转基因小鼠制备实验方法

ai14转基因小鼠原理AI14转基因小鼠是一种常用的转基因模型，被广泛应用于生物医学研究领域。

它的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中，从而使小鼠表达人类或其他物种的特定基因。

通过对AI14转基因小鼠的研究，科学家们可以深入探究与这些特定基因相关的生理和病理过程，为人类疾病的预防和治疗提供重要的基础。

AI14转基因小鼠的制备过程基本分为以下几个步骤：1. 选择目标基因：科学家们首先需要确定他们想要研究的特定基因，这通常是与某种生理过程或疾病相关的基因。

选择目标基因的确定是研究的关键，它直接决定了后续实验的方向和结果。

2. 构建转基因载体：转基因载体是将目标基因导入小鼠基因组的工具。

科学家们通常使用质粒或病毒载体来构建转基因载体，其中包含了目标基因的DNA序列以及一些调控元件，如启动子、终止子和增强子等。

这些调控元件可以确保目标基因在适当的组织和时间点表达。

3. 转基因小鼠的制备：一旦构建好转基因载体，科学家们就可以将其导入小鼠的基因组中。

目前常用的方法是通过胚胎干细胞技术或直接注射载体DNA进入受精卵。

这些转基因载体会在小鼠的细胞中随着细胞分裂被复制，并最终导入小鼠的生殖细胞中。

4. 筛选和鉴定转基因小鼠：为了确定哪些小鼠成功地导入了目标基因，科学家们通常会对小鼠进行筛选和鉴定。

这包括对小鼠的DNA 进行PCR分析、Southern印迹等实验技术，以确定目标基因是否成功导入小鼠的基因组中。

5. 遗传稳定性的维持：一旦获得了目标基因转基因小鼠株系，科学家们需要确保这些转基因小鼠的遗传稳定性。

为此，他们通常会进行多代交配，并对后代进行基因型分析，以确保目标基因的稳定遗传。

通过AI14转基因小鼠模型的研究，科学家们可以深入研究特定基因在生理和病理过程中的作用。

例如，他们可以观察和分析目标基因在小鼠身上的表达模式以及对生理功能的影响，进而揭示该基因的功能机制。

此外，科学家们还可以利用AI14转基因小鼠模型来研究某些疾病的发生机制，寻找潜在的治疗靶点，并评估新药物的疗效。

转基因小鼠制备方法一、引言转基因小鼠是指通过基因工程技术将外源基因导入小鼠基因组中，使其表达或缺乏特定基因，从而研究基因功能、疾病模型等方面的动物模型。

转基因小鼠制备方法是实现转基因小鼠研究的重要步骤之一，本文将详细介绍转基因小鼠制备的一般步骤和常用技术。

二、转基因小鼠制备的一般步骤1. 选择目标基因和载体转基因小鼠制备的第一步是选择目标基因和适当的载体。

目标基因可以是外源基因、特定基因的突变体或基因敲除。

载体通常是带有选择标记（如抗生素抗性基因）和目标基因的质粒。

2. DNA构建在DNA构建过程中，首先需要将目标基因和选择标记基因插入到载体的适当位点上。

这可以通过限制性内切酶切割和连接、PCR扩增等方法实现。

构建完成后，需要进行酶切鉴定和测序确认。

3. 体外培养胚胎干细胞（ES细胞）转基因小鼠制备中常用的方法是利用ES细胞技术。

首先，从小鼠胚胎中获得内源性干细胞（ES细胞），并进行体外培养。

然后，将构建好的转基因载体导入ES细胞中，通过抗生素筛选获得带有目标基因的转基因ES细胞克隆。

4. 转基因小鼠制备转基因ES细胞的制备完成后，可以进行转基因小鼠的制备。

这一步骤通常有两种方法：内源性重组和外源性重组。

内源性重组是将转基因ES细胞注射到小鼠早期胚胎中，使其整合到小鼠的生殖细胞中，从而获得转基因小鼠。

外源性重组是将转基因ES细胞直接注射到小鼠的细胞团中，形成转基因胚胎，再将转基因胚胎移植到雌性小鼠子宫中，使其发育成为转基因小鼠。

5. 转基因小鼠鉴定转基因小鼠制备完成后，需要对其进行鉴定。

通常采用PCR、Southern blotting、Western blotting等分子生物学方法，检测转基因小鼠是否成功表达目标基因。

