黑曲霉液体发酵产植酸酶条件的研究

酶活（ Ｕ／ｍｌ）
４０
３５
３０
２５
２０
１５
１０
５
０
２２
２５
２８
３１
３４
温度（ ℃）
图 ３ 温度对黑曲霉产酶活力的影响
２．５ 起始 ｐＨ 值对黑曲霉产酶活力的影响（ 见图 １）
酶活（ Ｕ／ｍｌ）
４０
３０
２０
１０
０
３
４
５６７源自ｐＨ 值图 １ ｐＨ 值对黑曲霉产酶活力的影响
在 ２５０ ｍｌ 三角瓶中装入 １００ ｍｌ 不同起始 ｐＨ 值 的发酵培养基， 接种黑曲霉培养 ３ ｄ 后， 测其酶活力。 结果表明， 培养基起始 ｐＨ 值对产酶影响很大， ｐＨ 太 低或太高都会对酶活产生不利影响， 而在 ｐＨ 值 ５．０ 时该菌株发酵产生植酸酶的活力最高。
２８
黑曲霉 ３０１３２ 液体发酵产植酸酶的最适条件是： 碳 源 为 ８％的 麸 皮 ， 氮 源 为 ０．５％硫 酸 铵 ， 接 种量为 １０％， ｐＨ 值为 ５．０， 发酵温度为 ２８ ℃。在这种培养基条 件下， 黑曲霉 ３０１３２ 产植酸酶活力可达到 ３５．５ Ｕ／ｍｌ。
（ 参考文献 ５ 篇， 刊略， 需者可函索） （ 编辑： 刘敏跃， ｌｍ － ｙ＠ ｔｏｍ ．ｃｏｍ ）
将装有 １００ ｍｌ 发酵培养基的三角瓶分别置于２２、 ２５、２８、３１ 和 ３４ ℃ ５ 个温度条件下培养 ３ ｄ 后， 发现 在 ２８～３１ ℃时， 产酶较高。高于此温度， 产酶活力随温 度升高呈现下降趋势； 低于此温度， 产酶活力随温度 降低也呈减少趋势。在 ２８ ℃时， 酶活力高达 ３５．５ Ｕ／ｍｌ。 ３ 结论
关键词 植酸酶； 黑曲霉； 液体发酵 中图分类号 Ｓ８１６．６
植酸酶主要存在于植物和微生物中， 特别是霉菌 中的曲霉属一直被认为是植酸酶主要产生菌而被大 量研究。饲料中添加植酸酶， 可减少粪便排泄物中磷 含量， 从而减少高磷所造成的环境污染； 尤其是在水 体中的含量， 有利于保护生态环境。本文对黑曲霉发 酵产植酸酶的条件进行了初步研究， 以期找到高产植 酸酶的最适发酵条件， 为工业大规模生产植酸酶提供 帮助。 １ 材料与方法 １．１ 材料
供 试 菌 种 ： 黑 曲 霉 （ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） ３０１３２ 由 长 江大学生命科学学院微生物学实验室提供。 １．２ 方法 １．２．１ 培养基
斜面培养基：ＰＤＡ（ 马铃薯－ 葡萄糖－ 琼脂） 培养基。 液体种子培养基（ 质量百分数） ： 麸皮 ２％、葡萄糖 ３％、硫酸铵 ０．１５％， ｐＨ 值 ５．５～６．０。 发酵培养 基 （ 质量 百 分数 ） ： 在 ３％葡 萄 糖、０．１５％ 硫 酸 铵 、０．２％ ＣａＣｌ２、０．０５％ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、０．０５％ ＫＣｌ、 ０．０３％ＭｎＳＯ４ 的基础上稍做改变。 １．２．２ 培养方法 １．２．２．１ 斜面培养 斜面接种后， ２８ ℃培养 ２ ｄ， 待长出均匀、较厚的 一层绿色孢子后， 贮存于冰箱中备用。 １．２．２．２ 种子摇瓶培养 取新鲜的斜面种子一管， 用无菌生理盐水将孢子 洗下， 振荡使孢子分散， 适当稀释， 用血球计数板测 定， 保持孢子含量在 １０７～１０８ 个／ｍｌ。按 １０％的 接种 量 将孢子 悬 液 接 入 装 有 １００ ｍｌ 液 体 种 子 培 养 基 的 三
酶活力测定方法： ①取 １ ｍｌ 含酶液加至一洁净 试管中； ②加入 ３ ｍｌ 反应液， 反应液为含质量浓度为 ０．５％植酸钠的乙酸－ 乙酸钠缓冲液（ｐＨ 值为 ５．５）； ③在 ３７ ℃恒温反应 ３０ ｍｉｎ； ④加入 １ ｍｌ 浓 度为 １０％的三 氯 醋酸 终 止反 应 ； ⑤加 入 ５ ｍｏｌ／ｌ 的硫 酸 １ ｍｌ， 摇 匀 ； ⑥加 入 ２％的钼 酸铵 ２ ｍｌ； ⑦加入 ２％的 硫 酸 亚 铁 ２ ｍｌ， 混匀， 放入沸水浴中 ５ ｍｉｎ， 冷 却后 将 以上 蓝 色溶 液在 ７２１ 型分光光度计上于 ７８０ ｎｍ 处比色， 读出吸 光 度 Ａ７８０ ｎｍ， 查 标 准 曲 线 计 算 酶 活 力 （标 准 曲 线 为 ＫＨ２ＰＯ４ 中磷含量与 Ａ７８０ ｎｍ 的关系曲线）。 ２ 结果与分析 ２．１ 不同碳源对黑曲霉产酶活力的影响
２７
试验研究
