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解析玉米液化清液发酵生产柠檬酸工艺摘要：本文通过试验探究的方式，以玉米清液为原料，以黑曲霉作为发酵菌株。
通过单因素筛选的方式优化清液培养基，并根据产酸量、菌丝球形态等，对各项指标进行明确，实现柠檬酸产量最大化目标。
根据试验结果可知，将初糖浓度设定为18%、采用分段通风转速控制方式，在发酵超过48h后可使柠檬酸产量达到最大值，即18.33g/100mL，糖酸转化率达到101.8%。
与传统带渣发酵相比，产酸量与转化率得到显著提升。
关键词：玉米清液；柠檬酸；发酵生产引言：粗玉米中蕴含着丰富的蛋白质，直接用其生产柠檬酸会使菌体飞速生长，对产酸造成严重阻碍。
为避免这一情况，可将玉米粉液化后清楚残渣，液内蛋白质含量较低，利用清液发酵柠檬酸，不但可缩短发酵周期，还可提高转化率。
当前，国内许多工厂已经陆续普及此种工艺，为提高玉米资源利用率，应对发酵生产工艺进行细致分析。
1试验材料与方法1.1材料与仪器本试验的菌株为黑曲霉；主要试剂为酵母粉、无水葡萄糖、FeSO4、玉米浆、a-淀粉酶，剂量为40000U/mL，肌醇；培养基为马铃薯葡萄糖琼脂、种子基础与发酵基础培养基；主要仪器设备为光学显微镜，型号为OLYMPU719068；电子天平，型号为FA2004N；总糖计，型号为WYT-J；恒温振荡器，型号为HZQ-QX；发酵罐，剂量为30L。
1.2试验方法1.2.1初糖含量与柠檬酸产量关系将清液中初糖浓度分别设定为16%、18%和20%，按10%接种量，在36.5℃、转速为400r/min、罐压为0.1MPa、通风为400L/h环境下发酵。
在初始发酵时，每间隔8h分别从不同浓度罐体内取样，对液体PH值与柠檬酸产量进行测定，在放罐完毕后称取菌丝体净重，检测净重变化情况，并检测残还原糖值[1]。
1.2.2还原糖测定通过费林试剂热滴定方式，以亚甲基蓝作为指示剂进行测定。
在空白滴定方面，分别吸取甲乙液体各5ml，放入250ml的锥形瓶内，滴入19ml左右的葡萄糖标准液，加热至沸腾，沸腾时间为30s，每2s滴入1滴，直至溶液蓝色消失，测定葡萄糖溶液的总体积，反复操作3次，记录平均值。
一、实验目的1. 掌握玉米淀粉发酵的基本原理和操作方法；2. 了解发酵过程中微生物的生长规律和代谢产物；3. 培养实验操作技能，提高对发酵工艺的认识。
二、实验原理玉米淀粉是一种重要的碳水化合物，在微生物的作用下，可以转化为酒精、乳酸等代谢产物。
本实验采用黑曲霉作为发酵菌种，利用其发酵玉米淀粉产生柠檬酸。
三、实验材料1. 实验仪器：锥形瓶、酒精灯、烧杯、量筒、玻璃棒、温度计、pH计、过滤装置等；2. 实验试剂：玉米淀粉、黑曲霉、蒸馏水、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠等；3. 实验培养基：玉米淀粉培养基、葡萄糖培养基、氯化钠培养基等。
四、实验步骤1. 准备玉米淀粉培养基：称取100g玉米淀粉，加入1000mL蒸馏水，搅拌均匀，煮沸5分钟，待冷却至室温后，加入2g氯化钠、1g磷酸二氢钠，调pH值为6.0。
2. 制备黑曲霉菌悬液：将黑曲霉接种于葡萄糖培养基中，在28℃、180r/min的条件下培养24小时，取出菌液，用无菌生理盐水洗涤2次，制成菌悬液。
3. 接种：将黑曲霉菌悬液按1%的比例接入玉米淀粉培养基中，充分搅拌均匀。
4. 发酵：将接种后的培养基置于28℃、180r/min的条件下发酵48小时。
5. 柠檬酸提取：发酵结束后，将培养基过滤，收集滤液，加入适量的氢氧化钠，调节pH值为8.0，再加入适量的活性炭脱色，过滤后得到柠檬酸溶液。
6. 柠檬酸含量测定：采用滴定法测定柠檬酸溶液的含量。
五、实验结果与分析1. 发酵过程中，培养基pH值逐渐降低，说明黑曲霉在发酵过程中产生酸性代谢产物。
2. 柠檬酸含量测定结果显示，发酵液中含有一定量的柠檬酸。
3. 通过实验，成功地将玉米淀粉转化为柠檬酸，为玉米淀粉的深加工提供了新的途径。
六、实验总结1. 本实验成功地将玉米淀粉发酵转化为柠檬酸，为玉米淀粉的深加工提供了新的思路。
2. 通过实验，掌握了玉米淀粉发酵的基本原理和操作方法，了解了发酵过程中微生物的生长规律和代谢产物。
两阶段搅拌转速控制策略发酵生产柠檬酸
作者：李佳伟， 刘龙， 李江华， 堵国成， 陈坚， 孙福新， LI Jiawei， LIU Long， LI Jianghua， DU Guocheng， CHEN Jian， SUN Fuxin
作者单位：李佳伟,刘龙,李江华,LI Jiawei,LIU Long,LI Jianghua(江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122)， 堵国成,陈坚,DU Guocheng,CHEN Jian(江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室
,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122)， 孙福新,SUN Fuxin(宜兴
协联生物化学有限公司,江苏宜兴,214203)
刊名：
食品与生物技术学报
英文刊名：Journal of Food Science and Biotechnology
年，卷(期)：2014,33(2)
本文链接：/Periodical_wxqgdxxb201402004.aspx。
考点25 发酵工程——五年（2020—2024年）高考生物学真题专项分类汇编一、单选题1．【2024·山东卷】在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。
黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。
菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。
下列说法错误的是（）A.相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长D.发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品2．【2022·湖北卷】废水、废料经加工可变废为宝。
