2017_2018高中生物第4章现代生物技术第15课时聚合酶链式反应技术同步备课教学案北师大版选修1

第15课时聚合酶链式反应技术[学习导航] 1.阅读教材P77～78内容，掌握PCR技术原理。

2.结合教材P79～80内容，了解PCR 技术的基本操作过程，讨论PCR技术的影响因素。

[重难点击] 1.简述PCR的原理。

2.了解PCR技术的基本操作过程并讨论PCR技术的影响因素。

一、PCR的原理聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的，请结合已学习的DNA分子结构和复制的相关知识，分析PCR的原理。

1.DNA的平面结构示意图(1)写出各个标号的名称①胞嘧啶；②腺嘌呤；③鸟嘌呤核糖；④胸腺嘧啶；⑤脱氧核糖；⑥磷酸基团；⑦胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；⑧氢键；⑨碱基对；⑩一条脱氧核糖核苷酸链。

(2)DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA链的方向，通常将羟基末端称为3′端；将磷酸基团的末端称为5′端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。

答案左链上5′端，下3′端；右链上3′端，下5′端。

2.细胞内DNA复制条件分析3.PCR原理与反应过程(1) PCR概念：是一种体外酶促合成特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。

(2)条件及作用(3)反应过程①变性温度上升到94～98 ℃时，目的DNA双链变性解旋为单链模板。

②复性温度下降到40～60 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

③延伸温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核糖核苷酸在耐热的Taq DNA聚合酶的作用下。

根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

④循环：继续上述的3个过程，DNA片段被不断的扩增。

若开始加入了N个DNA模板片段，理论上，循环n次后能获得N·2n个DNA片段。

1.PCR原理PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。

答案不相同。

体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工合成的单链DNA片段。

2.PCR反应过程(1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？答案PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。

由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高温。

(2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。

答案每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。

(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？答案DNA的羟基(—OH)末端为3′端，磷酸基团的末端为5′端。

当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是( )A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链B.DNA复制不需要引物C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D.PCR扩增的对象是氨基酸序列答案 C解析DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物；DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，而不能从5′端延伸DNA链；引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合；PCR 扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。

2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是_________。

(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶，该酶是从____________________中分离的。

(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是______________。

(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在______________中才能进行，并且要严格控制________条件。

(5)PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是____________________________。

答案(1)DNA的热变性原理(2)水生耐热细菌Taq(3)耐高温(4)一定的缓冲溶液温度(5)2 作为DNA复制的起点解析(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。

(2)Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。

(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。

(4)PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。

(5)PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。

PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。

一题多变细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？答案需要。

细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。

易错提醒与PCR原理有关的三个易错点(1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。

不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。

(2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

(3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。

二、DNA片段的PCR扩增和产物检测DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。

阅读教材，完善下列内容：1.DNA片段的PCR扩增准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上↓移液：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分↓混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁↓离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，目的是使反应液集中在离心管底部↓反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应(1)加入离心管中的物质应包括：模板DNA、Taq DNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核苷酸、2种引物、缓冲液。

(2)离心管中要加入少量石蜡油，目的是防止反应溶液的挥发。

(3)热循环仪的反应程序应设定为：(4)影响因素：在PCR实验中，需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中温延伸的时间越长；引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择，如果引物越短，A、T含量越多，复性温度就越低，反之引物越长，G、C含量越多，复性温度就越高，这是因为G、C 之间是由3个氢键连接，A、T之间是由2个氢键连接。

(5)PCR过程中，循环次数是不是越多越好？答案不是。

Taq DNA聚合酶在PCR扩增过程中存在1×10－5的出错几率，而且随着循环次数的增加，其活性也会逐渐降低。

因此，PCR过程中，循环次数并非越多越好，一般控制在25～35个循环。

2.扩增产物的检测(1)原理：琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔，带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。

DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小，因此大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。

(2)过程配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，制作成电泳胶板↓在DNA样品中加入0.2倍体积的载样缓冲液混匀↓取20 μL加入样品孔内↓80 V稳压电泳20～40 min↓当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部时，切断电源↓将胶板浸入溴化乙锭溶液染色5～10 min↓在紫外透射仪上观察电泳条带1.实验过程分析(1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？答案离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。

微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。

(2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？答案离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。

(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？答案为避免外源DNA等的污染。

在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

2.结果检测(1)实验中为什么要测定DNA的含量？答案实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。

(2)如何判断DNA扩增成功？答案①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。

②电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

(3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？答案样品产物少，或产生新的DNA。

3.使用PCR仪具体实验操作顺序应为( )①设计好PCR仪的循环程序②按配方准备好各组分③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分④进行PCR反应⑤离心使反应液集中在离心管底部A.②③⑤④①B.①⑤③②④C.②③⑤①④D.④②⑤③①答案 C解析PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)→移液→混合→离心→反应。

PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。

4.近20年来，PCR技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

(1)加热使DNA双链间的______键完全打开，称为______；而在细胞中是在_______酶的作用下进行的。

(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入________种特定的引物。

当温度降低至40 ℃时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的______端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是______________。

(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的________和__________，前者由________自动调控，后者则靠__________来维持。

(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N 标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。