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黑曲霉发酵液中5-HMF含量的测定

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黑曲霉发酵液中5-HMF含量的测定陈家祥;徐策;张素;熊德欣;代园凤;郑泽轩;陈雪;李祝【摘要】本实验建立了测定黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法.对5-HMF标准溶液进行全波长扫描,确定最大吸收波长为测定波长,并绘制5-HMF浓度与吸光度之间的标准曲线;用50％乙醇将原发酵液稀释50倍,在测定波长处测定吸光度,对应标准曲线,计算发酵液中的5-HMF含量.结果表明,5-HMF最大吸收波长为283 nm,R2为0.9995,线性关系良好,发酵液5-HMF平均浓度为171.743μg/mL,平均回收率105.86％,精密度RSD为0.13％,重复性RSD为0.40％,仪器检出限为0.007μg/mL.该方法简便,快速,成本低,准确度较高,为今后研究黑曲霉中5-HMF含量提供了一个可借鉴的方法.【期刊名称】《山地农业生物学报》【年(卷),期】2018(037)006【总页数】5页(P87-91)【关键词】黑曲霉;5-HMF;紫外分光光度法【作者】陈家祥;徐策;张素;熊德欣;代园凤;郑泽轩;陈雪;李祝【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025;贵州省烟草公司毕节市公司,贵州毕节 551700;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025;贵州省烟草公司毕节市公司,贵州毕节 551700;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025【正文语种】中文【中图分类】Q939.965-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)，又名5-羟甲基-2-糠醛[1]，由葡萄糖或果糖脱水生成[2]，其分子中含有一个呋喃环，醛基和羟基，性质非常活泼，可通过氧化、氢化和缩合等反应制备多种衍生物，是一种良好的化学平台物质。

5-羟甲基糠醛可用于生产燃料和反应中间体[3]，同时还有抗癌细胞增值活性，降血糖等药理作用[4-5]，近年我国5-羟甲基糠醛产品行业销售收入呈指数增长[6]，应用前景广泛。

黑曲霉为曲霉属的一个常见种[7]，可生产柠檬酸[8]，糖化酶[9]等，也可作为宿主进行外源表达，广泛用于食品原料、药物、酶的生产[10-11]，是发酵工业中的重要菌种。

于能江[12]从头孢酶属的发酵物中分离出5-HMF，陈楠等人[13]从蜜环菌中提取5-HMF，均表明微生物发酵液中可产5-HMF。

黑曲霉在工业生产中应用广泛，利用黑曲霉发酵生产5-HMF可弥补化学法步骤复杂繁琐的缺点。

在对黑曲霉中5-HMF高产培养体系的建立中对发酵液内的5-HMF含量测定是必不可少的步骤。

目前测定5-HMF的方法主要有HPLC法[14-16]、紫外分光光度法[17-19]、衍生化分光光度法[20]等。

HPLC法样本处理及测定过程繁琐复杂且成本较高，不适用于长期而频繁的测定；衍生化分光光度法需将5-HMF生成衍生化合物后间接测量，步骤较繁琐，紫外分光光度法简单快捷，在5-HMF的测定中应用较多。

如冯红伟等人[21]利用紫外分光光度法测定糖蜜中的5-HMF，刘月新[22]利用紫外分光光度法测定四物汤传统汤剂中的5-HMF。

本实验将利用紫外分光光度法对黑曲霉发酵液中5-HMF含量进行测定。

1 材料与方法1.1 材料与仪器1.1.1 菌种黑曲霉(Aspergillus niger)xj：中国典型培养物保藏中心保存，CCTCC No：M206021。

1.1.2 试剂 5-HMF(≥99.0%)：广东翁江化学试剂有限公司;无水乙醇(分析纯)：天津市富宇精细化工有限公司；葡萄糖(分析纯)：天津市优谱化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备 BIOMATE 3S紫外分光光度计：赛默飞世尔科技有限公司；UV-8000紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；华普达THZ-82恒温振荡器：常州华普达有限公司。

1.2 实验方法1.2.1 5-HMF标准品全波长扫描与标准曲线绘制精确吸取2.5 μL 5-HMF标准品，利用50%乙醇配制成31.075 μg/mL的储备液。

