

在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒

质粒的大量提取

质粒大量提取的主要试剂

溶菌酶（10 mg/ml）：100 μl 1 M Tris-HCl（pH 8.0），0.1 g 溶菌酶，加超纯水至10 ml，混匀，可根据用量分装至小管，置于-20 ℃保存。

1×TE（pH 8.0）：5 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0），1 ml 0.5 M EDTA，加超纯水定容至500 ml，湿热灭菌，室温保存。

RNaseA（10 mg/ml）：0.1 g RNaseA，33 μl 3 M NaAc（pH 5.2），加超纯水至9 ml，100 ℃，15 min，冷却至室温，置于-20 ℃保存。

25％ 蔗糖：25 g 蔗糖，5 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0），加超纯水定容至100 ml，置于4 ℃保存。

0.5 M EDTA：186.1 g EDTANa2H2O，NaOH约20 g，加800 ml超纯水溶解完全后，调pH至7.6，定容至1 L，湿热灭菌，室温保存。

Triton-lysis：1 ml 10% Triton-100，12 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0），5 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0），加超纯水定容至100 ml，室温保存。

PEG8000：150 g PEG8000，150 ml 5 M NaCl，加超纯水定容至500 ml，常温保存。

EB（10 mg/ml）：10 mg EB，加超纯水1 ml，溶解，室温保存。

质粒大量提取的步骤（CsCl超速离心纯化DNA）

A. 取1 ml含目的质粒的菌液，接种到400 ml含80 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃摇床上剧烈振荡（200 rpm）培养12 h左右。

B. 将菌液倒入离心瓶，4200 rpm离心13 min；弃上清，菌体沉淀用6 ml含25％ 蔗糖的50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液重悬。

质粒的大量提取

质粒大量提取的主要试剂

溶菌酶（10 mg/ml）：100 μl 1 M Tris-HCl（pH 8.0），0.1 g 溶菌酶，加超纯水至10 ml，混匀，可根据用量分装至小管，置于-20 ℃保存。

1×TE（pH 8.0）：5 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0），1 ml 0.5 M EDTA，加超纯水定容至500 ml，湿热灭菌，室温保存。

RNaseA（10 mg/ml）：0.1 g RNaseA，33 μl 3 M NaAc（pH 5.2），加超纯水至9 ml，100 ℃，15 min，冷却至室温，置于-20 ℃保存。

25％ 蔗糖：25 g 蔗糖，5 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0），加超纯水定容至100 ml，置于4 ℃保存。

0.5 M EDTA：186.1 g EDTANa2H2O，NaOH约20 g，加800 ml超纯水溶解完全后，调pH至7.6，定容至1 L，湿热灭菌，室温保存。

Triton-lysis：1 ml 10% Triton-100，12 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0），5 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0），加超纯水定容至100 ml，室温保存。

PEG8000：150 g PEG8000，150 ml 5 M NaCl，加超纯水定容至500 ml，常温保存。

EB（10 mg/ml）：10 mg EB，加超纯水1 ml，溶解，室温保存。

质粒大量提取的步骤（CsCl超速离心纯化DNA）

A. 取1 ml含目的质粒的菌液，接种到400 ml含80 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃摇床上剧烈振荡（200 rpm）培养12 h左右。

B. 将菌液倒入离心瓶，4200 rpm离心13 min；弃上清，菌体沉淀用6 ml含25％ 蔗糖的50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液重悬。