利用黑曲霉发酵产生柠檬酸

解析玉米液化清液发酵生产柠檬酸工艺摘要：本文通过试验探究的方式，以玉米清液为原料，以黑曲霉作为发酵菌株。

通过单因素筛选的方式优化清液培养基，并根据产酸量、菌丝球形态等，对各项指标进行明确，实现柠檬酸产量最大化目标。

根据试验结果可知，将初糖浓度设定为18%、采用分段通风转速控制方式，在发酵超过48h后可使柠檬酸产量达到最大值，即18.33g/100mL，糖酸转化率达到101.8%。

与传统带渣发酵相比，产酸量与转化率得到显著提升。

关键词：玉米清液；柠檬酸；发酵生产引言：粗玉米中蕴含着丰富的蛋白质，直接用其生产柠檬酸会使菌体飞速生长，对产酸造成严重阻碍。

为避免这一情况，可将玉米粉液化后清楚残渣，液内蛋白质含量较低，利用清液发酵柠檬酸，不但可缩短发酵周期，还可提高转化率。

当前，国内许多工厂已经陆续普及此种工艺，为提高玉米资源利用率，应对发酵生产工艺进行细致分析。

1试验材料与方法1.1材料与仪器本试验的菌株为黑曲霉；主要试剂为酵母粉、无水葡萄糖、FeSO4、玉米浆、a-淀粉酶，剂量为40000U/mL，肌醇；培养基为马铃薯葡萄糖琼脂、种子基础与发酵基础培养基；主要仪器设备为光学显微镜，型号为OLYMPU719068；电子天平，型号为FA2004N；总糖计，型号为WYT-J；恒温振荡器，型号为HZQ-QX；发酵罐，剂量为30L。

1.2试验方法1.2.1初糖含量与柠檬酸产量关系将清液中初糖浓度分别设定为16%、18%和20%，按10%接种量，在36.5℃、转速为400r/min、罐压为0.1MPa、通风为400L/h环境下发酵。

在初始发酵时，每间隔8h分别从不同浓度罐体内取样，对液体PH值与柠檬酸产量进行测定，在放罐完毕后称取菌丝体净重，检测净重变化情况，并检测残还原糖值[1]。

1.2.2还原糖测定通过费林试剂热滴定方式，以亚甲基蓝作为指示剂进行测定。

在空白滴定方面，分别吸取甲乙液体各5ml，放入250ml的锥形瓶内，滴入19ml左右的葡萄糖标准液，加热至沸腾，沸腾时间为30s，每2s滴入1滴，直至溶液蓝色消失，测定葡萄糖溶液的总体积，反复操作3次，记录平均值。

一、实验目的1. 掌握玉米淀粉发酵的基本原理和操作方法；2. 了解发酵过程中微生物的生长规律和代谢产物；3. 培养实验操作技能，提高对发酵工艺的认识。

二、实验原理玉米淀粉是一种重要的碳水化合物，在微生物的作用下，可以转化为酒精、乳酸等代谢产物。

本实验采用黑曲霉作为发酵菌种，利用其发酵玉米淀粉产生柠檬酸。

三、实验材料1. 实验仪器：锥形瓶、酒精灯、烧杯、量筒、玻璃棒、温度计、pH计、过滤装置等；2. 实验试剂：玉米淀粉、黑曲霉、蒸馏水、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠等；3. 实验培养基：玉米淀粉培养基、葡萄糖培养基、氯化钠培养基等。

四、实验步骤1. 准备玉米淀粉培养基：称取100g玉米淀粉，加入1000mL蒸馏水，搅拌均匀，煮沸5分钟，待冷却至室温后，加入2g氯化钠、1g磷酸二氢钠，调pH值为6.0。