精确吸取10 mL母液，加入40 mL 50%乙醇，配制浓度为6.215 μg/mL的标准液。

将标准液于UV-8000紫外可见分光光度计进行全波长扫描，取最大吸收峰值对应波长作为测定波长。

将标准液用50%乙醇梯度稀释，得0、1.243 μg/mL、2.486 μg/mL、3.729μg/mL、4.972 μg/mL、6.215 μg/mL的6份稀释液。

6份样品以50%乙醇为参比，在测定波长进行吸光度测定，并绘制标准曲线。

1.2.2 黑曲霉发酵液中5-HMF浓度的测定将黑曲霉接种至PDB培养基，于26℃，150 r/min振荡频率下培养5 d，过滤掉发酵液中的菌丝球及孢子，于发酵液中加入等体积的无水乙醇，10000 r/min离心10 min沉淀絮状变性蛋白，吸取上清液，继续加入50%乙醇，得到原发酵液50倍稀释度的稀释液。

分别取稀释液2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL加入5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL的50%乙醇，得到5个梯度稀释样品，以50%乙醇为参比，于283nm下测定吸光度，根据标准曲线计算发酵液中的5-HMF平均浓度。

1.2.3 精密度测定取同一份稀释液8份，以同样方法直接测定吸光度，计算相对标准偏差。

1.2.4 回收率测定配置与发酵液5-HMF浓度相近的5-HMF标准溶液，与发酵液在相同稀释度下等体积混合后测定，计算回收率。

1.2.5 重复性实验对同一批发酵液以相同方法平行处理，分析重复性。

1.2.6 仪器检出限测定配制浓度为0.213 μg/mL、0.426 μg/mL、0.533 μg/mL、0.639 μg/mL的5-HMF标准溶液，利用BIOMATE 3S紫外分光光度计测定吸光度，绘制低浓度下的标准曲线，并测定20组参比的吸光度，计算仪器检出限。

2 结果与分析2.1 全波长扫描标准液于190～1100 nm进行全波长扫描，发现283 nm处有最大吸收峰(200～400 nm部分扫描结果见图1)，故采用283 nm作测定波长。

2.2 5-HMF标准品浓度与吸光度回归曲线5-HMF标准品溶解于50%乙醇中，其通过计算得到的浓度与所对应的吸光度结果见表1，线性回归曲线见图2，R2为0.9995，线性关系良好，回归方程为y =0.1225x + 0.005。

图1 5-HMF标准液紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectrum of 5-HMF standard solution表1 5-HMF标准品浓度与吸光度关系表Tab.1 Relation of concentration of 5-HMF standard and absorbance序号5-HMF标准液(mL)50%乙醇(mL)浓度(μg/mL)Abs1010002281.2430.1663462.4860.3104643.7290.4605824.9720.6 0661006.2150.772图2 5-HMF标准品标准曲线Fig.2 Standard curve of 5-HMF standard2.3 发酵液5-HMF浓度测定对稀释液梯度稀释后的6份样品测定，利用标准曲线求出浓度(见表2)，再分别根据总稀释度求出原发酵液5-HMF浓度，为165.714 μg/mL、173.333 μg/mL、172.143 μg/mL、173.714 μg/mL、173.810 μg/mL，平均值为171.743μg/mL。

2.4 精密度测定取稀释液8份，直接进行紫外分光测定(见表3)，RSD为0.13%，重现性良好。

表2 发酵液5-HMF浓度测定Tab.2 Determination of 5-HMF concentration in fermentation broth稀释液(mL)50%乙醇(mL)Absc(μg/mL)250.1210.947340.1871.486430.2461.967520.3092.482610. 3702.980表3 精密度测定Tab.3 Determination of precision序号Abs浓度(μg/mL)5-HMF含量(μg/mL)RSD10.4293.461173.06120.4293.461173.06130.4293.461173.06140. 4293.461173.06150.4293.461173.06160.4303.471173.55770.4303.471173.5 5780.4293.461173.0610.13%2.5 回收率测定配制186.450 μg/mL的5-HMF标准溶液，与原发酵液各稀释50倍后等体积混合并测定(结果见表4)，平均回收率为105.86%，RSD为1.03%，回收率较好，可以较准确反映发酵液中5-HMF实际含量。

