40kd蛋白转膜条件

仪器及试剂电转槽，电泳仪，0.45um（适用于20KD以上蛋白）及0.22um（适用于20KD 以下蛋白）孔径的PVDF膜，切成略大于凝胶大小，两张Whatman 3MM 滤纸，切成与凝胶大小，甲醇（100%），DD水试剂配制CAPS电印迹缓冲液（母液）10×CAPS（100mmol/L）CAPS 22.13g加去离子水至900ml用2mol/L NaOH （约20ml）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4ºC。

CAPS电印迹缓冲液（工作液，含10％甲醇的1×CAPS，临用前混合）10×CAPS 200ml甲醇200ml去离子水1600ml染色液0.1％考马斯亮蓝G-25040％甲醇/1％乙酸脱色液50%甲醇1 . 转膜操作1.1 制备足够的转移缓冲液以充满电转槽，一次大概1L就行。

1.2 从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶。

1.3 将凝胶侵入电转缓冲液30min。

1.4 滤纸在电转缓冲液中浸泡1 min。

1.5 准备膜，在甲醇中浸泡15s，膜均匀地由不透明变成透明，然后将膜放于DD水中5min，再小心将放于转移缓冲液中平衡10min。

2. 组装转移叠层2.1 打开转移夹子，黑孔板朝下，放一块泡沫（纤维）垫子，泡沫垫子用缓冲液泡一下。

2.2 在泡沫垫上放一张滤纸。

2.3 将凝胶放在滤纸上。

2.4 将膜放在凝胶上。

（如果有气泡，可以用玻璃棒轻轻赶一下。

）2.5 在叠层上再放一层滤纸。

2.6 在滤纸上再放一块泡沫垫子。

2.7 合上转移夹子。

此操作最好放在转移缓冲液中进行3. 蛋白质转移3.1 将转移夹放入转移槽中，黑孔板面对准支撑板的负极（黑色），白孔板对准支撑板的正极（红色）。

3.2 在转移槽中加入适量缓冲液，确保将转移槽全部浸没。

3.3 将黑色阴极引线插入转移装置的阴极插孔，红色阳极插入阳极插孔。

3.4 连接阳极和阴极引线对应的电源输出端。

3.5 装置冷却单元，确保电转在低温下进行。

western 转膜条件蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KDWB用膜类型、孔径：0.45 NC转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 minPS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。

蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KDWB用膜类型、孔径：0.45 PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V转膜时间：60~70 min设备名字是“ Bio-Rad mini ”。

蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KDWB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“ Bio-Rad mini ” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。

蛋白来源：293T 细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KDWB用膜类型、孔径：PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V ，控制电流不要超过300 mA。

转膜时间：70 min蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转Bio-Rad说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

[1]各位朋友：请教关于SDS—PAGE的问题。

我的配胶体系如下:15%分离胶4%浓缩胶水2.3ml2.7ml30％丙烯酰胺5。

0ml 0。

67mlTris—HCL PH8。

8 2。

5ml PH6.8 0.5ml10％SDS 0.1ml 0。

04ml10％APS 0。

1ml 0.04ml TEMED 0。

004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是11kd,浓缩胶60V,40min，分离胶90V，70min.跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因?我的试剂都是新配置的。

谢谢！！！答：【1】胶的配制方法；配制不同体积15%胶SDS—PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15％胶（毫升）： 5 －－10 －－15－－20－－30－－50 蒸馏水: 0。

5 －－ 1.0－－ 1.5 －－ 2.0 －－3。

0 －－5.0 30％Acr-Bis(29:1）: 2。

5 －－5。

0 －－7.5 －－10。

0 －－15。

0－－25.0 1M Tris, pH8。

8: 1.9－－3。

8 －－5.7－－7.6－－11。

4 －－19。

0 10%SDS ：0。

05－－0.1－－0。

15 －－0.2－－0。

3－－0.5 10％过硫酸铵：0.05 －－0.1 －－0.15－－0。

2 －－0.3 －－0.5 TEMED：0。

002－－0.004 －－0。

006 －－0。

008 －－0.012 －－0.02 配制不同体积4%胶SDS—PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升) 4%浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水： 3.16ml40％Acr/Bic（37。