2. 制备黑曲霉菌悬液：将黑曲霉接种于葡萄糖培养基中，在28℃、180r/min的条件下培养24小时，取出菌液，用无菌生理盐水洗涤2次，制成菌悬液。

3. 接种：将黑曲霉菌悬液按1%的比例接入玉米淀粉培养基中，充分搅拌均匀。

4. 发酵：将接种后的培养基置于28℃、180r/min的条件下发酵48小时。

5. 柠檬酸提取：发酵结束后，将培养基过滤，收集滤液，加入适量的氢氧化钠，调节pH值为8.0，再加入适量的活性炭脱色，过滤后得到柠檬酸溶液。

6. 柠檬酸含量测定：采用滴定法测定柠檬酸溶液的含量。

五、实验结果与分析1. 发酵过程中，培养基pH值逐渐降低，说明黑曲霉在发酵过程中产生酸性代谢产物。

2. 柠檬酸含量测定结果显示，发酵液中含有一定量的柠檬酸。

3. 通过实验，成功地将玉米淀粉转化为柠檬酸，为玉米淀粉的深加工提供了新的途径。

六、实验总结1. 本实验成功地将玉米淀粉发酵转化为柠檬酸，为玉米淀粉的深加工提供了新的思路。

2. 通过实验，掌握了玉米淀粉发酵的基本原理和操作方法，了解了发酵过程中微生物的生长规律和代谢产物。

两阶段搅拌转速控制策略发酵生产柠檬酸
作者：李佳伟， 刘龙， 李江华， 堵国成， 陈坚， 孙福新， LI Jiawei， LIU Long， LI Jianghua， DU Guocheng， CHEN Jian， SUN Fuxin
作者单位：李佳伟,刘龙,李江华,LI Jiawei,LIU Long,LI Jianghua(江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122)， 堵国成,陈坚,DU Guocheng,CHEN Jian(江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室
,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122)， 孙福新,SUN Fuxin(宜兴
协联生物化学有限公司,江苏宜兴,214203)
刊名：
食品与生物技术学报
英文刊名：Journal of Food Science and Biotechnology
年，卷(期)：2014,33(2)
本文链接：/Periodical_wxqgdxxb201402004.aspx。

柠檬 酸 ， 又称 枸橼 酸 ， 三 羧酸循 环 的重要 组成 是
Ｃ Ｅ ｕ— ｅ， Ｏ ＧＺ ｉｊ ｎ， Ｉ ｉｎｃｅｇ Ｃ Ｉａ－ ｕ Ｈ Ｎ Ｘ ｅｍ ｉ Ｓ Ｎ ｈ－ｉ Ｌ ａ－ｈｎ Ａ ｉｈ ａ ａ Ｊ ， ｚ
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ห้องสมุดไป่ตู้
互相 制 约 。本 文 同 时探 讨接 种 量 和 Ｃ／ 对 黑 曲霉 发 酵柠 檬 酸 产 酸 率 的影 响 ， 用 Ｍ ａａ Ｎ 利 ｄｂ对 数 据进 行 响 应 面 分析 ， 优 化 得 出此 时 其发 酵最 佳 接种 量为 ５０ ０－８０ ８ ０＂ ００个 茵球 每 毫升 ， ６ 最佳 Ｃ Ｎ 为 ２ ． － ４ ３ １ ／ ２ ６２． ：。 ３ ４ 关键 词 ： 檬 酸 ；黑曲 霉 ； Ｎ； 种量 ；响应 面 柠 Ｃ／ 接 中国 图书 分类 号 ：Ｓ ２ Ｔ９ １ 文 献 标识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：６ １ ６ ９ （０ ８ ０ — ０ ９ ０ ０ １７ — ８ ２ ２ ０ ）６ ０ ２— ０ ３

考点25 发酵工程——五年（2020—2024年）高考生物学真题专项分类汇编一、单选题1．【2024·山东卷】在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。

黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。

菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。

下列说法错误的是（）A.相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长D.发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品2．【2022·湖北卷】废水、废料经加工可变废为宝。

某工厂利用果糖生产废水和沼气池废料生产蛋白质的技术路线如图所示。

下列叙述正确的是（）A.该生产过程中，一定有气体生成B.微生物生长所需碳源主要来源于沼气池废料C.该生产工艺利用微生物厌氧发酵技术生产蛋白质D.沼气池废料和果糖生产废水在加入反应器之前需要灭菌处理3．【2023·重庆卷】垃圾分类有利于变废为宝，减少环境污染。

如图为分类后餐厨垃圾资源化处理的流程设计。

下列叙述错误的是（）A.压榨出的油水混合物可再加工，生产出多种产品B.添加的木屑有利于堆肥体通气，还可作为某些微生物的碳源C.X中需要添加合适的菌种，才能产生沼气D.为保证堆肥体中微生物的活性，不宜对堆肥体进行翻动4．【2024·江西卷】井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种（JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长）发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。