三、常用技术1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，可以实现高效、精确地对基因组进行编辑。

通过CRISPR/Cas9技术，可以直接在小鼠胚胎中进行基因编辑，从而制备转基因小鼠。

ELISA检测小鼠Cre实验报告本研究采用原核显微注射方法制备受Cre重组酶调控表达的、非免疫耐受的卵清蛋白-HBsAg转基因小鼠，以期为乙肝防治提供更好的动物模型。

试剂及仪器携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL-Anton由中科院生物物理所王盛典教授惠赠。

在目的基因OVA-HBsAg上游加入CMv增强子及鸡β -actin启动子，并加入两个同向的LoxP位点，以实现后续Cre酶对其表达的调控(图1A)。

目的基因构建成功后，连接入pCCALL2表达质粒(图1B)。

KSOM小鼠胚胎培养基购自Millipore发育良好的CS7BL/6J×DBA母鼠，腹腔注射PMSG10U，48h 后注射HCG 10U促排卵，与CS7BL/6J公鼠按1：1合笼，次日清晨检阴栓阳性有文八体鼠。

取受精卵置于KSOM培养基于37℃培养sh，在显微注射仪上将经内切酶Apa Ⅰ作用线性化的pCCALL-Anton注射入受精卵雄性原核内。

取注射后存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的输卵管内，待其怀孕产仔后，进行检测。

转基因小鼠的鉴定剪取约1cm长鼠尾下游引物： 5'-GATACATAGAGGTTCCTTGAGCAGT-3'。

反应条件： 94℃Smin； 94℃ 30s、s2℃ 30s、72℃40s，35个循环；72℃ 5min。

扩增片段318bp。

1.2.3OVA-HBsA转基因小鼠的繁育、传代扩群为尽快扩群,并使子代小鼠背景趋于一以,OvA-HBsAg转基因小鼠首建鼠建成后，与CS7BL/6J小鼠杂交进行传代、培育。

对所得子代小鼠进行PCR 鉴定，并用ELISA法检测HBsAg表达[检测波长450nm，参比波长630nm，吸光度(A)值>0.10s为阳性]。

PCR条件如1.2.2所述。

对PCR阳性鼠，于眼眶后静脉丛采血300u，37℃放置2h后，3000r/min离心10min,取上清，采用ELISA方法检测HBsAg表达。

《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，转基因动物模型在生物学、医学等领域的应用越来越广泛。

血管内皮生长因子（VEGF）是一种重要的生长因子，对血管生成具有促进作用。

VEGF164是VEGF家族中的一种亚型，具有较高的生物活性。

本文旨在介绍利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠的方法，并对其检测进行详细阐述，以期为相关研究提供参考。

二、材料与方法1. 材料（1）实验动物：选用C57BL/6J小鼠作为转基因实验动物。

（2）质粒：含有VEGF164基因的质粒。

（3）显微操作设备：显微操作仪、显微注射针、显微操作台等。

2. 方法（1）构建转基因载体：将VEGF164基因克隆到适当载体上，构建转基因载体。

（2）显微注射：将构建好的转基因载体显微注射到小鼠受精卵的原核中。

（3）筛选阳性小鼠：通过PCR等方法筛选出阳性小鼠。

（4）繁殖与鉴定：将阳性小鼠进行繁殖，并对后代进行基因型鉴定和表达检测。

三、原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠1. 转基因载体的构建首先，将VEGF164基因克隆到适当的载体上，构建转基因载体。

