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《蛋白质的提取和分离》讲义一、蛋白质提取和分离的意义蛋白质是生命活动的主要承担者，在生物体中发挥着极其重要的作用。
从细胞、组织或生物体中提取和分离出特定的蛋白质，对于深入研究蛋白质的结构与功能、疾病的诊断与治疗、新药的研发以及生物技术的应用等方面都具有至关重要的意义。
例如，在医学领域，通过分离和鉴定患者体内的特定蛋白质标志物，可以早期诊断疾病，如癌症标志物的检测；在生物技术中，提取和纯化具有特定功能的蛋白质，如酶，可用于工业生产中的生物催化过程。
二、蛋白质提取的方法1、机械破碎法这是一种较为直接的方法，通过使用匀浆器、研钵、捣碎机等工具将细胞或组织破碎，使蛋白质释放出来。
但这种方法可能会导致蛋白质的部分变性。
2、化学渗透法利用某些化学试剂，如表面活性剂、有机溶剂等，改变细胞膜的通透性，从而使细胞内的蛋白质释放到溶液中。
但需要注意化学试剂的浓度和处理时间，以免对蛋白质造成过度损伤。
3、酶解法使用特定的酶，如溶菌酶、蛋白酶等，分解细胞壁或细胞膜，释放出蛋白质。
这种方法相对温和，但需要选择合适的酶和反应条件。
三、蛋白质分离的方法1、离心分离法基于不同物质的密度差异，通过离心力的作用将蛋白质与其他杂质分离开来。
常见的有低速离心、高速离心和超速离心等。
2、沉淀法通过加入某些试剂，如盐类（硫酸铵）、有机溶剂（乙醇、丙酮）等，改变蛋白质的溶解度，使其沉淀下来。
沉淀后的蛋白质可以通过离心或过滤收集。
3、层析法这是一种非常有效的分离方法，包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
（1）凝胶过滤层析：根据蛋白质分子大小的不同进行分离。
（2）离子交换层析：利用蛋白质所带电荷的差异进行分离。
（3）亲和层析：基于蛋白质与特定配体之间的特异性结合进行分离。
4、电泳法在电场作用下，蛋白质因所带电荷和分子大小的不同而发生迁移，从而实现分离。
常见的有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和琼脂糖凝胶电泳等。
四、蛋白质提取和分离的实验流程1、材料的选择与预处理选择富含目标蛋白质的材料，并进行适当的处理，如清洗、破碎等。
14.蛋白质的提取和分离-沪科教版选修1 生物技术实践教案一、实验目的了解蛋白质的提取和分离方法，掌握蛋白质质量的测定技术。
二、实验原理1.蛋白质的提取蛋白质的提取一般包括以下步骤：（1）细胞破碎：通过机械破碎、超声波破碎和化学破碎等方法将细胞破碎，使细胞内的蛋白质从细胞内溶液释放出来。
（2）蛋白质分离：利用离心、滤过和电泳等方法对细胞提取液进行分离，得到纯净蛋白质。
2.蛋白质的分离蛋白质的分离可以采用以下方法：（1）电泳法：将蛋白质溶液放在电泳胶上，通过电泳运动将蛋白质分离出来。
（2）硫酸铵分级沉淀法：根据蛋白质在不同硫酸铵饱和度下的溶解度差异进行分离。
（3）柱层析法：利用不同蛋白质成分的分子量、电荷、亲和力等差异，分离出不同的蛋白质。
三、实验步骤1.蛋白质提取（1）取一定数量的细胞或组织，洗涤干净；（2）将细胞或组织加入含有破碎酶或超声波液中，进行破碎；（3）离心收集液体，去除碎细胞、细胞膜和碎骨等。
2.蛋白质分离（1）电泳法：将蛋白溶液通过电泳胶进行电泳，按照不同速度分离出含有目标蛋白的凝胶。
（2）硫酸铵分级沉淀法：将蛋白质溶液分别在不同硫酸铵饱和度下进行沉淀，分离出不同的蛋白质。
（3）柱层析法：将蛋白溶液通过不同材质的层析柱进行分离，分离出不同的蛋白质。
3.测定蛋白质含量测定蛋白质含量可以采用比色法、BCA法和Lowry法等方法。
四、实验注意事项（1）进行实验时要佩戴实验手套；（2）破碎细胞时保持冷却状态，防止酶的活性降低；（3）分离过程中要严格控制温度，在低温下进行实验，防止蛋白质变性。
五、实验结果分析通过实验，我们可以了解蛋白质的提取和分离方法，掌握蛋白质质量的测定技术。
在实验的过程中，我们还可以观察到蛋白质质量的变化和分离程度，并进行相应的分析。
六、实验拓展在实验的基础上，可以进行以下拓展：（1）利用已有的蛋白质分离技术，分离出某种目标蛋白；（2）应用分离出的蛋白质进行进一步的生物学研究、泛素化等研究。
第14课时蛋白质的提取和分离[学习导航] 1.阅读教材P74～75内容，理解电泳、同工酶和蛋白质组学。
2.结合教材P73～75内容，进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。
3.结合教材P73～75内容，总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。
[重难点击] 1.进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。
2.总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。
一、电泳、同工酶和蛋白质组学带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。
电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。
1.电泳(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
(2)原理①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团会带上正电或负电。
②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
(3)常用的电泳方法①琼脂糖凝胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入琼脂糖，蛋白质分子的迁移速率主要取决于其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
