微生物检验中菌落总数的不确定度如何评定

农村饮用水菌落总数检验中不确定度的评定测量不确定度的评定是实验室质量管理体系的重要组成部分，一切测量方法结果都不可避免地具有不确定度。

对水质菌落总数检验进行不确定度评定，是水质微生物检验实验室内部质量控制的一部分，现将本实验室进行农村水质菌落总数测定不确定度评定的方法予以介绍。

1 原理与方法1.1 原理测量不确定度是指表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。

测量不确定度包括标准不确定度和扩展不确定度[]1。

1.2 检验方法[2] 以无菌操作方法吸取1ml充分混匀的水样，注入盛有9ml无菌生理盐水的试管中，混匀制成1∶10的稀释液；吸取1∶10的稀释液1ml注入9ml灭菌生理盐水的试管中，混匀制成1∶100的稀释液；同法依次制成1∶1000、1∶10000的稀释液备用；用灭菌吸管取未稀释的水样和2～3个适宜稀释度的水样1ml，分别注入灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。

然后在平皿内注入45℃左右营养琼脂约15ml，立即旋摇混匀，同时做营养琼脂空白对照；待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养48h，进行菌落计数；选择菌落数在30～300稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数作为检测结果。

1.3 数学模型设菌落总数为A，试验结果为x，则。

最佳值为。

1.4 计算公式；；。

2 结果与分析2.1 结果20个农村饮用水水质菌落总数检测结果见表1。

计算得出合并样本标准不确定度S=0.0422；总体合成标准不确定度Uc=0.0298；取置信水平95%，v＝20，查t分布表得，t95(20)=2.086，扩展不确定度U=0.0622。

2.2 分析以第1个测试样品为例，平行样测试结果对数值的平均值为2.4408，其取值区间在2.3786～2.5030，取其反对数得两次测量平均值的取值区间即本次测量第一个测试样品菌落总数的测试结果为239～318之间。

3 讨论本邑地处淮北平原，农村饮水主要靠手压井水和自吸潜水泵家庭式供水，水井深在6～30m 之间，属地表水，其极易受到污染，其菌落总数一般在100 CFU/mL以上，其检验结果的发散性较大，采用合并样本标准不确定度比较方便，并且适合于每一个样本，随着检验结果的不断增加，可随时加入到合并样本中，重新计算合并样本标准差，更新其不确定度的取值范围。

微生物菌落总数不确定度目前，国际上统一使用的对检测和校准实验室能力的通用要求是ISO/IEC17025：2005，在内容和技术要求方面强化了评定测量不确定度。

中国实验室国家认可委员会(CNAL)充分考虑目前国际上与合格评定相关的各方对测量不确定度的关注，以及测量不确定度对测量、实验结果的可信性、可比性和可接受性的影响，特别是这种影响和关注可能会造成消费者、工业界、政府和市场对合格评定活动提出更高的要求。

因此，认可委员会在认可体系的运行中给予测量不确定度评定以足够的重视，满足了客户、消费者和其他方面的期望和需求。

食品的质量直接关系到消费者的身体健康，食品中微生物的测量是食品质量优劣的重要卫生指标之一，文中介绍了实验室按GB/T4789.12-2010方法对10个牛初乳粉样品菌落总数测试结果的不确定度评定方法。

一、原理与方法1. 测试原理不确定度定义为：表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。

根据CCBLAC/AG05附录规定进行菌落总数测试要求：测试样品是均匀的，每个样品都包含可计算得出数目的微生物;在实验室由不同人员按规定的测试方法进行一段时间测试;每个样品均做平行样，必须由同一测试人员进行操作。

测试完成后得到的测试结果取对数，即可用于菌落总数不确定度的评定。

2. 测试方法依据中华人民共和国国家标准GB/T4789.12-2010进行测试。

以无菌操作，将检样25g 放入含有225ml灭菌生理盐水的无菌均质袋内，经充分振摇后制成1：10的均匀稀释液。

根据食品卫生标准要求或对样本污染情况的估计，选择2～3个稀释度，每个稀释度做两个平皿。

然后将有稀释液的平皿内注入45℃左右营养琼脂约15ml转动混匀，同时做空白对照，待琼脂凝固后，翻转平皿，放置36℃±1℃恒温箱内培养48±2h。

计数后以同稀释度的两个平皿的平均菌落数报告。

二．数学模型由于检测结果发散性大，而样品中细菌分布的均匀性和重复测量带来的不确定度是影响结果准确度的主要原因，而B 类不确定度分量对合成不确定度影响较少。

微生物分析测量不确定度评定一、概述与通常的测量相比较，微生物测量的特点是测量结果相差极大。

与平均值之偏差高达105。

因此用常规的直接根据平均值得到标准偏差的方法显得有些不合理。

通常的做法是取对数以后进行计算。

同样情况可能会出现在增益和衰减的测量不确定度评定中。

由于微生物分析测量结果散发极大，因此仅考虑由散发引起的测量不确定度，其它不确定度来源均可以忽略不计。

二、数学模型测量是直接数微生物菌落总数，所以数学模型为y=x三、单一样品重复测量1 测量结果对同一样品重复测量10次，测量结果列于表一，取10次测量的平均值作为最后测量结果。