表4 回收率测定Tab.4 Determination of recovery rate原样(μg/mL)标样(μg/mL)加标后(μg/mL)回收率平均回收率3.4353.7293.682105.35%3.4353.7293.682105.35%3.4353.7293.731107.97% 3.4353.7293.690105.79%3.4353.7293.690105.79%3.4353.7293.673104.91%105.86%2.6 重复性实验取同一批发酵液8份，以同样方法测定其中5-HMF含量(见表5)，RSD为0.40%，重复性良好。

表5 重复性实验Tab.5 Repeatability experiment5-HMF含量(μg/mL)RSD171.837173.061172.653173.061172.653173.061172.653174.286 0.40%图3 低浓度时灵敏度Fig.3 Sensitivity at the low concentration2.7 仪器检出限配制0.746 μg/mL的低浓度5-HMF标准溶液，进行梯度稀释，绘制标准曲线，计算其斜率，低浓度时灵敏度0.1397(见图3)。

以20组50%乙醇进行空白测定，得空白均值为0.009，空白值标准偏差为0.03%，根据IUPAC标准[23]，k取3用于检出限计算，得最小分析信号为0.010，BIOMATE 3S紫外分光光度计测定黑曲霉发酵液中5-HMF浓度检出限为0.007 μg/mL。

3 结论与讨论本实验建立了测定黑曲霉发酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法。

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正交实验法优选熟地黄中5HMF的提取工艺

正交实验法优选熟地黄中5HMF的提取工艺

正交实验法优选熟地黄中5 HMF的提取工艺【摘要】目的：以5羟甲基糠醛(5HMF)含量和熟地黄干膏收得率为指标，探讨熟地黄中5HMF的提取工艺. 方式：采纳正交实验法考察加水量、提取时刻、提取次数及醇沉浓度4个因素对5HMF含量和干膏收得率的阻碍，并运用高效液相法测定5HMF 的含量. 结果：通过对正交实验结果的极差分析，得出提取次数和提取时刻两个因素对干膏收得率和含量阻碍最大，参考两种要紧阻碍因素，最终确信8倍量水、提取3次、每次 h, 700 mL/L乙醇沉淀的提取工艺，并对该工艺进行三次重复性小试实验. 5HMF收得率可达58%以上. 结论：通过对上述提取条件的重复性考察，该方式重复性好，5HMF收得率稳固，为进一步中试实验提供了参考依据.【关键词】熟地黄；5羟基糠醛；中药制药工艺【Abstract】AIM: To optimize the water extracting technology condition of 5HMF from Rehmannia glutinosa libosch. METHODS: The extraction procedure of Rehmannia glutinosa libosch was studied by orthogonal design with dry extract yield and 5hydroxymethyl2furfura(5HMF)as the detective indices. Effects of four factors (the amout of water, extracting time, the mumber of times and alcohol concentration)and 3 levels for each factor on extraction rate were analyzed. RESULTS: The5HMF extraction rate reached over 58% under the optimum extraction condition which was the adding 8 folds of water, and decocting for 3 times, h once and the precipitation with 700 mL/L alcohol. CONCLUSION: The optimum water decocting condition is repeatable, and ensure stable 5HMF extraction rate. It could be used in the future middle scaled preparation of Rehmannia glutinosa libosch.【Keywords】radix rehmanniae praeparata; 5 hydroxymethyl2furfura(5HMF); pharmaceutical technology0引言熟地黄为玄参科连年生草本植物地黄（Rehmannia gLutinosa Libosch ）的根，经加工炮制而成，在临床上应用较为普遍. 熟地黄含有梓醇、糖类、甙类和5羟甲基糠醛(5 hydroxymethyl 2furfura, 5HMF)等多种化学成份. 有研究报导生地黄炮制成熟地黄后5HMF的含量增加20倍左右［1］，在对5HMF药理作用的研究中发觉其具有抗氧化、改善血液流变学等多种对人体有利的作用［2-3］. 