Biacore T200 SPR 详细操作流程-2亲和力及动力学测定和数据分析

3) 在setup 对话框中，设置Startup 。

在运行正式样品前，通常都会运行若干Startup 循环，目的是让系统在开始阶段模拟运行样品，以达到稳定的基线和系统状态。

因此此时的样品一般都用缓冲液替代分析物样品。

在solution 中输入Buffer ，Number of Cycles 设为3（通常为3-5次）。

点击Next
，进入下一步。

四 测定亲和力和动力学（多循环）
在这章节中，我们将应用向导程序设置多循环实验，完成亲和力和动力学数据的检测。

同时，我们也将介绍如何分析所得到的实验数据。

在第2章中，我们已经在芯片上偶联了配体（β2-microglobulin 抗体）。

在第3章中，我们确定了分析物（β2-microglobulin ）的浓度范围和再生试剂条件。

在这章节中，我们将会检测配体和分析物的亲和力和动力学。

4.1设置多循环动力学
1) 打开New Wizard Template ，在Assay 中选择Kinetics/Affinity ，点击New 。

2) 在Injection Sequence 对话框中，Flow path 选择2-1，Chip type 选择CM5，点击Next ，进入下一步。

4) 在Injection Parameters对话框中，设置进样、解离和再生的相关参数。

在Sample中，Contact time是指分析物的进样时间，通常为1-5分钟，本次实验设为180s。

亲和力实验的Flow rate必须大于30μl/min，此处设为30μl/min。

Dissociation time是指解离时间，需根据样品的情况设置，此处设为300s。

在Regeneration中，Solution输入regeneration scouting结果中确认的再生试剂条件，Glycine-HCl 2.5。

Contact time设为30s，Flow rate设为30μl/min。

如果再生试剂选择的是NaOH，建议在Stabilization period中设置60s的稳定时间。

点击Next，进入下一步。

5) 在Samples对话框中填写样品的名称和浓度信息。

请注意，如果是同一样品，即使浓度不同，其名称也必须保持一致。

本次实验的分析物是beta2micro，分子量11800Da，浓度分别为0、2、4、8、16、32nM。

注意在Concentration 中选择正确的浓度单位。

此外，必须运行一个重复的浓度以检测实验的重复性，因此最后加上一个8nM的样品。

如果需要加入对照样品，可在下方的Control samples中填入。

点击Next，进入下一步。

6) 去掉Prime before run前的打勾。

点击Cycle run list，确认实验运行中所有的循环是否正确。

点击Next，进入下一步。

7) 按照3.2(8)--(10)中的方法，更换试管架型号，合并样品管以及更换试管种类。

8) 样品准备：
A. 从实验3.1中的A1试管中取226μl样品，HBS-EP缓冲液取374μl，置于试管中混匀，样品最终浓度为32nM，试管标记为S6。

B. 从S6试管中取出300μl样品，HBS-EP缓冲液取300μl，置于试管中混匀，样品最终浓度为16nM，试管标记为S5。

C. 依照B的操作方法，依次制备S4（8nM），S3（4nM），S2（2nM）。

D. 取160μl HBS-EP缓冲液置于试管，标记为S1（0nM）。

E. 取一个空试管，加入500μl HBS-EP缓冲液，标记为buffer。

F. 取一个空试管，加入500μl Glycine-HCl 2.5再生试剂，标记为Reg。

9) 剪去所有试管的盖子，盖上对应的橡皮盖。

将准备好的样品放置于样品架中的指定位置。

点击Next。

10) 检查一下缓冲液，点击Start。

11) 保存方法和结果文件，结果文件保存为“Kinetic data.blr”。

实验开始进行。

12) 数据分析请参考第7章节。

五 捕获法和单循环动力学
捕获法（Capture）是一种常用的实验方法，对于抗体或是带有标签的配体有良好的实验效果，而且再生条件也易于掌握和控制。

单循环动力学是一种快捷的亲和力和动力学的检测方法，相较于多循环检测法，其具有快速、简单和易于再生的优点。

本章节的练习将结合上述两种方法，检测配体和分析物之间的亲和力和动力学。

5.1捕获法
在应用捕获法进行实验时，通常会将可以和配体特异性结合的捕获分子（通常是抗体，且不会和分析物结合）固定在芯片上。

检测过程中，配体会特异性的结合到捕获分子上，然后再检测分析物和配体之间的相互作用。

本次实验中，配体是单克隆mouse-anti-human β2-microglobulin 抗体，所以选择单克隆Anti-Mouse IgG抗体作为捕获分子。

偶联捕获分子
1) 偶联捕获分子：通常会在参比通道和样品通道上同时偶联捕获分子。

通过参比通道，可以检测捕获分子是否和分析物存在结合，避免干扰实验结果。

实验需要偶联量尽量高一些，因此会采用Specify contact time and flow rate作为偶联目标的设置。

2) 打开向导程序中的Immobilization项，选择需要偶联的通道，本次实验选择Fc1和Fc2。

在Ligand中输入捕获分子的名称Anti-Mouse IgG，选择Specify contact time and flow rate模式，Contact time设为420s，Flow rate为10μl/min。

3) 根据程序提示准备相应的样品。

Anti-Mouse IgG抗体的最终浓度为30μg/ml，偶联缓冲液为醋酸钠pH5.0（5μl+162μl）。

具体设置方法请参考2.4章节的内容。

实验方法设定
接下来，我们将演示如何在向导程序中设定捕获法，用多循环模式测定单个配体和分析物之间的相互作用。

如果有多种配体或采用单循环动力学检测，则需要用户编写方法实现，我们将会在后续的内容中介绍相关方法。

4) 打开New Wizard Template，在Assay中选择Kinetics/Affinity，点击New。

5) 在Injection Sequence对话框中，Flow path选择2-1，Chip type选择CM5。

勾选Ligand Capture选项，可以在流程图中看到，Sample前加入了Ligand Capture步骤。

点击Next，进入下一步。

完成Setup对话框，进入下一步。

6) 在Injection Parameters对话框中，Ligand填写anti-beta2micro，Contact time设60s，Flow rate为10μl/min。

其他参数参见4.1章节的内容。

后续步骤基本和4.1中的多循环模式一致，在这里我们暂不展开。

5.2单循环动力学
单循环动力学（Single Cycle Kinetics，SCK）是新一代Biacore系统中增加的功能。

其改变了传统的多循环模式中，重复进样→再生的实验模式，而采用将分析物从低浓度到高浓度连续进样，最后一次再生的模式。

在本练习中，我们将在捕获法的基础上，应用单循环动力学实现配体和分析物之间的相互作用分析。

对于T200系统，需要用户编辑Method完成SCK的设置。

1) 在工具栏中选择File→Open/New Method，打开向导对话框。

2) 选择Biacore Methods文件夹，点击Open。

Biacore Mothed目录下有众多常用的已编辑的方法。

如果需要完全新建方法，则选择New。