2计算过程(1) 列出测量结果x i。

(2) 取对数logx i ，得到对数logx i 的平均值为log 4.72245x = (3) 求残差log log i x x -(i=1，2，…，10)。

(4) 求残差平方和1021(log log ) 3.35169i i x x =-=∑(5) 求平均值的实验标准差1021(log log )3.35169(log )0.193010(101)10(101)ii x x s x =-===--∑。

(6) 求平均值的标准不确定度平均值的标准不确定度等于一倍平均值的实验标准差，所以(log )(log )0.1930u x s x ==(7) 求扩展不确定度如前所述，全部测量过程只有一项不确定度，所以直接由平均值的标准不确定度给出测量结果的扩展不确定度。

取置信概率p=95%，根据自由度n=9，由t 分布表得到包含因子k=2.26。

于是得到扩展不确定度U 95＝k×u(x log )=2.26×0.193=0.4361(8) 取反对数，由logx 坐标换算回x 坐标由于logx 与x 之间的非线性关系，不能直接求扩展确定度U 95的反对数。

因此首先应确定logx 的取值范围为x log =4.7224±0.43614.2864≤x log ≤5.1536再取反对数后，得测量结果x 分布区间为1.9×104≤ x ≤1.4×105(9) 测量结果报告由于测量结果散发极大，不能准确报告测量结果和测量不确定度。

食品微生物学检测中菌落总数测定测量结果的不确定度评定依据JJF1059－1999《测量不确定度评定与表示》、CNAL/AG06《测量不确定度政策实施指南》和CNAL/AR11《测量不确定度政策》分析一、测量方法按照国家标准GB/T4789.2-2003《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》规定的检测程序进行。

检测过程为：1）以无菌操作将检样25g（mL）剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其它稀释液灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做出1：10的均匀稀释液。

固体检样在加入稀释液后，最好置均置器中以8000r/min～10000r/min的速度处理1min，做出1：10的均匀稀释液。

2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做出1：100的稀释液。

3）另取1mL灭菌吸管，按上条操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。

4）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2个～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。

5）稀释液移入培养皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基（可放置于46℃±1℃水浴保温）注入培养皿约15mL，并转动培养皿使混合均匀。

同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液灭菌培养皿内作空白对照。

6）待琼脂凝固后，翻转平板，置36℃±1℃温箱内培养48h±2h。

7）作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

8）选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。

一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。

浅析饮用纯净水微生物检验中菌落总数的不确定度检验发表时间：2019-08-15T09:31:21.717Z 来源：《中国医学人文》(学术版)2019年3月下第6期作者：孙宗祥姜勇波蔡路王蕾于丹[导读] 在本文中，首先介绍了引用纯净水微生物检验中菌落总数实验，然后在实验中应用了不确定度检验，对菌落总数进行检验，实验结果表明，不确定度检验的方法具备的简便性是非常好的，适合微生物检验。

哈尔滨市疾病预防控制中心 150056【摘要】在进行微生物检验时，应用不确定度检验的目前还很少，通过此种检验方法的应用，可以有效的提升微生物检验结果的科学性，增强检验结果的可用性。

在本文中，首先介绍了引用纯净水微生物检验中菌落总数实验，然后在实验中应用了不确定度检验，对菌落总数进行检验，实验结果表明，不确定度检验的方法具备的简便性是非常好的，适合微生物检验。

【关键词】引用纯净水；微生物检验；菌落总数；不确定度检验ABSTRACT：In microbial testing，the application of uncertainty testing is still rare. The application of this method can effectively improve the scientificity of microbial testing results and enhance the usability of testing results. In this paper，the total number of bacteria in the microbial test of purified water is introduced firstly，and then uncertainty test is applied in the experiment to test the total number of bacteria. The experimental results show that the method of uncertainty test is very simple and suitable for microbial test.Key words：citing pure water；microbial testing；total number of colonies；uncertainty testing前言：在进行微生物检验时，不确定度是一个重要的参数，与测量结果具有很大的关联性，被测量值的分散性都是通过不确定度的表征来赋予的，而且赋予具备合理性，通过不确定度的正确测量和评定，提升了测量结果分析的有效性。