但是关于对熟地黄中5HMF的提取工艺却少见文献报导，为了更好的发挥熟地黄的药用价值，咱们运用正交设计法，考察阻碍其提取的因素，挑选5HMF的最正确提取工艺条件.1材料和方式材料美国产Beckman 125型高效液相色谱仪（32Karat TM Software色谱工作站），色谱柱为DiamonsiL C18(5 μL 200× mm ). BT 125D型电子天平（北京Sartorius公司）；DL720型超声波清洗器（上海科导超声仪器）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，5 HMF对照品(批号：111626200503,中国药品生物制品检定所)，水（重蒸水），熟地黄药材(陕西省药材总公司).方式提取工艺设计药材吸水率考察周密称取熟地黄3份，每份20 g. 别离加10倍量水浸泡，每30 min观看1次药材的渗透情形，直至药材掰开无硬心为止，并记录浸泡时刻，用量筒测量剩余水量，计算吸水率（表1）.正交实验设计选用L9（34）正交进行实验，以熟地黄浸膏得率，5HMF含量作为考察指标，因素水平安排见表2. 称取熟地黄粗粉9份，每份20 g，按正交实验设计方案条件提取过滤，归并滤液，定容到50 mL，备用. 表1熟地黄吸水率的考察表表2因素水平表的含量测定溶液制备周密称取5HMF对照品适量，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀制成含 mg/L的溶液，作为对照品溶液. 周密称取药材提取液 mL，蒸干溶剂，残渣用甲醇定容于5 mL容量瓶中，用μm微孔滤膜滤过，作为供试液.色谱条件的选择色谱柱： DiamonsiL C18(5 μL 200× mm )；流动相为乙腈∶水 (15∶85)，流速1 mL /min，柱温25℃. 测定波长280 nm. 进样量20 μL. 在上述条件下，样品HPLC色谱图中5羟基糠醛与其他峰分离良好.线性关系的考察周密量取对照品溶液适量，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，别离吸取对照溶液4, 8, 12, 16和20 μL注入液相色谱仪中，测定其峰面积，以峰面积为纵坐标(A)，对照品的浓度为横坐标(C)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=132034X+284737, R=，5 HMF在～ mg/L范围内呈良好的线性关系.周密度实验周密吸取10 μL对照品溶液，按上述色谱条件，持续进样6次，测得5HMF平均峰面积，计算相对标准差RSD=%.稳固性实验在相同条件下，周密吸取供试品溶液，在12 h内，每隔2 h测定1次峰面积，计算RSD为% ，说明本品在12 h内稳固. 加样回收率实验抽取4号样品加入5HMF对照品适量，混匀，按供试品溶液制备，并按上述色谱条件测试. 按供试品溶液制备方式提取测定，测得峰面积并计算含量，平均回收率％，RSD=%.重复性小试实验验为进一步考察上述提取工艺的稳固性，按的实验条件进行3次重复性小试实验.2结果通过正交实验极差分析结果显示各因素对出膏率的阻碍依次为提取次数>提取时刻>醇沉浓度>加水量（表3）. 对含量的阻碍依次为提取时刻>提取次数>醇沉浓度>加水量，通过极差分析说明，提取次数、提取时刻对5HMF的含量和熟地黄浸膏得率的阻碍比较著性，溶媒用量、提取时刻阻碍较小. 综合分析两种指标，初步确信熟地黄提取的最正确工艺应用8倍量的水，每次提取 h,提取2次，然后用950 mL/L 乙醇沉淀至700 mL/L. 按上述优化条件进行重复3次实验（表4），5羟基糠醛收得率可达58%以上. 表3正交实验极差分析表表4熟地黄优选提取工艺的重复性小试实验3讨论熟地黄药材为炮制品，水提后存在出膏过量等问题，该工艺中引入醇沉净化方式进行处置，在保证含量的前提下，操纵出膏率，可为制剂提供方便. 咱们用正交设计法对5HMF的提取工艺进行优选，通过直观、极差分析法选出最正确工艺，为验证此优选方案的可行性，咱们又按最正确工艺进行了3次重复性小实验，结果稳固，5 HMF收得率可达58%以上，初步完成了对熟地黄药材的实验室及小试实验提取工艺的挑选.关于熟地黄中5HMF含量的测定有薄层扫描、高效液相等多种方式［4-5］. 结合实验室现有条件，咱们选取高效液相法进行测定. 张清波等［6］和秦向阳等［7］曾报导HPLC测定熟地黄中 5 HMF的含量，但咱们在其给定的流动相和检测波长下，以DiamonsiL C18分析柱为色谱柱进行实验，发觉 5HMF的色谱峰显现拖尾和分叉现象，且流动相极性太大，出峰时刻较短，溶剂峰干扰严峻. 为此，咱们对实验条件进行改良．采纳DiamonsiL C18 ( 5 μL 200× )色谱住；以乙腈∶水 (15∶85)为流动相，流速1 mL/min，柱温25℃. 测定波长280 nm，取得了较好的分离成效. 采纳高效液相色谱法测定5 HMF的含量，可不经分离，直接测定，其方式简便、准确、灵敏，重现性及回收率均符合要求. 在本实验给定的条件下，基线平稳，可有效排除溶剂峰的干扰，且峰型较好.【参考文献】［1］刘漂亮，白玫，白荣枝，等. 熟地黄中5羟甲基糠醛的提取分离及含量测定［J］.中草药，1995,26(1):13-14.［2］耿放，王喜军. 5羟基糠醛(5HMF)在中药复方中的研究现状及相关药效探讨［J］. 世界科学技术中医药现代化,2005, 7(6):52-54.［3］冯建明，赵仁. 三种地黄炮制品现代研究进展［J］. 云南中医学院学报，2000,23(12):40-42.［4］楚文，张昌斌，曹永红，等. 限制5羟甲基糠醛生成条件和探讨［J］. 人民军医药学专刊，1998,14(2):101-103.［5］饶品昌，黄道明．薄层扫描法测定熟地黄中5羟甲基糠醛的含量［J］. 中成药，1998,20(8):20-21.［6］张清波，乔菲，陈晓雪，等. HPLC法测定熟地黄中5羟甲基糠醛的含量［J］. 中国药品标准，2001,2(4):33-34.［7］秦向阳，周军，李晓曄，等. RP HPLC法测定熟地黄中5羟甲基糠醛的含量［J］. 第四军医大学学报,2006,27（6）:510-511.。