下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是（）A.JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因B.JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量C.提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量D.稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化5．【2023·浙江卷】某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。

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１材料与方法 ．
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【 键词 】 黑 曲霉 关 柠檬酸 发 酵 条件 添 加 剂 ， ５０×１４个 ／ ｌ接 入 菌 种 ， 床 转 速 ３ ０ 按 ． ０ ｍ 摇 ０ ｒ／ｍ ｎ 温 度 ３ ℃ ｉ， ４ 培 养 ４ ｈ后 记 录产 酸情 况 。 ８
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钙盐沉淀法提取柠檬酸摘要：利用黑曲霉进行分离复壮，然后利用改良的马丁培养基进行发酵，再通过离心发酵液，利用两种不同的方法钙盐沉淀法和离子交换法进行分离柠檬酸，比较两种方法分离柠檬酸的产量，及两种方法的优缺点，同时还要注意发酵过程中，菌种的产量。

关键字；黑曲霉钙盐沉淀离子树脂交换引言：生产史;1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。

他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。

天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州、意大利和西印度群岛。

意大利的产量居首位。

到1922年，世界柠檬酸的总销售额的90％由美国、英国、法国等垄断。

发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。

1893年C.韦默尔发现青霉（属）菌能积累柠檬酸。

1913年B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。

1916年汤姆和柯里以曲霉属菌进行试验，证实大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。

如柯里以黑曲霉为供试菌株，在15％蔗糖培养液中发酵，对糖的吸收率达55％。

1923年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的工厂。

随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。

这样，依靠从柑橘中提取天然柠檬酸的方法逐渐为发酵柠檬酸所取代。

1950年前，柠檬酸采用浅盘发酵法生产。

1952年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。

此后，深层发酵法逐渐建立起来。

深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。

中国用发酵法制取柠檬酸以1942年汤腾汉等报告为最早。

1952年陈声等开始用黑曲霉浅盘发酵制取柠檬酸。

轻工业部发酵工业科学研究所于1959年完成了200l规模深层发酵制柠檬酸试验，1965年进行了生产100t甜菜糖蜜原料浅盘发酵制取柠檬酸的中间试验，并于1968年投入生产。

1966年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的这一主要工艺路线。

送带 8一鼓风机 9一空调室 10一循环风道 11-室闸门
b 厚层通风发酵
与浅盘发酵明显不同的是，在物料铺摊厚度上，厚 层发酵的曲醅厚度在50cm左右，比浅盘发酵的 15~20cm要大出许多。
为了给曲霉菌提供氧，在培养过程中需要进行机械 通风。
培养过程中的温度控制与浅盘发酵的温度管理相似， 但最高品温不能超过40℃。温度和湿度主要靠通风 来调节，因为物料厚度大，所以培养过程中需要翻 料。
b 厚层通风发酵
厚层发酵与空气的接触面小，所以需要在容器底部 设置空气通道，以利于通氧，这种发酵设备又称发 酵箱，这种发酵箱为厚层通风制曲箱，简称曲箱。 大型的曲箱可以配置翻曲机，这样曲层可以加厚。

机械通风固体曲发酵设备
1一输送带 2一高位料斗 3一送料小车 4一曲料室 5一进出料机 6一料斗 7一输
c 一般发酵法影响表面发酵的因素
a) 培养液层厚度 b) 糖浓度 c) 温度 d) pH值 e) 通风
③ 固体发酵
分为浅盘发酵和厚层通风发酵，统称曲法发酵。 固体发酵工艺具有的优点： （1）设备简单，投资少； （2）操作简单，能耗低，适应性强； （3）原料粗放，来源广泛，培养基简单； （4）发酵时间短 缺点是设备占地面积大、劳动强度大，传质传热 困难，产品回收率低，副产物多等。
特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求 以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培 养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。
① 柠檬酸的液体深层发酵工艺
（1）发酵温度 黑曲霉发酵柠檬酸温度控制在28~30℃，柠檬酸 产率最高，发酵速度较快，超过35℃时，虽然初 期产酸较快，但最终的发酵产率降低15%以上。 为了节约降温能耗，我国成功培育出高温发酵的 产酸微生物，可以在37℃发酵。 （2）pH