食品中菌落总数的测定和不确定度分析食品中菌落总数的测定是一种常见的微生物检验方法，用于评估食品的微生物质量和卫生状况。

本文将介绍食品中菌落总数的测定方法以及不确定度分析。

食品中菌落总数的测定方法有几种，例如平板计数法、液体培养法和膜过滤法等。

平板计数法是最常用的方法之一。

该方法的步骤如下：1.准备培养基：选择适当的培养基，如营养琼脂平板培养基或大肠杆菌培养基。

将培养基加热煮沸，使其溶解均匀，然后倒入培养皿中，待其凝固。

2.取样：将要检测的食品样品称取一定重量，加入无菌生理盐水中，然后进行均质处理。

3.制备稀释液：将均质后的食品样品逐渐按一定比例进行稀释，通常选择1:10、1:100的稀释倍数。

4.接种：取适量的稀释液用无菌吸管滴于培养皿上，静置几分钟使液体完全吸收后倒置培养皿，将其置于恒温培养箱中进行培养。

5.计数：在适当的培养时间后，观察培养皿上的菌落形成情况，并根据菌落的形态和数量进行计数。

通常在30-35°C下培养24-48小时。

菌落总数的测定结果通常以菌落单位（CFU/g或 CFU/mL）表示。

根据样品的稀释倍数和计数结果，可以计算出样品中的菌落总数。

不确定度是测量结果的一个重要指标，用于表示测量结果与"真实值"之间的差异。

对于食品中菌落总数的测定，不确定度分析可以帮助确定测量结果的可靠性，并提供测量的可信度。

不确定度的计算通常包括两个方面：随机不确定度和系统不确定度。

随机不确定度是由于随机误差引起的，可以通过重复测量来评估。

系统不确定度是由于系统误差引起的，可以通过校准和其他适当的控制措施来评估。

在食品中菌落总数的测定中，随机不确定度可以通过进行多次独立实验来进行评估。

根据实验数据的离散程度和统计分析方法，可以计算得到菌落总数的随机不确定度。

系统不确定度可以通过进行校准和质量控制措施来评估。

使用已知浓度的菌液进行校准，或在实验中添加附加的质控样品来进行验证。

废水中菌落总数测量不确定度的评定1．检验方法依据GB/T4789.2-2003《食品卫生微生物学检验》中的方法，测定废水中的菌落总数。

定量吸取废水，需要时用0.85%无菌生理食盐水稀释n 倍。

用无菌的移液管吸取1mL 稀释液置于无菌的培养皿内，再向培养皿中注入约15mL 培养基，转动培养皿使培养基与试样混合均匀，待培养基凝固后，置于36℃±1℃培养温箱内培养48 h 。

每个试样同时做两个平行试验，计数后取其平均值报告菌落总数。

2．结果计算二次平行检测菌落总数检测结果分别计为12A A 和，废水中的菌落总数A 按下式 计算： 12A A A n 2+=⨯ 3．影响因素分析经验表明，样品中菌落总数的检测结果的不确定度主要取决于细菌分布的均匀性，表现为测量的重复性。

虽然在检测中有诸多影响因素，如培养基的组成、稀释倍数、培养温度和时间对测量结果会有一定程度的影响，但只要在规定的条件下培养，上述影响可以忽略不计。

再说，也很难在微生物检测结果和影响因素之间建立确定的函数关系，不能像物理化学测量那样从计量学上进行严密的评估，所以本评定将不讨论上述因素的影响。

4．不确定度的评估通常检测菌落总数时，每个试样仅平行检测两份，取其平均值报告菌落总数。

显然，不能凭两个数据计算标准偏差。

为了利用实验室早先积累的检测数据资源，计算具有较大自由度的重复性标准偏差，TELARC[1]提出了用菌落总数的对数值计算合并样本标准偏差的方法。

倪育才根据TELARC 的实例进行了改写[2]。

在《分析测量不确定度评估指南》[3]的实例中介绍了计算标准化差值标准偏差的方法，计算了数值相差一百多倍的多组观测值的合并样本标准偏差。

本评定参考了该方法，但在计算中用残差代替了差值。

为了与TELARC 的对数值计算法的结果相比较，本报告引用倪育才改写的文章中的原始数据计算标准化残差标准差。

表1列出了15组检测原始数据，以及每组数据的平均值、残差和标准化的残差（残差除以平均值）。

废水菌落总数测定结果不确定度评估1. 实验前准备1.1 设备：恒温培养箱、无菌吸管10ml（具0.1ml刻度）、微量移液器、无菌锥形瓶、无菌培养皿1.2 培养基及试剂：平板计数琼脂、无菌生理盐水1.3 因浓缩苹果清汁中一般菌落不容易生长，故用废水作为样品检测。