某工厂利用果糖生产废水和沼气池废料生产蛋白质的技术路线如图所示。
下列叙述正确的是（）A.该生产过程中，一定有气体生成B.微生物生长所需碳源主要来源于沼气池废料C.该生产工艺利用微生物厌氧发酵技术生产蛋白质D.沼气池废料和果糖生产废水在加入反应器之前需要灭菌处理3．【2023·重庆卷】垃圾分类有利于变废为宝，减少环境污染。
如图为分类后餐厨垃圾资源化处理的流程设计。
下列叙述错误的是（）A.压榨出的油水混合物可再加工，生产出多种产品B.添加的木屑有利于堆肥体通气，还可作为某些微生物的碳源C.X中需要添加合适的菌种，才能产生沼气D.为保证堆肥体中微生物的活性，不宜对堆肥体进行翻动4．【2024·江西卷】井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种（JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长）发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。
下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是（）A.JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因B.JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量C.提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量D.稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化5．【2023·浙江卷】某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。
钙盐沉淀法提取柠檬酸摘要：利用黑曲霉进行分离复壮，然后利用改良的马丁培养基进行发酵，再通过离心发酵液，利用两种不同的方法钙盐沉淀法和离子交换法进行分离柠檬酸，比较两种方法分离柠檬酸的产量，及两种方法的优缺点，同时还要注意发酵过程中，菌种的产量。
关键字；黑曲霉钙盐沉淀离子树脂交换引言：生产史;1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。
他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。
天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州、意大利和西印度群岛。
意大利的产量居首位。
到1922年，世界柠檬酸的总销售额的90％由美国、英国、法国等垄断。
发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。
1893年C.韦默尔发现青霉（属）菌能积累柠檬酸。
1913年B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。
1916年汤姆和柯里以曲霉属菌进行试验，证实大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。
如柯里以黑曲霉为供试菌株，在15％蔗糖培养液中发酵，对糖的吸收率达55％。
1923年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的工厂。
随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。
这样，依靠从柑橘中提取天然柠檬酸的方法逐渐为发酵柠檬酸所取代。
1950年前，柠檬酸采用浅盘发酵法生产。
1952年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。
此后，深层发酵法逐渐建立起来。
深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。
中国用发酵法制取柠檬酸以1942年汤腾汉等报告为最早。
1952年陈声等开始用黑曲霉浅盘发酵制取柠檬酸。
轻工业部发酵工业科学研究所于1959年完成了200l规模深层发酵制柠檬酸试验，1965年进行了生产100t甜菜糖蜜原料浅盘发酵制取柠檬酸的中间试验，并于1968年投入生产。
1966年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的这一主要工艺路线。
柠檬酸⽣产⼯艺柠檬酸及⽣产⼯艺摘要：柠檬酸⼴泛应⽤于⾷品⼯业、医药⼯业和化学⼯业等⽅⾯。
它可利⽤糖质原料如⼟⾖、地⽠中的淀粉等，在多种霉菌及⿊曲菌的作⽤下，控制较低的温度和pH值、较⾼的通⽓量和糖浓度，⽤发酵法制得。
关键词：柠檬酸化⼯产品发酵法1 产品说明柠檬酸⼜名枸橼酸，学名3-羟基-3-羧基戊⼆酸，分⼦式C6H8O7为⽆⾊、⽆臭、半透明结晶或⽩⾊粉未，易溶于⽔及酒精。
加热可以分解成多种产物，与酸、碱、⽢油等发⽣反应。
柠檬酸主要应⽤于⾷品⼯业，因为柠檬酸有温和爽快的酸味，普遍⽤于各种饮料、汽⽔、葡萄酒、糖果、点⼼、饼⼲、罐头果汁、乳制品等⾷品的制造。
柠檬酸在化学⼯业上可作化学分析⽤试剂，⽤作实验试剂、⾊谱分析试剂及⽣化试剂，⽤作络合剂，掩蔽剂，配制缓冲溶液。
采⽤柠檬酸或柠檬酸盐类作助洗剂，可改善洗涤产品的性能，可以迅速和沉淀⾦属离⼦，防⽌污染物重新附着在织物上，保持洗涤必要的碱性，使污垢和灰分散和悬浮，提⾼表⾯活性剂的性能，是⼀种优良的鳌合剂。
2 ⽣产原理2.1 ⽣产⽅法简介中国现有柠檬酸⽣产⼚近百家，总年产能⼒约80万吨，是全球最⼤的柠檬酸⽣产国和出⼝国。
⽬前，柠檬酸⽣产⽅法有⽔果提取法，化学合成法和⽣物发酵法三种。
⽔果提取法是指柠檬酸从柠檬、橘⼦、苹果等柠檬酸含量较⾼的⽔果中提取，此法提取的成本较⾼，不利于⼯业化⽣产。
化学合成法的原料是丙酮，⼆氯丙酮或⼄烯酮，此法⼯艺复杂，成本⾼，安全性低。
⽽发酵法发酵周期短，产率⾼，节省劳动⼒，占地⾯积⼩，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸⽣产的主要⽅法。
2.2 反应⽅程式C12H22011 +H20+302→2C6H8O7+4H2O(蔗糖) （柠檬酸）3 ⼯艺过程及流程图3.1⼯艺过程3.1.1菌种培养在4～6波美度的麦芽汁内加⼊25％⾄30％的琼脂，然后接⼊⿊曲霉菌种（⽆茵操作），在30～32℃条件下培养4天左右。