这一步骤需要使用分子生物学技术，如PCR、酶切、连接等。

2. 显微注射将构建好的转基因载体显微注射到小鼠受精卵的原核中。

这一步骤需要在显微操作仪的辅助下进行，注射针需要精确地定位到受精卵的原核中，将转基因载体注入其中。

3. 筛选阳性小鼠通过PCR等方法筛选出阳性小鼠。

这一步骤需要对注射后的小鼠进行基因组DNA提取，然后进行PCR扩增和检测，以确定是否成功地将VEGF164基因整合到小鼠基因组中。

四、VEGF164转基因小鼠的检测1. 基因型鉴定对繁殖出的后代进行基因型鉴定，确定其是否为转基因阳性小鼠。

这一步骤同样需要进行PCR扩增和检测。

2. 表达检测对转基因阳性小鼠进行表达检测，以确定VEGF164基因在小鼠体内的表达情况。

转基因小鼠制备实验方法1.计划设计：首先确定研究目的和研究对象基因的功能。

根据目的，选择适合的转基因策略。

2.构建转基因载体：根据研究对象基因的序列，设计合成含目标基因的转基因载体。

一般可选择质粒、病毒载体或者合成RNA/DNA方式构建转基因载体。

3.构建胚胎干细胞（ES）或受精卵DNA库：通过开展反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方式，从小鼠胚胎组织中制备出RNA，然后利用逆转录酶将RNA转化成cDNA；之后，利用特定引物扩增目标基因的cDNA片段，将其克隆到适当的表达载体中，最终构建ES细胞库或者受精卵DNA库。

4.转染、筛选和克隆：将所构建的转基因载体导入到ES细胞或者受精卵中，使其整合到其基因组中。

然后，采用药物筛选、DNA分子标记、PCR和Southern blot等方法对转染后的细胞进行筛选和鉴定，获得含有目标基因的ES细胞克隆或者转基因小鼠胚胎。

5.基因敲除或添加：6.培养和培育：将获得的转基因ES细胞或者受精卵注入到养殖母鼠子宫中进行妊娠，然后等待幼鼠出生。

根据需要，可将转基因小鼠进行进一步培养、繁殖和鉴定。

为了进行转基因小鼠的后代繁殖，需要对转基因小鼠进行基因型鉴定和表型分析。

7.基因鉴定和表型分析：通过PCR、Southern blot、Western blot、RT-PCR或者其他的基因鉴定技术，对转基因小鼠的基因型进行鉴定。

同时，可以通过行为学、生理学和病理学等方法对转基因小鼠进行表型分析。

8.数据分析与结果解读：对表型数据进行统计分析，绘制图表或者进行统计学分析。

根据实验设计和方法，对实验结果进行解读，并得出相关结论。

总结起来，转基因小鼠制备是一个复杂而严谨的实验过程。

通过设计转基因载体、构建DNA库、转染和克隆、培养和培育小鼠以及基因鉴定和表型分析，可以成功制备目标基因转基因小鼠，并用于研究其功能、调控机制以及在疾病中的作用。

第1篇一、实验背景随着生物技术的飞速发展，转基因技术在医学、农业等领域发挥着越来越重要的作用。

小鼠作为生物医学研究中常用的实验动物，其基因编辑技术的应用为疾病模型构建、药物筛选和基因功能研究提供了有力工具。

本实验旨在通过基因编辑技术构建转基因小鼠模型，研究特定基因在小鼠体内的表达和功能。

二、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，8周龄。

2. 基因构建材料：目的基因（GFP基因）、启动子（CMV启动子）、荧光素酶报告基因（Luc基因）、pEGFP-C1质粒载体、pGL3-Basic质粒载体。

3. 实验试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR引物、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、细胞培养试剂等。

4. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪、细胞培养箱、显微镜等。

三、实验方法1. 目的基因构建：将GFP基因和Luc基因分别插入到pEGFP-C1和pGL3-Basic质粒载体中，构建重组质粒。

2. 重组质粒转染：将构建好的重组质粒通过脂质体转染法转染C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ES细胞）。

3. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。

4. 胚胎细胞传代培养：将阳性细胞克隆进行传代培养，筛选出稳定表达的细胞系。

5. 胚胎细胞冻存：将稳定表达的细胞系进行冻存，以备后续实验使用。

6. 胚胎移植：将冻存后的胚胎细胞进行移植，获得转基因小鼠。

7. 转基因小鼠表型鉴定：通过GFP荧光显微镜观察转基因小鼠体内GFP表达情况，并通过实时荧光定量PCR检测GFP基因在转基因小鼠体内的表达水平。

四、实验结果1. 重组质粒构建：成功构建了含有GFP基因和Luc基因的重组质粒。

2. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。

3. 胚胎细胞传代培养：成功传代培养出稳定表达的细胞系。

4. 胚胎移植：成功获得转基因小鼠。

人源化小鼠构建方法及应用人源化小鼠是指将人类基因或组织移植或置入小鼠中，使其具有人类的某些特性或功能。

目前，人源化小鼠主要包括两种方法：转基因小鼠和异种移植小鼠。

这些方法在医学研究中具有广泛的应用，如研究人类疾病机制、药物筛选、组织移植等方面。

转基因小鼠是通过将人类基因导入小鼠的遗传背景中，使小鼠体内表达人类基因。

这可以通过不同的方法实现，比如使用逆转录酶来制备转基因载体，然后将其导入小鼠胚胎干细胞中，使其成为转基因小鼠的一部分。

此外，还可以使用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，直接对小鼠基因组进行编辑，以达到引入人类基因的目的。