柠檬酸⽣产⼯艺柠檬酸及⽣产⼯艺摘要：柠檬酸⼴泛应⽤于⾷品⼯业、医药⼯业和化学⼯业等⽅⾯。

它可利⽤糖质原料如⼟⾖、地⽠中的淀粉等，在多种霉菌及⿊曲菌的作⽤下，控制较低的温度和pH值、较⾼的通⽓量和糖浓度，⽤发酵法制得。

关键词：柠檬酸化⼯产品发酵法1 产品说明柠檬酸⼜名枸橼酸，学名3-羟基-3-羧基戊⼆酸，分⼦式C6H8O7为⽆⾊、⽆臭、半透明结晶或⽩⾊粉未，易溶于⽔及酒精。

加热可以分解成多种产物，与酸、碱、⽢油等发⽣反应。

柠檬酸主要应⽤于⾷品⼯业，因为柠檬酸有温和爽快的酸味，普遍⽤于各种饮料、汽⽔、葡萄酒、糖果、点⼼、饼⼲、罐头果汁、乳制品等⾷品的制造。

柠檬酸在化学⼯业上可作化学分析⽤试剂，⽤作实验试剂、⾊谱分析试剂及⽣化试剂，⽤作络合剂，掩蔽剂，配制缓冲溶液。

采⽤柠檬酸或柠檬酸盐类作助洗剂，可改善洗涤产品的性能，可以迅速和沉淀⾦属离⼦，防⽌污染物重新附着在织物上，保持洗涤必要的碱性，使污垢和灰分散和悬浮，提⾼表⾯活性剂的性能，是⼀种优良的鳌合剂。

2 ⽣产原理2.1 ⽣产⽅法简介中国现有柠檬酸⽣产⼚近百家，总年产能⼒约80万吨，是全球最⼤的柠檬酸⽣产国和出⼝国。

⽬前，柠檬酸⽣产⽅法有⽔果提取法，化学合成法和⽣物发酵法三种。

⽔果提取法是指柠檬酸从柠檬、橘⼦、苹果等柠檬酸含量较⾼的⽔果中提取，此法提取的成本较⾼，不利于⼯业化⽣产。

化学合成法的原料是丙酮，⼆氯丙酮或⼄烯酮，此法⼯艺复杂，成本⾼，安全性低。

⽽发酵法发酵周期短，产率⾼，节省劳动⼒，占地⾯积⼩，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸⽣产的主要⽅法。

2.2 反应⽅程式C12H22011 +H20+302→2C6H8O7+4H2O(蔗糖) （柠檬酸）3 ⼯艺过程及流程图3.1⼯艺过程3.1.1菌种培养在4～6波美度的麦芽汁内加⼊25％⾄30％的琼脂，然后接⼊⿊曲霉菌种（⽆茵操作），在30～32℃条件下培养4天左右。

这种培养⽅法称为“斜⾯培养”。

谢 谢！
JUST DO IT！
人手洗手消毒前后手部卫生状况对比
• 洗手前：1300个/cm2 • 清水洗手后：1000个/cm2 • 肥皂洗手后：80个/ cm2 • 消毒后：0个/ cm2
未洗的手
未打皂液洗过的手
洗净的手（用洗剂）
洁净的手（消毒后）
进 入 工 作 岗 位 以 后 环境卫生是实验室、发酵工 人、消毒人员及厂区工作人 员必须时刻铭记的基本常识。
黑曲霉如何积累柠檬酸
黑曲霉耐酸，耐低PH。 黑曲霉发酵柠檬过程中，在发酵初期， 发酵液中萄葡糖含量较高，而高浓度的萄 葡糖正是黑曲霉α-酮戊二酸脱氢酶合成的 抑制物，这样一来TCA循环就中断了，酸 度得到积累（注意此时积累的是酸度而不 仅是柠檬酸），但是当酸度积累到PH≤2.0 时，催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正 逆反应的顺乌头酸水合酶，不表现出活力 ，这样TCA循环在合成柠檬酸之后就不会 向后继续反应，从而达到柠檬的积累。
传播污染的四大媒介－人
第四个帮凶可能是大家都不会想 到的，它就是我们自己，人体是一个 永不休止的污染媒介。当您每天来工 厂上班时，您也许随身将几百万细菌
带入工厂。
人员污染的途径和方式
人的头发和皮肤：每分钟从人类皮肤中要散发出约10,000个微
生物
嘴巴和鼻子——水滴：呼吸、咳嗽和喷嚏将产生出大量水滴，
黑 曲 霉 生 长 周 期
发酵常见染菌及区别
一、酵母菌是一些单细胞真菌，体积较细 菌较大 ，1~5微米*5~30微米，而细菌直 径或宽度不超过1微米，长不超过5微米， 有氧无氧均可生存，低PH也可生存。
二、细菌主要由细胞膜、 细胞质、核质体等部分构 成 ，球菌、杆菌和螺形 菌 ，低PH难以存活，易 自溶。