这种培养⽅法称为“斜⾯培养”。
利用黑曲霉发酵生产柠檬酸
摘要：柠檬酸是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一，它的用途非常广泛，需求日益增长。
目前国内柠檬酸年产量约2.5×105吨，其中半数以上供出口之用。
80年代，我国国内的柠檬酸消费急剧上升，速度远远超过了西方发达国家。
随着人民生活水平的提高，对食品和饮料等含柠檬酸制品的需求量猛增，但就人均消费量来看，我国的柠檬酸消费还是很低的，以用于食品和饮料的柠檬酸为例，我国的人均消费量远低于美国和日本，市场潜力巨大，因此增加柠檬酸生产不仅可以满足国内日益增长的需要，也是换取外汇的重要手段之一。
柠檬酸是葡萄糖经柠檬酸循环而形成的最有代表性的代谢产物，早已发展成大规模的商用生产。
常用的菌种是黑曲霉，产酸浓度在每升发酵液中＞150g。
关键词：黑曲霉，柠檬酸，三羧酸循环
1、柠檬酸用途
柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。
2、黑曲霉
黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。
广泛分布于世界各地。
食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、
柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。
3、柠檬酸循环（citric acid cycle，CAC）
又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），Krebs循环，由诺贝尔获奖者（1953年）、德国学者H.A.Krebs于1937年提出。
是指由丙酮酸经过
一系列环节作循环式反应而被彻底氧化、脱羧，形成CO
2、H
2
O和NADH
2
的过程。
这是一个广泛存在于各种生物体中的重要生物化学反应，在各种好氧微生物中普遍存在。
在真核微生物中，柠檬酸循环的反应在线粒体内进行，其中的大多数酶定位于线粒体的基质中；在原核生物中，大多数酶位于细胞质内。
只有琥珀酸脱氢酶属于例外，它在线粒体或原核细胞中都是结合在膜上的。
3.1 TCA循环的调节作用
3.1.1 TCA循环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。
但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA循环的第一个特点。
顺乌头酸酶失活，阻断TCA循环是柠檬酸积累的必要条件。
顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低。
3.1.2黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA循环被阻断）。
3.1.3氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。
标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。
4.发酵机理
4.1以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌糖化后产生高浓度的葡萄糖。
4.2黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以糖酵解途径、磷酸戊糖循环两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。
4.3生理调节：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调
的结果。
4.3.1Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4↑解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通，有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链
4.3.2由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。
丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。
4.3.3由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。
4.3.4随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。
5.黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响因素
一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。
温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。
微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。
柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。
随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。
采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60％饱和度对产酸有利。
柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。
参考文献
[1] 王镜岩，朱圣庚，徐长法，生物化学.高等教育出版社，2012,92-112
[2] 周德庆，微生物学教程.高等教育出版社，2013,106-148
[3] 胡雅琴，培养基组成对纤维素糖化液发酵生产柠檬酸的影响，山西化工，2003，第23卷第4期，20-21.。
