下载文档原格式
Elispot的原理及应用1. Elispot是什么Elispot（enzyme-linked immune spot assay）是一种用于测定单个细胞的分泌功能的实验技术。
它通过检测分泌细胞在特定条件下产生的细胞因子或细胞分泌物的分泌量，来评估细胞的免疫反应。
Elispot被广泛应用于免疫学、肿瘤学、感染病学等领域的研究和诊断。
2. Elispot的原理Elispot基于细胞分泌物的分泌原理进行测定。
其原理主要包括以下几个步骤：1.准备ELISPOT板：将特定抗体或刺激物涂覆在固相支持体上，形成抗原或刺激物捕获层。
常用固相支持体有多孔膜、96孔板等。
2.加样细胞：将待测细胞或其他产生细胞分泌物的细胞加入到ELISPOT板中，使其与抗原或刺激物接触。
3.细胞刺激：经过一定的培养条件和时间，刺激细胞产生分泌物。
4.分泌物检测：将细胞移除，用特异性抗体标记待测细胞分泌物中的目标分子，形成复合物。
5.免疫反应可见化：通过酶标法或荧光法，使复合物与ELISPOT板上的底物发生反应，产生可观察的斑点。
3. Elispot的应用Elispot技术广泛应用于以下领域：3.1 免疫学研究Elispot可以用于研究多种细胞因子的产生情况，如干扰素γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等。
它可以检测单个细胞的分泌情况，并通过对不同细胞类型进行比较，揭示免疫细胞的功能和相互作用。
3.2 肿瘤学研究Elispot可以评估肿瘤特异性T细胞的活性和功能。
通过使用与肿瘤相关的抗原刺激细胞，可以检测肿瘤特异性T细胞的分泌情况，进而评估免疫治疗的效果和抗肿瘤免疫应答的强度。
3.3 感染病学研究Elispot在感染病学研究中起到重要作用。
通过检测特定感染病原体的抗原刺激下，细胞分泌物的产生情况，可以评估免疫应答的强度和类型，并且可以用于疫苗开发和新药筛选等领域。
3.4 自身免疫性疾病研究Elispot可以用于评估自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等）患者的自身免疫反应。
ELISPOT工作原理关键信息项：1、 ELISPOT 技术的定义2、涉及的实验材料和设备3、实验操作步骤4、数据采集与分析方法5、技术的优势和局限性11 ELISPOT 技术的定义ELISPOT（EnzymeLinked Immunospot Assay），即酶联免疫斑点检测技术，是一种用于检测和定量单个细胞分泌特定蛋白质的免疫学方法。
111 原理概述ELISPOT 基于细胞分泌的蛋白质能够在细胞周围的固相载体上形成可见斑点的原理。
当被检测的细胞受到特定刺激后，会分泌特定的细胞因子或抗体等蛋白质。
这些分泌的蛋白质会被预先包被在固相载体（通常是微孔板）上的特异性抗体捕获。
112 与其他技术的比较与传统的 ELISA（酶联免疫吸附测定）方法相比，ELISPOT 能够检测单个细胞的分泌水平，而 ELISA 则是对细胞群体分泌的总和进行测量。
12 涉及的实验材料和设备121 固相载体通常使用 96 孔或 384 孔的微孔板，表面经过特殊处理以增强抗体的吸附。
122 捕获抗体针对待检测的细胞因子或蛋白质的特异性抗体，用于包被微孔板。
123 检测抗体与捕获抗体识别不同表位的另一种特异性抗体，通常与酶标记物结合。
124 酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等，用于催化显色反应。
125 显色底物根据所使用的酶标记物选择相应的显色底物，产生可见的斑点。
126 细胞培养相关试剂包括培养基、血清、刺激剂等。
127 细胞分离和制备设备如离心机、移液器等。
13 实验操作步骤131 微孔板包被将捕获抗体稀释至适当浓度，加入微孔板中，在适当条件下孵育，使抗体吸附在微孔板表面。
132 封闭用封闭液封闭微孔板上未结合抗体的位点，以减少非特异性结合。
133 细胞接种将处理好的细胞悬液加入微孔板中，在特定条件下培养。
134 刺激根据实验目的，加入适当的刺激剂，诱导细胞分泌目标蛋白质。
135 孵育在适当的温度和时间条件下孵育，使细胞分泌的蛋白质被捕获抗体捕获。
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
ELISPOT工作原理ELISPOT是一种基于酶联免疫斑点（enzyme-linked immunospot）技术的生物学实验方法，用于检测单个活细胞产生的细胞因子数量，以获得关于特定免疫反应的定量信息。
ELISPOT方法已成为研究和临床诊断中常用的细胞免疫分析技术。
本文旨在介绍ELISPOT技术的原理和应用。
1. ELISPOT技术的基本原理ELISPOT技术的基本原理是利用单个细胞在聚焦区域中分泌细胞因子的能力。
首先在多孔板上涂覆特定抗体，并使用细胞悬浮液孵育，使细胞吸附在多孔板上，然后刺激细胞产生细胞因子，特异性抗体识别并结合细胞因子，供试细胞被固定，而其产生的细胞因子仍然可扩散进入周围。
接着使用酶标技术，添加酶标抗体-酶复合物识别并结合周围可扩散的细胞因子，形成可被酶底物着色的斑点。
ELISPOT试验可用于检测细胞因子的免疫反应，可以在不光化细胞，也无需使用放射性同位素进行标记的情况下，测定非常微量的细胞因子。
2. ELISPOT技术的应用ELISPOT技术的应用非常广泛，可以用于研究细胞免疫学、癌症、感染病原体和自身免疫性疾病等。