杨亚珍等： 黑曲霉液体发酵产植酸酶条件的研究
表 ２ 不同碳源添加量对黑曲霉产酶活力的影响
２．６ 接种量对黑曲霉产酶活力的影响（ 见图 ２）
麸皮含量（ ％）
６
７
８
９
１０
酶活（ Ｕ／ｍｌ）
１４．５ ２６．０ ２９．３ ２７．２
２４．５
试验以麸皮作为唯一碳源， 按不同接种量加入发 酵培养基中。试验发现， 当碳源含量从 ６％增长至 ８％ 时， 植酸酶的活力逐步增强， 且在 ８％时达最大。此后， 随碳源含量增加， 植酸酶活力呈现下降趋势。原因可 能由于培养基中碳源过高或过低， 而使碳氮比例失 调， 导致菌体代谢产物酶活力下降。 ２．３ 不同氮源对黑曲霉产酶活力的影响（ 见表 ３）
杨亚珍， 长江大学生命科学学院， ４３４０２５， 湖北荆州。 张建民、余欢， 单位及通讯地址同第一作者。 收稿日期： ２００６－ １０－ １６
角 瓶 （ ２５０ ｍｌ） 中 ， 然 后 将 三 角 瓶 置 ３０ ℃恒 温 摇 床 上， 以 １５０ ｒ／ｍｉｎ 振荡培养 ４８ ｈ。 １．２．２．３ 发酵培养
表 ４ 氮源含量对黑曲霉产酶活力的影响
氮源含量（ ％）
０．３
０．４
０．５
０．６
０．７
酶活（ Ｕ／ｍｌ）
２０．４
２１．７
３１．５
２２．９
２１．１
试验以不同浓度的硫酸铵作为唯一氮源， 测定不 同氮源含量对植酸酶活力的影响， 由表 ４ 可知， 当氮 源含量为 ０．５％时， 产生的植酸酶活力维持在一个最 高的水平。氮源含量过高或过低， 均不利于代谢产物 的累积， 植酸酶活力下降。
在 ２５０ ｍｌ 三 角 瓶 中 装 入１００ ｍｌ 发 酵 培 养 基 ， 然 后以发酵液的不同体积比接种摇瓶种子培养液， 测定 接种量对酶活力的影响。由图 ２ 可知， 当接种量为 １０％时， 产酶活力最高， 菌体浓度过高或过低， 均不利 于植酸酶的产生。 ２．７ 温度对黑曲霉产酶活力的影响（ 见图 ３）
《饲料工业》·２００７ 年第 ２８ 卷第 ５ 期
试验研究
黑曲霉液体发酵产植酸酶条件的研究
杨亚珍 张建民 余 欢
摘 要 试验以黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）３０１３２ 为材料， 研究了碳源、氮源、培养基、起始 ｐＨ 值、接 种量、温度对该菌株产植酸酶活力的影响。结果表明： 黑曲霉 ３０１３２ 的最适发酵温度为 ２８ ℃， 产酶 ｐＨ 值为 ５， 最佳接种量为 １０％； 在此条件下， 以 ８％麸皮为碳源、０．５％硫酸铵为氮源时， 产酶活力最高， 发 酵 ３ ｄ 后发酵液中植酸酶活力高达 ３５．５ Ｕ／ｍｌ。
本试验对所选 ４ 种碳源分别以 ８％的添加量加入 到发酵培养基中， 测定不同碳源对植酸酶活力的影 响， 结果见表 １。
表 １ 不同碳源对黑曲霉产酶活力的影响
碳源（ ８％） 酶活（ Ｕ／ｍｌ）
葡萄糖 ２３．４
蔗糖 ２４．４
麸皮 ２９．７
乳糖 １８．６
从表 １ 可以看出， 以麸皮做为碳源时， 产生植酸 酶的活力最高， 达 ２９．７ Ｕ／ｍｌ； 其次为蔗糖、葡萄糖； 用 乳糖作为碳源时， 产植酸酶的活力最低， 为 １８．６ Ｕ／ｍｌ。 说明麸皮是产植酸酶的良好碳源。 ２．２ 不同碳源添加量 对 黑曲 霉产 酶 活力 的 影响 （ 见 表 ２）
表 ３ 不同氮源对黑曲霉产酶活力的影响
酶活（ Ｕ／ｍｌ）
３５
３０
２５
２０
１５
１０
５
０
１
５
１０
１５
２０
接种量（ ％）
图 ２ 接种量对黑曲霉产酶活力的影响
氮源（ ０．５％） 酶活（ Ｕ／ｍｌ）
酵母膏 ２７．６
硫酸铵 ３１．７
硝酸铵 ２５．９
尿素 ２３．４
试验 以酵 母 膏、硫 酸 铵 、硝 酸 铵 、尿 素 为 氮 源 ， 分 别以 ０．５％的添加量加入发酵培养基中， 从表 ３ 中可 知， 在含氮量相同的条件下， 硫酸铵作为唯一氮源时， 植酸酶的活力最高。而用其它氮源来发酵， 产植酸酶 活力相对较低。 ２．４ 氮源含量对黑曲霉产酶活力的影响（ 见表 ４）
按 ５％的接种量将摇瓶种子接入装有 １００ ｍｌ 发酵 培养基的三角瓶（２５０ ｍｌ）中， 然后将三角瓶置 ２８ ℃恒 温摇床上， 以 １５０ ｒ／ｍｉｎ 振荡培养７２ ｈ， 测植酸酶活力。 １．２．２．４ 酶活力测定
植酸酶活力的定义： ３７ ℃、ｐＨ 值 ５．５ 条件下每分 钟从植酸钠中释放出 １ μｇ 无机磷所需的酶为 １Ｕ。