高考生物考点《发酵工程》真题练习含答案1．[2023·山东卷]平板接种常用在微生物培养中。

下列说法正确的是()A．不含氮源的平板不能用于微生物培养B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物答案：D解析：不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。

2．[2024·湖北卷]制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。

醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。

下列叙述错误的是()A．食用醋的酸味主要来源于乙酸B．醋酸菌不适宜在无氧条件下生存C．醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶D．葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内答案：D解析：醋酸菌是好氧细菌，当O2、糖源都充足时，能通过复杂的化学反应将糖分解成乙酸；当缺少糖源时则直接将乙醇转化为乙醛，再将乙醛转变为乙酸。

乙酸有酸味，因此，食用醋的酸味主要来源于乙酸，A正确。

醋酸菌是好氧细菌，不适宜在无氧条件下生存，B正确。

当缺少糖源时，醋酸菌直接将乙醇转化为乙醛，再将乙醛转变为乙酸，因此，醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶，C正确。

醋酸菌为原核生物，其不含有线粒体，D错误。

3．下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法，错误的是()A．因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离B．测定土壤中不同微生物的数量，选用的稀释范围不同C．若得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数D．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落答案：D解析：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目，A正确；土壤中不同类型的微生物的数量不同，因此在测定其数量时，选用的稀释范围也不同，B正确；实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300的平板，C正确；将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，从而说明选择培养基的筛选作用，D错误。

实验一柠檬酸发酵1、实验目的了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及中间分析方法。

2、实验原理黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径(EMP)和HMP途径转变为丙酮酸;丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。

黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的a-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。

其理论反应式为C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O柠檬酸理论得率为106.7%;若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。

3、实验装置与流程(I)实验装置与材料:A、实验装置：旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机(4000-6500r/min) 。

B、菌种:黑曲霉柠檬酸生产菌株Co8-27。

C、材料：麸皮，马铃薯,薯干淀粉,蔗糖,玉米粉,大麦芽，大米,琼脂,淀粉酶(中温酶与高温酶)。

D、器皿：15mL试管，100mL三角瓶，2000mL烧杯,500mL三角瓶,离心管若干。

E、试剂:0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，费林甲，乙溶液，0.01%标准葡萄糖溶液。

(II)实验流程:保藏菌株→活化菌株(斜面培养)→200mL三角瓶麸曲培养→500~1000mL三角瓶液体发酵。

(III)斜面培养基:马铃薯琼脂培养基：去皮马铃薯200g切成小块,加水约500mL,煮沸30min，然后用纱布过滤,滤液加蔗糖20g，琼脂20g，溶化后自来水定容至1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121C灭菌20min，取出摆成斜面备用。