下面将分别介绍这些应用。
2.1. 研究细胞免疫学ELISPOT技术可以用于检测不同和同种发育阶段、性别、某些基因型或特定条件下的免疫细胞产生的细胞因子。
例如，可以对不同的激活剂进行测试，检测免疫细胞的分泌情况，揭示特定免疫反应的机制。
此外，由于ELISPOT对特异性和非特异性T和B淋巴细胞的敏感性非常高，所以可以使用这种技术来监测疫苗接种效果或者进行不同细胞因子分子和癌细胞的功能评估等。
2.2. 癌症的研究和治疗免疫疗法已成为一种治疗恶性肿瘤的新式方法，其中包括活体细胞治疗和肿瘤抗原刺激，此类方法具有极大的潜力来抑制肿瘤细胞的增长和扩散。
ELISPOT技术用于评估肿瘤抗原特异性T细胞水平的变化，可以在研究和临床实验中确定特异性的肿瘤抗原。
ELISPOT技术具体可用于肿瘤特异性免疫反应的检测、克隆增殖能力的测定、转移性肿瘤特异性T细胞反应的检测，以及抗肿瘤免疫反应治疗效果的评估等。
酶联免疫斑点技术摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。
关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。
80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
1.ELISPOT技术的发展史1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。
但该方法不够灵敏。
另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。
1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。
另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。
固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。
1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。
1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-γ分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。
多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。
ELISPOT检测HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞(PBMC)是否有候选肽特异性的T淋巴细胞，候选肽能否将它激活。
用ELISPOT检测活化T细胞分泌的IFN-r证实在正常人PBMC中是否有NY-BR-1特异性的CTL存在，同时也反应了各肽的免疫原性。
ELISPOT和51Cr杀伤实验检测表位肽的免疫原性结果显示HLA-A2阳性健康人外周血中有候选肽MLLQQNVDV(167～175)和NMWLQQQLV(1274～1282)特异性的前体细胞。
1．什么是ELISPOT检测?答:酶联免疫斑点( enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT) 检测技术是通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况的一种方法。
淋巴细胞在体内被抗原激活后，或者在体外培养中被培养液中含有的特异性抗原或刺激剂激活后，将这些细胞转入ELISPOT培养板中。
这些活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子，在孵育的过程中可在分泌细胞原位被ELISPOT培养板上包被的特异性细胞因子抗体所捕获。
将细胞和过量的细胞因子洗除后，加入生物素标记的检测抗体，孵育后洗去多余检测抗体。
然后加入酶标记的链亲和素（二抗），孵育后洗去多余酶标链亲和素（二抗）。
最后加入酶的底物，作用后可形成不溶的颜色产物即斑点（SPOT）。
每个斑点是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。
实验结果可在显微镜下观察或使用酶联免疫斑点自动图象分析仪（BioReader 4000 Pro-X）来进行计数分析。
该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及记数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的情况。
第二部分：关于ELISPOT试验技术中对细胞的处理1．提取外周血淋巴细胞时，有那些注意事项？答：如果取外周血淋巴细胞(PBMC) 进行ELISPOT检测，最好采用新鲜血液。
在保证无菌操作的前提下，首先应保证取血时抗凝剂应及时充分的与血液混匀，避免血凝块的出现。
ELISPOT入门知识一、 ELISPOT技术概述1、技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文:Enzyme-linked Immunospot Assay。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术(即ELISA技术)，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是:用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来(Sedgwick JD 2005)。