分光光度法测定纤维素水解液中5-羟甲基糠醛和糠醛

分光光度法测定纤维素水解液中5-羟甲基糠醛和糠醛


ｎｉｔｒｏｇｅｎ－
ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］。ｊ Ａ麟ｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，１９９２，
４０：１０２２－１０２５．
ＥＪ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ
Ｅ５］Ｈｕｓｅｙｉｎ Ｂｏｚｋｕｒｔ，Ｆａｈｒｅｔｔｉｎ Ｇｏｇｕｓ，Ｓａｎｆｉ Ｅｒｅｎ．Ｎｏｎ－
ｅｎｚｙｍｉｃ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｏｉｌｅｄ ｊｕｉｃｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏ＆ ｅｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｏｒａｇｅ［Ｊ］．Ｆｏｉｘｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９（６４）－８９－
・２２３・
作者简介：常春（１９７３一），男，河南郑州人，博士研究生，研究 方向为生物质资源利用。
万方数据
等‘４刮，极少有对纤维素水解液中５一ＨＭＦ和ＦＵＲ 进行分光光度测量的报道。此外，５一ＨＭＦ和ＦＵＲ 的同时存在会造成直接比色测量的误差。本工作以 秸秆水解液为研究对象，通过化学衍生，利用一阶导 数分光光度法同时测定５一ＨＭＦ和ＦＵＲ的含量。
９６．Ｏ％ａｎｄ １０５．０％ｆｏｒ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｆｕｒｆｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｒｆｕｒａｌ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：１ｓｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ；争Ｈｙｄｒｏｘｙｆｕｒｆｕｒａｌ；Ｆｕｄｕｒａｌ；Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｕｃ ａｃｉｄ；Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ； Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ｏｆ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．４—３．２ ｍｇ・Ｌ－１．
ａｎｄ
ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ，ｇｉｖｉｎｇ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ＲＳＤ’Ｓ（，ｌ＝７）２．２３％ａｎｄ ２．０６％，ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
黑曲霉鉴定操作规程