5：1）: 0。

5ml0。

5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）：1.26ml10％SDS ：50 微升μ微升μ10％AP(过硫酸胺）：25 TEMED ：5 微升μ加TEMED后，立即混匀即可灌胶.【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比较重要.如果玻璃板洗不干净,很容易造成楼主所说的现象。

20kd以下的标准蛋白
没有一个标准的界限,大家来界定小分子蛋白的时候,主要都是考虑到要对蛋白做什么分析,例如如果做WB实验,要转膜,如果蛋白分子量小于20kDa,则需要使用小孔径的转印膜,防止蛋白穿膜,而如果是电泳,小于15kDa的蛋白需要用tris-tricine的胶进行分离,在染色之前可能还需要用甲醛固定后才能成功染色。

所以看你界定小分子的目标是什么,基本上小于15kDa的蛋白,很多操作都还是需要小心的。

如果蛋白分子量接近或超过100kDa,就会被认为是大分子蛋白.。

转膜(Trarsmembran)1 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法.常用的电泳转移方法有湿转和半干转。

两者的原理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同.前者操作容易，转移效率高;而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少.2 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。

应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。

用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜（NC) 和PVDF膜。

NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。

根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。

因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。

通常用0.45 μm和0。

2 μm两种规格的NC膜。

大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0。

2 μm的膜了,如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。

PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。

但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。

最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素(Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。

尼龙膜和NC膜的特点相似，主要用于核酸杂交。

硝酸纤维素(nitrocellulose, NC）膜:NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化,对蛋白质的活性影响小;非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便.但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。

15%的胶大分子蛋白无法转膜
如果15%的胶大分子蛋白无法转膜，这可能是因为转膜条件不适当或者转膜设备有问题。

为了解决这个问题，可以尝试以下方法：
1. 优化转膜条件：对于大分子量蛋白质，其转膜条件可能比小分子蛋白质更为严格。

因此，可以尝试调整转膜缓冲液的成分、pH值、温度等参数，以优化转膜条件。

2. 更换转膜设备：如果转膜设备有问题，例如半干式转膜仪的电极有问题或者湿式转膜仪的湿化系统有问题，都可能导致大分子蛋白无法转膜。

因此，可以尝试更换转膜设备。

3. 添加助剂：在转膜缓冲液中添加一些助剂，例如不超过0.1%的SDS，可以有效阻止大分子蛋白在凝胶中沉淀，从而促进转膜。

4. 预处理蛋白质样品：在进行电泳前，可以使用一些方法对蛋白质样品进行预处理，例如通过加热、加入变性剂等方法使蛋白质变性，从而降低大分子蛋白的聚合度和复杂性，提高其转膜效率。

5. 降低凝胶浓度：如果凝胶浓度过高，可能会导致大分子蛋白在凝胶中沉降，从而影响转膜效果。

因此，可以尝试降低凝胶浓度，以改善大分子蛋白的转膜效果。

以上方法可以有助于解决大分子蛋白无法转膜的问题。

如果问题仍然存在，建议咨询专业人士或相关领域的专家以获取更详细的建议和帮助。

蛋白转膜条件蛋白转膜（protein transmembrane）是指膜蛋白从胞浆一侧跨越细胞膜至胞外一侧的过程。

蛋白转膜在细胞中起着至关重要的作用，它参与了细胞内外信号传导、物质转运等多种生物功能。

在研究蛋白转膜过程中，选择合适的条件对蛋白进行转膜操作是至关重要的。

本文将介绍蛋白转膜的条件选择，并以蛋白转膜的经典方法电穿孔和lipofection为例，详细讨论其条件及操作步骤。

蛋白转膜的条件选择是根据所研究蛋白的性质以及转膜方法的原理来确定的。

一般来说，选择合适的转膜条件需要考虑蛋白的分子量、结构特点、理化性质等因素。

另外，对于不同的转膜方法，也需要考虑一些特殊的条件，比如电穿孔需要具备一定的电压、脉冲长度和频率，而lipofection则需要考虑转染试剂（lipofectamine等）的浓度和配比等。