该技术检测细胞因子具有三大优点:其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的第 1 页共 8 页的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法(Kalyuzhny AE 2005)。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
(由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
)之后，在培养板的孔内加入细胞培养基(现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清)、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。
在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。
ELISPOT入门知识一、ELISPOT技术概述1、技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。
在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。
每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞（Spots forming cells SFCs）。
统计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的频率。
2、ELISPOT的发展历史ELISPOT方法从创立至今已经有20多年的历史了。
1983年，在地球南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立的创立了这项技术。
一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth，牵头人是当时正在当地Margaret女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。
另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者Cecil C. Czerkinsky （Czerkinsky CC et. al., 1983a）。
前者开创ELISPOT方法是为了研究B 淋巴细胞分泌IgM抗体的情况（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）；而后者除了用于研究B淋巴细胞分泌抗体的情况（Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c），还应用于大肠杆菌分泌肠毒素（Czerkinsky CC et.al., 1983a）和成纤维细胞分泌纤维连接蛋白（Czerkinsky CC et. al., 1984）的研究中。
虽然研究的对象不一样，但是该实验技术所涉及的原理以及方法步骤和我们现在的标准ELISPOT几乎完全相同。
这二十多年来，ELISPOT基本技术并没有什么重大变化，但是技术进步一直没有停顿，实验材料的改进了，实验灵敏度与重复性提高了，实验应用领域也拓宽了。
（1）底板材质的改进ELISPOT技术从创立之初，检测底板都是使用的普通塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此实验的灵敏度有限。
1985年，Moller SA和Borrebaeck CA 将膜板引入ELISPOT中（Moller SA et. al., 1985），检测的也是分泌抗体的阳性B细胞。
他们引入的是硝酸纤维素膜，获得了远远优于塑料板的结果。
1995年，荷兰Utrecht大学免疫研究所的Schielen P团队（该团队后来挂靠Utrecht大学，创办了荷兰U-Cytech 公司，成为世界上顶级的ELISPOT试剂盒生产商之一）把一种更优于硝酸纤维素膜的PVDF膜也被引入了ELISPOT检测中（Schielen P et. al., 1995）。
做过Westernblot的人都知道，PVDF膜比硝酸纤维素膜有更优的蛋白吸附性质，更加精细的显色条带分辨率。
因此，PVDF的引入是继硝酸纤维素膜之后，ELISPOT底板材料的又一次重大突破（McCutcheon M et. al., 1997）。
至今，PVDF膜几乎完全取代了NC膜（Weiss AJ 2005）。
“反者道之动”。
塑料板在被膜板取代之后，沉寂了许多年，现在又开始兴旺起来了（Ronnelid J et. al., 1997; Okamoto Y et. al., 1997）。
最著名的塑料ELISPOT板当数荷兰U-Cytech公司研发的透明板，已经成为了该公司的一大特色。