通过转基因技术，可以研究人类基因在小鼠中的表达、功能以及相关疾病的发生机制。

例如，科学家可以通过将人类脑部相关基因导入小鼠中，研究神经发育、认知功能等方面的问题。

异种移植小鼠是将人类组织或细胞移植到小鼠体内，使其具有人类组织的特性。

这可以通过将人类的干细胞或器官移植到小鼠体内，再使其发育成熟。

例如，通过将人类胰岛细胞移植到小鼠体内，可以研究胰岛素的产生及调节机制，这对于糖尿病治疗具有重要意义。

此外，还可以将人类癌细胞移植到小鼠体内，用于研究肿瘤发生、生长机制以及药物疗效的评估。

人源化小鼠在医学研究中具有广泛的应用。

首先，在研究人类疾病机制方面，通过引入人类基因或组织，可以更好地模拟人类体内的生理和病理过程。

例如，通过转基因技术引入与阿尔茨海默病相关的人类基因，可以模拟该疾病发生的机制，从而更好地研究该病的预防和治疗。

其次，在药物筛选方面，人源化小鼠可以用于评估新药的疗效和毒副作用。

通过将人类基因或细胞引入小鼠体内，可以更准确地评估药物在人类中的药效和安全性。

此外，人源化小鼠还可以用于研究器官移植和再生医学。

通过将人类干细胞移植到小鼠体内，可以研究干细胞的分化和发育过程，从而为再生医学的研究和临床应用提供基础。

然而，人源化小鼠也存在一些问题和限制。

首先，转基因小鼠与人类的差异可能会导致研究结果的偏差。

制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中。

具体步骤如下：
1. 选择目标基因：根据研究需求选择要导入小鼠基因组的外源基因。

这个外源基因可以来自其他物种，也可以是已存在于小鼠中但表达量较低的基因。

2. 构建质粒：将选择的目标基因与载体DNA（如质粒）连接。

质粒通常含有特定的启动子、终止子和选择性标记基因（如抗生素抗性基因），以便检测和筛选成功导入外源基因的小鼠。

3. 体外培养：将构建好的质粒导入细胞培养物中，利用细胞的自身复制和修复机制，使质粒与小鼠细胞的染色体发生重组，将外源基因导入到小鼠的基因组内。

4. 选择性筛选：为了筛选成功导入外源基因的细胞，可以添加抗生素等选择性标记物质，只有带有外源基因的细胞能够存活下来。

5. 胚胎干细胞注射：将筛选出的带有外源基因的细胞注射到小鼠的早期胚胎中。

这些细胞会参与胚胎发育，在小鼠的成体组织中形成细胞系，继续表达外源基因。

6. 交配和繁殖：将带有外源基因的小鼠进行交配和繁殖，使外源基因在小鼠种群中得以传递和稳定遗传。

通过以上步骤，外源基因成功导入小鼠基因组，并表达在小鼠的细胞和组织中，从而达到制备转基因小鼠的目的。

一种过表达nlrp3的转基因小鼠模型及其构建方法和
应用
一种过表达Nlrp3的转基因小鼠模型及其构建方法和应用，涉及基因工程技术、动物模型构建及应用，特别涉及一种过表达Nlrp3的转基因小鼠模型及其构建方法和应用。

转基因小鼠模型构建方法，包括以下步骤：
1. 设计并合成包含目的基因Nlrp3的DNA序列的质粒载体；
2. 将合成的质粒载体注射到小鼠受精卵中；
3. 将注射了质粒载体的受精卵移植到代孕母鼠体内；
4. 代孕母鼠产下幼崽后，提取幼崽的基因组DNA进行PCR检测，筛选出
转基因小鼠。

通过上述方法，可以成功构建出过表达Nlrp3的转基因小鼠模型。

该模型可以用于研究Nlrp3基因在疾病发生和发展中的作用，为疾病治疗和药物研发提供有价值的实验动物模型。

同时，该模型还可以用于评估和筛选针对
Nlrp3基因的治疗方法和药物。

以上内容仅作参考，您可以通过相关资料进一步了解有关该技术的详细信息。

使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。

利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。

只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。

特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。

随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。

使用CRISPR-Cas9创建转基因小鼠的方案动物学研究。

2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。

图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。

通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。

（改编自Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。

2014 年 8 月；9(8):1956-68.）Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和CRISPR/cas9。

默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX™名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。

浏览所有的基因组编辑产品浏览所有经小鼠胚胎验证的试剂小鼠胚胎和ES细胞培养基小鼠ES细胞培养基实验方案和过程成功的小鼠模型项目的提示1.了解实验目的并开展研究。

生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。

例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。

小鼠转基因技术流程ES细胞打靶在小鼠ES细胞中，利用同源重组原理（也就是核苷酸序列在两个相似或相同的DNA 分子之间交换的基因重组），获得带有研究者预先设计的遗传修饰的中靶ES细胞。

经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传，最终获得基因修饰小鼠模型。

发展至今，仍是最为经典、可靠的小鼠基因修饰或编辑技术。

目前南模生物可提供3种遗传背景的小鼠ES细胞：C57BL/6，129/S6，B6;129。

可用于获得以下类型小鼠模型：•基因敲除•条件性基因敲除•KO first•基因敲入•点突变•条件性点突变•定点基因过表达•人源化南模生物会对每个项目进行分析与评估，综合时间与风险因素从而选用最合适的技术（ES 细胞打靶或CRISPR基因编辑）。

联系我们，与南模生物的技术顾问讨论如何应用ES细胞打靶技术获得您的动物模型吧！利用ES细胞打靶技术获得小鼠模型的一般流程1.设计并构建同源重组载体2.将同源重组载体转入小鼠ES细胞中3.筛选并验证中靶的阳性ES细胞克隆4.将阳性ES细胞注射到小鼠囊胚腔中5.将注射后的小鼠囊胚移植到假孕母鼠子宫内6.获得并筛选验证阳性嵌合体小鼠F07.阳性F0通过与野生型小鼠或FLP小鼠交配获得F1代杂合子小鼠CRISPR基因编辑CRISPR / Cas9核酸酶系统需要两个组分：用于切割靶序列的Cas酶和与20个碱基对（bp）的靶序列结合指导RNA（sgRNA）。