2. 检测依据及步骤2.1依据：GB4789.2—2010《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》2.2步骤：定量吸取废水，制备成15份均匀的检测样品，每份样品做两个平行样。

↓↓↓↓3. 不确定度来源分析检测步骤主要包括样品的吸取、稀释（移液器）、培养、计数、及结果修约等，由于结果发散性较大的特点，在本次实验中，我们只对样品吸取、重复测定结果的不确定度进行量化分析。

3.1 样品吸取过程中使用刻度吸管体积的相对标准不确定度u rel （V ） 3.1.1 吸管体积校准引入的标准不确定度u （V ）在吸取样品的过程中均使用经检定合格的10ml 刻度吸管，其允许误差为±0.05ml ，故10ml 吸管体积校准引起的不确定度按矩形分布（k=3）为： u 1（V ）=305.0=0.029ml则样品吸取过程中使用刻度吸管体积的相对标准不确定度： u rel （V ）=()V V u =10029.0=0.0029ml 3.2 重复测定结果的标准不确定度菌落总数测定结果不确定度评定3.2.1 对测定结果X 1、X 2分别取对数，得到lg X 1和lg X 23.2.2 每一个样品的残差(在重复性条件下得出n 个观测结果X k 与n 次独立观测结果的算术平均值X 的差)平方和：()221lg lg ∑=-i iX X式中：i X lg —每一个样品测定结果的对数值；X lg —每一个样品测定结果对数的平均值。

3.2.3 根据《JJF —1999测量不确定度评定》中4.3,计算15个样品的合并标准偏差： ()=X S lg ()()()X u XX n m m j ni i lg lg lg 11112=--∑∑==式中：m —测定样品总个数，本次实验共15个；n —对每个样品的独立测定次数，本次实验每个样品平行测定两次。

菌落总数不确定度菌落总数不确定度评定食品的质量直接关系到消费者的身体健康,食品中微生物的测量是食品质量优劣的重要卫生指标之一，因此对食品中菌落总数进行测量不确定度的评定非常有必要。

目前《GB 4789.2-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》是食品中菌落总数测定的标准方法。

我们对食品样品营养包进行卫生微生物菌落总数检测后进行不确定度的评定。

1.材料与方法 1.1材料1.1.1 样品：婴幼儿辅食营养包。

1.1.2 培养基：平板计数琼脂培养基。

1．1.3 主要仪器设备：立式高压蒸汽灭菌锅、鼓风电热恒温干燥器、电热恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴锅。

1.2.检验方法1.2.1依据《 GB 4789.2-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行测定。

1.2.2检验过程：25g 样品+225mL 稀释液，均质→ 10倍系列稀释→选择2-3个适宜的样品匀液，各取1mL 分别加入无菌培养皿内→ 每皿加入15-20mL 平板计数琼脂培养基，混匀→ 培养→ 计数各平板菌落数→ 计算菌落总数1.2.3 建立数学模型：设菌落总数为A ，试验结果为X ，则A=Xcfu/g ，最佳∑===nii x n X A 111.2.4 不确定度来源及分析，见图1：不确定度的因果关系图2.结果与分析2.1试样在称重时天平带来的不确定度本实验中称取样品25.0g ，0.1g 天平的最大允许误差为±0.1g ，可认为服从均匀分布，则其导致的不确定度：u rel （m ）=0.1／﹙25×3﹚=0.002309 2.2 稀释和取样过程中导致的不确定度本实验中计数的稀释度为2个梯度，因此不确定度主要是由250mL 量筒、10mL 和1mL 刻度吸管的容量允许误差，容器和溶液温度与校准时温度不同引起的。

根据JJG196-1990《常用玻璃量器》检定规程规定，20℃时250mL 量筒的允许误差为±2.0mL ，10mL 刻度吸管的允许误差为±0.05mL ，1mL 刻度吸管的允许误差为±0.008mL ，取均匀分布，由容量允许差引入测定温度培养时间培养温度重复性样品均匀性取样重复性V 样品修约V 稀释培养时间允差时间培养温度允差培养条件样品保存条件温度ΔV 稀释稀释体积温度取样体积取样ΔV 样品温度菌落总数的不确定度：①由250mL量筒引入的不确定度：u rel（V1）=2／（225×3）=0.005132②由10mL刻度吸管引入的不确定度：u rel（V2）=0.05／（9×3）=0.003208③由1mL刻度吸管引入的不确定度：u rel（V3）=0.008／（1×3）=0.0046192.3 样品的均匀性引入的不确定度本实验将样品充分混合后随机取样，可认为样品是均匀的，具代表性，由此所致的不确定度可忽略不计。