塑料ELISPOT板的重新兴旺有两个方面的原因：一方面是技术进步，在塑料材质的改进之后，板底吸附蛋白的能力已经比传统的塑料板有了很大提高，虽然还赶不上膜板，但是应付ELISPOT实验已经绰绰有余。
更高质量的抗体也有利于塑料板获得更好的ELISPOT结果。
另一方面归因于塑料板自身的优势，相对低廉的价格，简化的操作步骤，简短的实验时间都是塑料板的优势（Ronnelid J et. al., 1997）。
此外对于透明板，还可以在实验中随时观察细胞的状态与密度，这对新手是很重要的。
（2) 检测内容的多样化在ELISPOT技术创立之初，主要用于检测B淋巴细胞分泌的抗体，包括各种类型的免疫球蛋白，包被的材料是特异性的抗原或者抗体的抗体（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）。
B细胞分泌的抗体一般的量比较大，容易检测，即使早期ELISPOT检测的灵敏度不够高，检测大量分泌的抗体还是不成问题的（Bjorkander J et. al., 1991; Ahlfors E et. al., 1991; Holmgren J et. al., 1992a）。
时至今日，ELISPOT检测还广泛地用来研究粘膜免疫中的抗体分泌情况（Holmgren J et. al., 2005）。
后来随着技术的进步，ELISPOT检测的灵敏度有了大幅度的提高，以至于可以检测到痕量的细胞因子，于是它的主要应用就转移到检测细胞因子上来了（Czerkinsky C et.al,. 1988a; 1991; Hutchings PR et. al., 1989）。
现在各种常见细胞因子的检测都有了商业化的试剂盒，使用起来非常方面。
能商业化检测的细胞因子包括人类、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干扰素（γ-IFN）、白介素（IL-2，4，5，6，10，12等）、颗粒酶（Granzyme B）、肿瘤坏死因子（TNF-α）。
目前全球ELISPOT试剂盒的主要供应商有：荷兰U-CyTech公司、瑞典Mebtech公司、法国Diaclone公司、美国BD Pharmingen公司和R&D公司。
他们的产品各有特点，其中荷兰U-CyTech公司的产品质优价廉，在国内市场居于主导地位。
（3) 多细胞因子的检测通常的ELISPOT检测每个孔只检测一种细胞因子。
如果要在一个ELISPOT孔内同时检测两种或者两种以上的细胞因子，可以包被两种抗体以捕获两种细胞因子，然后用两种不同的酶联抗体以及显色剂显出两种斑点来。
早在1988年，Cecil C. Czerkinsky就提出并且实现了这种想法（Czerkinsky C et.al,. 1988b）。
但是，双色ELISPOT有一个与生俱来的弱点，那就是斑点分离的问题。
大家知道，斑点的混合色属于物理学上“颜料的三原色”问题，两种不同颜色的颜料如果以不同的比例混合，会出现一系列不同的表观颜色。
其中的细微差异，人的肉眼有时候都难于判断，何况是自动的读板仪。
所以，在双色ELISPOT斑点识别上，总会有些混色的斑点无法正确的识别与分类。
为了解决这个难题，人们想到了用荧光元及检测ELISPOT 的方法（Ruedl C et. al., 1994; Sarawar SR et. al., 1994）。
不同颜色的荧光混合在一起，只要加一张滤光片，就可以精确的滤出目标荧光，而遮蔽掉其它颜色的荧光，荧光之间可以互不干扰。
这对于双因子，甚至多因子ELISPOT检测都是十分理想的手段（Gazagne A et. al., 2005）。
但是荧光ELISPOT检测目前还有不足之处。
由于荧光素直接偶联在抗体或者亲和素上，缺乏酶催化底物的那种放大作用，所以灵敏度还无法和化学显色的ELISPOT方法比较（Gazagne A et. al., 2005）。
此外，硝酸纤维素膜自身在激发下就会发荧光，所以不适合做荧光ELISPOT底板材料。
PVDF膜也有自身发荧光的问题，虽然不像硝酸纤维素膜那样严重，但是也会造成背景升高，信噪比下降的问题（Gazagne A et. al., 2005）。
荷兰U-Cytech公司已经发开出了新一代的荧光底板介质Hydrogel™，它既有很高的抗体吸附性质，又没有荧光背景。
Hydrogel™目前存在的唯一问题是保存起来不够稳定，限制了它的推广。
综上所述，多细胞因子检测是ELISPOT未来的一个发展方向，但在技术上还不够成熟，有待于改进。
二、ELISPOT的方法由于有商品化的试剂盒，ELISPOT操作本身已经大大简化。
目前的ELISPOT试剂盒按抗体的包被情况分为已包被板的和未包被板的两类。
前者实验操作简单，但是背景较高，且价格较贵，所以应用不如后者广泛。
按照ELISPOT底板材料分，可以分为PVDF膜板和非PVDF膜板。
PVDF板由于疏水性的问题，需要用乙醇预先润湿，在洗涤过程中也更复杂一些。
各个公司的试剂盒使用起来大同小异，我们以荷兰U-Cytech公司的PVDF板IFN-γ试剂盒威力，列出其操作方法。
1、实验的准备工作（1）设备与耗材：超净工作台；5% CO2 37°C 细胞培养箱；P20，P200，P1000 微量移液器；P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器；Biosys ELISPOT ReaderP20，P200，P1000 枪头；多道移液器吸槽；0.5mL，1.5mL EP管。