利用靶点特异性的sgRNA 指导 Cas9 核酸酶在基因组上的特定靶点进行DNA双链剪切。

通过非同源末端连接（NHEJ）可导致移码突变，实现基因敲除（KO）；通过同源重组修复（HR）可将外源片段整合到基因组指定位点（KI）。

CRISPR基因编辑技术的优势•与传统的基因打靶方法相比，大大缩短了研发周期。

•打破对小鼠遗传品系的限制，实现不同遗传背景或在已有基因修饰小鼠模型基础上的基因编辑。

转基因小鼠制备过程嘿，朋友们！今天咱就来讲讲转基因小鼠制备过程这档子事儿。

你想想啊，这制备转基因小鼠就好比是搭积木，得一块一块精心摆弄。

首先呢，得有个合适的基因，就像搭积木得有各种形状的积木块儿一样。

这基因可是关键，得选好了，不然搭出来的“小鼠大厦”可就歪了。

然后呢，把选好的基因通过一些技术手段，比如说显微注射啥的，给弄到小鼠的受精卵里去。

这就好比是把一块特殊的积木塞到了搭积木的基础里。

这可不是个简单活儿，得小心翼翼的，不能把受精卵给弄坏了呀。

接着，把这些经过处理的受精卵放回母鼠的肚子里。

哎呀呀，这母鼠就像是个“大房子”，让这些受精卵在里面好好发育成长。

等一段时间后，小老鼠就出生啦！不过这时候还不能确定是不是转基因小鼠成功了呢，还得经过一番检测才行。

这就像是搭好了积木，得看看是不是牢固，形状对不对。

如果检测发现真的是转基因小鼠，那可就太棒啦！就好像好不容易搭成了一个超级漂亮的积木造型一样，那成就感满满的！要是没成功，也别灰心，咱再来一次呗。

你说这转基因小鼠的制备是不是很神奇？就像变魔术一样，能把一个普通的小鼠变得与众不同。

而且这过程中，每一步都得仔细认真，稍微有点差错可能就前功尽弃啦。

咱再想想，要是没有这些转基因小鼠，那好多科学研究可就没法进行啦。

它们就像是科学界的小英雄，为我们探索未知的世界贡献力量呢！所以啊，这转基因小鼠制备过程虽然有点复杂，但真的超级重要的呢！咱普通人可能觉得这事儿离我们挺远的，但其实它和我们的生活息息相关呢。

说不定哪天，因为转基因小鼠的研究，就有了能治好某种疑难杂症的药呢。

总之，转基因小鼠制备过程是个既有趣又有意义的事儿，虽然有点难度，但科学家们可厉害啦，他们总能把这件事儿做好，让我们对未来充满期待！你说是不是呀？原创不易，请尊重原创，谢谢!。