黑曲霉鉴定操作规程

黑曲霉鉴定操作规程黑曲霉（Aspergillus niger）是一种广泛存在于自然环境中的真菌，常见于土壤、植物和食物中。

它具有强大的分解能力，可以分解有机物质并产生许多有用的代谢产物。

然而，黑曲霉也是一种致病菌，特别是在患有免疫系统抑制的人群中。

因此，快速准确地进行黑曲霉的鉴定非常重要。

下面是黑曲霉鉴定的操作规程。

1. 样品准备- 从疑似受污染的土壤、食物或其他材料中采集样品，将样品放入密封的容器中。

注意避免任何可能的交叉污染。

- 将样品送至实验室进行进一步处理。

2. 样品处理- 将样品进行适当的粉碎或稀释。

对于固体样品，可以使用食品搅拌器或研钵进行粉碎。

对于液体样品，可以直接使用适当的稀释液进行稀释。

- 将样品制备成适当的稀释液，以便于后续的实验操作。

3. 培养基选择- 选择适当的培养基来培养黑曲霉。

黑曲霉常见于一般的富含碳水化合物和氮源的培养基，如马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）或麦芽提取物琼脂（MEA）。

也可以使用含有指示剂的培养基，如酚红琼脂葡萄糖培养基，以便于观察黑曲霉的生长情况。

4. 接种- 使用无菌技术将样品接种至培养基上。

可以使用无菌的棉签或针头，将样品均匀地涂抹在培养基表面上。

- 根据需要，可以在培养基上划出不同的区域，以便于对不同样品进行观察和比较。

5. 培养条件- 将培养皿或培养瓶密封并放置在适当的温度下培养。

黑曲霉通常在25-30摄氏度下生长最佳，但可以进行不同温度的培养来筛选黑曲霉菌株。

- 在培养过程中，注意观察并记录菌落形态、颜色和生长速度等特征。

6. 鉴定- 观察在培养基上生长的菌落形态，黑曲霉的菌落通常呈黑色，有时也可以呈灰色、绿色或棕色。

- 进一步进行显微镜观察，观察菌丝及分生孢子的形态和结构特征。

黑曲霉的菌丝通常呈无色，分生孢子呈黑色，形状多样，有时具有规律的排列方式。

7. 鉴定结果确认- 根据观察到的菌落特征和显微镜观察结果，结合已知的黑曲霉的形态特征进行鉴定。

黑曲霉酸性蛋白酶液态发酵实验

黑曲霉酸性蛋白酶液态发酵实验

2014级生物工程专业实验(II)黑曲霉液态发酵生产酸性蛋白酶一、实验目的掌握液态耗氧发酵的一般工艺，熟悉机械搅拌发酵罐及相关设备的原理和使用。

二、实验材料2.1菌株黑曲霉Aspergillus niger SZ-357，由发酵与酶工程研究室分离。

2.2 实验试剂糊精、酵母膏、氯化铵、磷酸二氢钾、CaCl2、酪蛋白、酪氨酸、20%三氯乙酸，3,5-二硝基水杨酸(DNS)。

2.3实验设备DHP-9082电热恒温培养箱；2112型恒温摇床；GL-20G-II高速冷冻离心机；BIOTECH-5BG发酵罐，静音无油空气压缩机、BILON-T-501低温冷却液循环系统；722S型分光光度仪；SW-CJ-2FD型净化工作台；HZS-H 超级恒温水浴锅；Sartorius分析天平。

三、角蛋白酶液态发酵实验3.1工艺流程3.2培养基及培养条件3.2.1种子培养基及培养条件（1）液体种子培养基及培养条件：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0，121o C灭菌15 min。

将斜面菌种接种于含有100 mL 种子培养液的500 mL三角摇瓶中，在34o C，180r/min的恒温摇床中振荡培养24 h。

(2)麸皮固体种子培养基及培养条件：将斜面菌种接种于含水90%的麸皮固体培养基中，34o C，静置培养72 h，取出麸皮种子40 o C烘干备用。

3.2.2发酵培养基及培养方法发酵培养基：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO40.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0。

培养基121o C灭菌20 min，将种子液按5%（麸皮种子按3‰）的接种量接种于发酵罐中，在34o C，500 r/min的条件下发酵72 h。

3.3 检测方法3.3.1菌体浓度的测定干重法。

3.3.2还原糖的测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定发酵液中还原糖含量。

(1) 标准曲线的绘制：配制1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，取9支洁净的25 mL比色管编号，按表1加入试剂。