②变性胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入十二烷基硫酸钠(SDS)变性剂，蛋白质都变为椭圆形，SDS带有大量的负电荷，掩盖了不同蛋白质的电荷差异，因此变性胶电泳中影响蛋白质的迁移速率的主要因素是蛋白质分子的大小。
2.同工酶同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。
乳酸脱氢酶一般含有5种同工酶，其相对分子质量相同，但所带电荷不同。
3.蛋白质组学蛋白质组学指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的氨基酸组成分析、立体结构研究和蛋白质的人工合成等。
由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。
蛋白质组学的研究不仅能分析生物体内蛋白质的组成，还可以揭示各种蛋白质在生物体内的相互作用与联系。
1.从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？答案各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。
2.变性胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？答案否。
因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质－SDS复合物，SDS所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。
归纳总结琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳的两点区别(1)分离原理不同①琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。
②变性胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。
(2)用途不同①琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。
②变性胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。
1.带电荷的蛋白质在电场中移动的速度主要取决于( )A.所带的电荷多少B.蛋白质的分子大小C.蛋白质的相对分子质量D.蛋白质的分子大小和所带的电荷多少答案 D2.下列说法中，不正确的是( )A.同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同B.同工酶的相对分子质量一定不同C.蛋白质的多样性决定了其功能的多样性D.蛋白质组学是21世纪生命科学研究领域新的前沿答案 B解析同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同，乳酸脱氢酶的5种同工酶的相对分子质量是相同的。
特别提醒同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。
产生同工酶的主要原因是在进化过程中基因发生变异，而其变异程度尚不足以成为一个新酶。
二、乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离下面我们以乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离为例，体验蛋白质的提取和分离技术。
1.乳酸脱氢酶同工酶的提取(1)取5 g新鲜的动物心脏，漂洗干净后剪碎到预冷的玻璃匀浆器中，加入25 mL磷酸提取缓冲液，然后冰浴研磨成匀浆(如图1)。
(2)将匀浆收集到冰浴的离心管中，在4 ℃条件下12 000 rpm离心10 min。
吸取上清液，然后在4 ℃条件下保存备用(如图2)。
2.琼脂糖凝胶电泳分离(1)制备琼脂糖凝胶：用TBE电泳缓冲液配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，加热溶解后混匀，缓慢倒入胶床中，插入适当的梳子，室温冷却至凝胶凝固。
拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，然后向电泳槽中加入适量TBE电泳缓冲液(如图3)。
(2)加样：取适量同工酶提取液与等量载样缓冲液(质量分数40%的蔗糖溶液、0.25%溴酚蓝)混匀，然后取20 μL加入样品孔内。
(3)电泳：100 V条件下进行电泳约30 min。
(4)染色：当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部时切断电源，取出胶板浸入染色液中，37 ℃染色15～30 min，水洗后观察电泳结果。
3.结果分析由图中电泳结果可以看出：(1)每个器官形成了5个条带说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。
(2)LDH2在心脏中含量最高，在骨骼肌中含量最低，说明不同的器官同一种同工酶的含量不同。
(3)骨骼肌中含量最高的是LDH5，含量最低的是LDH1，说明同一器官不同的同工酶含量不同。
1.提取和分离乳酸脱氢酶同工酶过程中为什么要保持酶的活性？答案酶作为一类特殊的蛋白质(具有生物催化活性)，在其提取和分离过程中必须保持其生物活性，这样分离出的酶才有可能用来研究其生化性质及相关功能。
2.制备乳酸脱氢酶同工酶提取液的过程中，哪些是为了保持酶活性而采取的措施？答案①提供必要的缓冲系统，以维持pH的相对稳定，防止破坏其活性；②保持低温环境，如将玻璃匀浆器和离心管预冷，低温离心；③避免引入其他杂质或变性剂，导致酶变性，如对材料进行漂洗。
3.溴酚蓝为什么能作为乳酸脱氢酶同工酶的指示剂？答案溴酚蓝能和乳酸脱氢酶同工酶发生特定的反应，形成特殊的蓝紫色产物。