转基因小鼠原理
转基因小鼠是通过将外源基因导入小鼠的基因组中，使其具备某种特定的基因表达或功能。

下面将介绍转基因小鼠的原理。

转基因小鼠的制备主要包括以下步骤：
1. 外源基因的选择：根据研究的需要，选择具有特定表达或功能的外源基因。

这些基因可以来自于同一物种的其他个体，也可以来自于不同物种。

外源基因通常与标记基因（如荧光蛋白）连在一起，以便在小鼠体内进行检测或追踪。

2. 载体构建：将外源基因插入到合适的载体中。

这个载体通常是一个环状DNA，能够在细菌中进行复制。

载体还包括选择
性标记基因，用于筛选带有外源基因的细菌。

3. 载体的导入：将构建好的载体导入到干细胞中。

这一步通常通过细菌转化或化学方法实现。

被导入的载体被融合到小鼠的染色体中，成为其基因组的一部分。

4. 选代与筛选：经过导入外源基因的干细胞进一步进行培养和筛选，确保外源基因被稳定地遗传给后代。

5. 建立转基因小鼠系：通过转基因小鼠的选择性繁殖，建立稳定的转基因小鼠系。

这些小鼠在其体细胞中都带有外源基因。

通过以上步骤，转基因小鼠就能够被制备出来。

这些小鼠可以被用于研究基因与某种生理或疾病相关的功能和表达。

转基因
小鼠的制备对于科学研究、药物开发和疾病治疗等领域具有重要意义。

转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。

2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。

3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。

受体笼拿出作好隔离措施。

4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。

显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。

5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。

6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。

7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。

DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。

8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。

将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。

9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。

手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。

吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。

除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。

将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。

Vill转基因小鼠的制备的开题报告题目： Vill转基因小鼠的制备及其在胰岛素抵抗性与糖尿病发病机制中的应用研究摘要：胰岛素抵抗性是糖尿病发病的关键环节，建立动物模型对于研究其发病机制和寻求治疗方案具有重要意义。

Vill转基因小鼠是一种本质上过表达小肠进食激素瘦素受体（LEPR），具有高胰岛素水平、胰岛素抵抗性和脂代谢紊乱等特征，与人类糖尿病发病机制具有高度相似性。

本研究将建立Vill转基因小鼠模型，研究其在胰岛素抵抗性和糖尿病发病机制中的应用。

一、研究背景糖尿病是一种常见的代谢性疾病，其主要病理特征是胰岛素分泌和利用双重缺陷，导致血糖升高和组织受损。

糖尿病的发病机制十分复杂，包括多种遗传和环境因素的相互作用。

胰岛素抵抗性是糖尿病发病的重要路径，在病理生理学和药理学领域得到广泛的研究。

动物模型是研究疾病发生和发展机制的基础，Vill转基因小鼠模型作为一种新兴的胰岛素抵抗性小鼠模型，已证明能够模拟糖尿病的一些病理特征，具有较高的研究价值。

但是目前对于其在糖尿病发病机制中的应用和相关机制的研究还相对较少，因此本研究将致力于建立Vill转基因小鼠模型，并在胰岛素抵抗性和糖尿病发病机制中开展深入的应用研究。

二、研究内容和方法1. 建立Vill转基因小鼠模型选用C57BL/6J小鼠，构建Vill-CreER/CAG-flox/flox-LEPR转基因体系，利用高通量测序筛选转基因细胞系，并进行体内胚胎注射、外显子杂交筛选、IVF、养殖等操作，建立Vill转基因小鼠模型。

通过PCR、Western blot等方法进行诊断。

2. 分析转基因小鼠的生理和代谢特征按年龄和性别分组，对转基因和野生型小鼠进行体质量、组织/器官大小、血液多项生化指标、胰岛素水平、组织病理及免疫组化等检测，分析转基因小鼠胰岛素抵抗性和糖代谢紊乱等生理和代谢特征。

3. 研究Vill转基因小鼠的糖尿病发病机制通过体内和体外实验方法，包括葡萄糖耐受试验、胰岛素敏感性实验、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、关联分析、基因敲除/过表达等技术手段，研究Vill转基因小鼠在胰岛素抵抗性和糖尿病发病机制中的应用和相关机制。

转基因小鼠的制备显微注射法这一方法的实验程序如下：⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。

处理后与可育雄鼠交配。

次日从输卵管收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管，使胚胎在养母体发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。

也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠脏提取rna，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。

表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫测定（ria）等。

亦可取胚胎进行分析。

显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。

我国已有少数实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白tgm研究。

基因打靶与基因剔除技术ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的胚团（inner cell mass）中分离出来的。

它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。

这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。

因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。

正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。