摇瓶发酵培养基：取细度为40目以上的淀粉6~8g，装入500mL三角瓶中,再加入物40mL水和5个单位淀粉酶(中温)/g淀粉,于75-80'C下液化15min。

型突变株 思考：这样做有什么不足？ห้องสมุดไป่ตู้
(2) 选育渗漏缺陷型突变株 苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷(或预苯酸缺陷)使得菌株生长
缓慢，因此可选育预苯酸渗漏缺陷型突变株 渗漏缺陷型是一种不完全营养缺陷型，它不会产生过量的末
端产物，因而可以避开反馈调节 但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成 在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，
弱化子
p 解除反馈调节，增强色氨酸合成途径代谢流(通) 解除色氨酸抑制作用：
(1) 选育色氨酸结构类似物(5-氟色氨酸、5-甲基色氨酸) 抗性突变株
变构，失活
酶
色氨酸
问题：诱变后存活的微生物 包括正向突变(想要的)、负 向突变(不想要的)，怎么把 正向突变的筛选出来？
5-氟色氨酸 5-甲基色氨酸
四、青霉素发酵
生物合成途径
四、青霉素发酵
代谢调节
碳分解代谢产物的影响
Ø 青霉素的生物合成受碳分解代谢产物阻遏，如ACV合成 酶，IPN合成酶，酰基转移酶就被阻遏
Ø 葡萄糖可以刺激菌体生长，使作为赖氨酸和青霉素合 成中间体的α-氨基己二酸转向合成赖氨酸，抑制青霉 素的合成
Ø 葡萄糖降低青霉素生物合成的速率和得率还由于葡萄 糖与6-APA之间形成复合物，从而减少了可用于合成青 霉素的中间产物。
Ø 选育单氟乙酸、三氟乙酸敏感突变株 抑制乌头酸梅和异柠檬酸脱氢酶活性。若菌体对药品 敏感，说明该突变株的乌头酸酶和异柠檬酸酶活力低或 含量少
Ø 选育强化CO2固定反应的突变株 氟丙酮酸敏感、天冬氨酸缺陷、羧化酶基因克隆
Ø 强化柠檬合成酶
一、柠檬酸发酵
发酵控制
Ø 控制Mn2+和NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP 畅通无阻

体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：
柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。铁为顺乌头酸酶的激
活剂，
顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬
酸产生与不产生时，这3种酶均存在（组成酶）；而控制铜离
子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现
活力。
亮氨酸
黄色短杆菌
酪氨酸
氨酸棒杆菌
氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵
氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由发酵所生成的
产物——氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积
在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使
TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。
（中间产物少，C架少，不利于合成代谢，不利于孢子的
形成）
第五章 氨基酸发酵机制
（谷氨酸发酵）
一、概 述
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在食品工业上的应用。甘氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨
酸具有酸味，谷氨酸钠、天冬氨酸钠具有鲜味，可用作食品添加剂。
二、柠檬酸的应用概况
➢食品工业：主要作为饮品的酸味剂，用于各种清凉饮料，还有
汽水、糖果、饼干、罐头、果酱、果汁等食品的制造。 也可用作油脂
的抗氧剂；
➢医药工业：是许多医药品的原材料，如柠檬酸哌吡嗪（驱蛔虫
药）、柠檬酸铁铵（补血剂）、柠檬酸钠（输血剂）等。此外，柠檬
酸还用在许多医药中做酸化剂；
➢化学工业：柠檬酸的酯类可以作为无毒增塑剂，来制造食品包
❖
质子载体： 2，4-二硝基酚(DNP)，羰基-氰-对-三氟甲氧
基苯肼(FCCP)。
❖
质子通道：增温素（thermogenin）。

糊化
灭菌
接种
摇瓶培养
五、实验结果与讨论 （一）实验结果 要求记录发酵开始0h、20h、42h和发酵结 束时对照组和实验组的变化. (二)思考题 1、实验中为什么不需要糖化完全？ 2、加入CaCO3在培养基中会怎样？为什么 会出现这种情况 3、经EMP途径合成柠檬酸的特点？ 4、经HMP途径合成柠檬酸的特点？
本实验以玉米淀粉为原料,采用黑曲霉经摇 瓶发酵产生柠檬酸,柠檬酸需进一步分离纯化 得到产品.
三、实验仪器及试剂
试剂：玉米淀粉、黑曲霉孢子悬液、α-淀粉 酶、水 仪器：三角瓶 300ml、玻璃棒、电子秤、摇 床、水浴锅、高压灭菌锅、移液管
四、实验步骤
1、试验流程
保藏菌株 活化菌株 α-淀粉酶 玉米淀粉 72h） 糊化液化 灭菌 孢子悬液 接种 300ml三角瓶摇瓶培养（150r.p.m
发酵工艺学实验——
柠檬酸发酵试验
中国海洋大学 食品科学与工程学院
一、实验目的 1、了解柠檬酸发酵的原理及过程； 2、掌握柠檬酸好气发酵操作；
三、实验原理 柠檬酸有称枸枸橼酸，学名2-羟基丙烷三 羧酸或2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸，是水果 中含量极为丰富的一种有机酸。柠檬酸因无毒 水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉的 优点，被广泛的应用于食品、医药、化工、洗 涤等工业部门。 能够产生柠檬酸的微生物有很多，青霉、 毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些 菌株都能利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬 酸。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发 酵生产柠檬酸
பைடு நூலகம்
2、按下表的顺序进行实验操作
培养基制备
取两个300ml三角瓶标号，各加入30g淀粉和75ml水 ，搅拌均匀，对照组中加入CaCO3 2g. 两三角瓶内各加入0.6g α-淀粉酶 ，混合均匀后置 于75摄氏度的水浴锅内糊化1h. 将糊化后的三角瓶用八层纱布包扎置于灭菌锅内， 121℃下灭菌20min. 在超净工作台上按无菌操作用已灭菌的10ml移液管 移去10ml孢子悬液加入两三角瓶中. 将接完种的三角瓶，在150r.p.m 72h，在培养过程 中注意定期观察菌丝体生长情况并记录实验现象， 当ph达到2时发酵结束.