归纳总结(1)实验步骤概括：取材→剪碎→漂洗→匀浆→离心→制凝胶→加样→电泳→染色→冲洗→观察。
(2)实验操作要点①所有提取乳酸脱氢酶同工酶用到的器具最好都提前在冰箱中预冷处理，这样能更好地保持酶的活性。
②蛋白质样品在上样之前，要与等量载体缓冲液混匀。
载样缓冲液中的蔗糖可增加蛋白质样品的比重，防止加样时发生“漂样”现象；溴酚蓝作为一种电泳前沿指示剂，判断电泳的进行程度。
③将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作用下会向正极移动。
3.在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中，使用缓冲液的作用是( )A.维持溶液浓度不变B.维持溶液酸碱度不变C.催化蛋白质分离过程顺利完成D.无实际意义答案 B解析分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。
4.下列说法不正确的是( )A.在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性B.将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，是为了保证酶的活性C.载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质，维持pH稳定D.电泳结果出现了5个条带，说明乳酸脱氢酶有5种同工酶答案 C解析酶提取之后要进行一系列活性条件下的研究，因此在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性，将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，就是为了保证酶的活性。
载样缓冲液中的溴酚蓝是一种指示剂，指示酶的迁移位置；电泳结果出现了5个条带说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。
特别提醒琼脂糖凝胶电泳的优点(1)琼脂糖含液体量大，近似自由电泳。
(2)琼脂糖作为支持体有均匀、区带整齐、分辨率高、重复性好等优点。
(3)电泳速度快。
(4)区带易染色，样品易回收，有利于制备。
(5)操作简单、快速、灵敏。
1.下列有关同工酶的概念，描述正确的是( )A.催化相同的化学反应，酶蛋白的分子结构、理化性质不同，电泳行为不同B.催化不同的化学反应C.催化不同的化学反应，酶蛋白的分子结构、理化性质相同，电泳行为相同D.催化相似的化学反应答案 A解析同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质以及免疫学性质不同的一组酶。
2.乳酸脱氢酶有几种同工酶( )A.2B.3C.4D.5答案 D解析乳酸脱氢酶的同工酶共有5种。
3.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因( )A.分子带电性质的差异B.分子的大小C.分子的形状D.分子的变性温度答案 D解析电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。
4.科学家发现蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。
这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者的重视。
分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的__________、大小及形状不同，在电场中的__________不同而实现的分离。
答案电荷(带电情况) 迁移速度解析电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
课时作业[基础过关]1.电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷__________的电极移动( )A.相同B.相反C.相对D.相向答案 B解析在一定的pH下，生物大分子中有某些可解离的基团，这些基团会带上正电荷或负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
2.电泳实现样品中各种分子的分离是利用了( )A.各种分子带电性质的差异B.分子本身的大小不同C.分子形状的不同D.以上都正确答案 D解析电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小和形状差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
3.下列关于同工酶的叙述正确的是( )A.同工酶是由多个亚基以共价键结合形成的复合物B.同工酶对同一种底物有不同的专一性C.同工酶是催化同一种反应，但结构不完全相同的同一种酶的多种形式D.各种同工酶在电场电泳时，迁移速率相同答案 C解析同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。
4.在进行琼脂糖凝胶电泳前，用什么溶液溶解琼脂糖( )A.蒸馏水B.自来水C.缓冲液D.蔗糖溶液答案 C解析用电泳缓冲液溶解琼脂糖，如TBE，这样就能保证凝胶中的离子浓度与电泳液中的离子浓度相同，在电场中活动一致。
5.各种动物血清内乳酸脱氢酶同工酶的组成是不同的。
可以通过比较各种动物乳酸脱氢酶同工酶差异的大小来判断动物之间亲缘关系的远近。
下列各种实验方法中，不能采用的是( )A.测乳酸脱氢酶同工酶的氨基酸序列B.测控制乳酸脱氢酶同工酶合成的基因碱基序列C.用电泳法比较各种动物乳酸脱氢酶同工酶的电泳带D.检测不同动物的乳酸脱氢酶同工酶的pH答案 D解析生物是由共同的原始祖先进化而来的，各种生物之间具有或近或远的亲缘关系，亲缘关系越近，则其对应基因的碱基序列的相似程度就越高，而基因控制蛋白质的合成，故其对应的蛋白质的氨基酸序列相似程度也就越高。