柠檬酸发酵摘要：柠檬酸是微生物发酵法生产的重要有机酸，用途极为广泛。

柠檬酸发酵菌黑曲霉在柠檬酸工业中占有重要地位。

该文论述了柠檬酸发酵菌黑曲霉的发酵机制、代谢调控及柠檬酸积累的机理,黑曲霉代谢工程的控制及菌株的改良，并对黑曲霉代谢工程的改造进展进行总结。

关键词：柠檬酸;黑曲霉;代谢工程;改造Citric Acid FermentationAbstract:Citric Acid is an important organic acid produced by microorganism fermentation and is widely used in industries. Aspergillus niger is a fungus that plays an important role in Citric Acid production. The thesis discusses the fermentation mechanism and metabolic regulatory mechanism of Aspergillus niger, the accumulation mech anism of Citric Acid, the control of Aspergillus niger’s metabolic engineering and the improvement of the microbial strain, and summarizes the transformation progresses made in Aspergillus niger’s metabolic engineering. Keywords:Citric Acid; Aspergillus niger; metabolic engineering；improvement一、柠檬酸1、简介柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。

贵州省2024年高考生物模拟试卷16小题，每小题3分，共48分。

在每小题给出的四1．在农业生产和科学研究过程中，经常需要根据生物学原理采取某些措施使植物生长满足人们的需求，下列叙述正确的是（）A．在大棚里增施CO2是为了促进有氧呼吸B．去除顶芽是为了促进果实的成熟C．人工授粉是为了保留全部亲本性状D．人工补光是为了提高植物有机物的积累2．科学家在厌氧型光合细菌中发现了一种利用菌绿素的原始光合作用机制，其基本原理如图所示。

该细菌的光合作用与高等植物相比，下列叙述错误的是（）A．ATP的合成同样依赖色素分子吸收光能B．菌绿素和叶绿素同样位于类囊体薄膜C．（CH2O）的合成都需要ATP和NADPH的参与D．该细菌不释放O2是因为NADPH的H来自H2S3．生物膜独特的组成和结构使其在物质运输中扮演着重要角色。

下列叙述错误的是（）A．膜的磷脂分子中饱和脂肪酸比例升高会使膜流动性升高B．膜上转运蛋白可通过主动运输或协助扩散的方式运输K+C．胰岛素或乙酰胆碱可通过囊泡与细胞膜融合排出细胞D．核膜上的核孔允许核内转录得到的tRNA运出细胞核4．细胞中甲、乙两类生物大分子的单体结构如图所示。

下列叙述错误的是（）A．甲和乙中的部分种类具有酶的催化活性B．甲分子R基排列顺序的多样性可决定乙分子的多样性C．若a为OH，则甲与乙形成的某种复合物可构成甲的合成场所D．若a为H，则甲与乙形成的某种复合物在有丝分裂中呈现不同形态5．苯丙酮尿症是一种常染色体隐性遗传病。

患者不能把苯丙氨酸转变为酪氨酸，导致血液中苯丙氨酸积累，影响智力发育。

下列叙述正确的是（）A．苯丙酮尿症在男性和女性中患病概率不同B．正常双亲生出患病子女是基因重组导致的C．该病症可通过控制苯丙氨酸的摄入来根治D．禁止近亲结婚可降低苯丙酮尿症的发病率6．PER是存在于下丘脑某细胞中的一种重要生物钟基因，当其突变或者缺失时，会引起节律紊乱。

PER蛋白的合成过程如下图所示。