对于蛋白结构较为复杂的情况，传统的电穿孔方法通常难以实现高效的转膜效果，可以考虑使用新一代的磁穿接法（magnetoporation）或微流控技术等方法来实现转膜。

对于高分子量的蛋白，由于其分子尺寸较大，传统的转膜方法效果有限，可以尝试使用特殊的电极和膜片材料，如静电纺丝法、脂质管道法等。

此外，对于具有较高的疏水性的蛋白，传统的lipofection方法往往效果不佳，可以尝试使用膜蛋白融合剂（membrane fusion）法或化学修饰法等。

以经典的电穿孔法为例，蛋白转膜的基本步骤如下：1. 准备电穿孔实验所需材料，包括电穿孔仪、电穿孔膜片、胞外液和胞内液等。

2. 将待转膜的蛋白加入胞内液中，使其达到适当的浓度。

3. 将胞内液注入电穿孔膜片内，确保液体充满整个膜片。

4. 连接电穿孔仪，调整电穿孔参数，如电压、脉冲长度和频率等，以及膜片和电极之间的距离。

5. 将电穿孔膜片放置于仪器中央，开始电穿孔过程。

6. 调整胞外液流速，保持恒定，以保证蛋白转膜的稳定性。

7. 在一定的时间范围内，观察蛋白转膜的效果，可以使用蛋白定量方法，如Western blot等，来检测蛋白的转膜效率。

western转膜条件蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KDWB用膜类型、孔径：0.45 NC转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA转膜时间：60~90 minPS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。

蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT蛋白分子量：65 KD & 56 KDWB用膜类型、孔径：0.45 PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V转膜时间：60~70 min设备名字是“Bio-Rad min i”。

蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KDWB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V转膜时间：30-40 min设备：“Bio-Rad mini”建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。

蛋白来源：293T细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KDWB用膜类型、孔径：PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V，控制电流不要超过300 mA。

转膜时间：70 min蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转Bio-Rad说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

蛋白来源：成纤维细胞蛋白名称（可保密）：smad3蛋白分子量：54 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转Bio-Rad蛋白来源：胰腺癌细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：16 KDa and 42 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：120 V 恒压转膜时间：90 min转膜设备：湿转Bio-Rad蛋白来源：大鼠血管平滑肌细胞蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：72 KD，42 KD 和22 KDWB用膜类型、孔径：一般的PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流一张膜0.26 A，两张膜0.3 A。

WesternBlot实验经验分享，你都知道吗？Western blot真的是让人头疼的实验，辛苦付出和完美结果不成正比的实验，是整个研究生阶段最磨练我个人忍耐力的实验，要掌握整体操作并不难，但是需要注意的细节却很多，而且，三分靠努力，七分靠运气，当你把能做的都做了的时候，能修改的条件都修改了，结果仍然是空白条带，what can I do for you?今天，小编给大家简单整理一下，自己在跑小分子蛋白和大分子蛋白时，摸索出来的经验和条件，欢迎大家积极讨论分享。

一、小分子蛋白小编当时在跑S100A4，分子量12kDa。

首先，要注意的一点就是，小分子蛋白很容易在提取的过程中降解，所以整个操作过程一定要保证在冰上低温快速充分的研磨提取，具体的裂解组织的步骤我就不说了，不过说到组织，小编想提一句，组织提蛋白有一点需要注意，就是这个蛋白在组织中的表达丰度、以及蛋白定位。

胞浆或者核内的蛋白提取方式会有不同，细胞核内的蛋白可能需要特殊的裂解液，一是通过阅读文献，清楚相同的蛋白和组织，别人的跑出来的情况如何；二是可以通过在The Human Protein Atlas网站（不懂看这个（工具篇）S5E50：航母级神器——蛋白组学结果大收录！）上查询。

1、电泳条件：a) 小分子的蛋白电泳建议选择15%分离胶，5%浓缩胶。

正常配胶时，一个迷你垂直电泳仪的配制，5ml分离胶，2ml浓缩胶，跑正常分子量的蛋白是没有问题的。

但是跑小分子蛋白，浓缩胶的长度要再长一些，最起码要保证三分之一浓缩胶，三分之二的分离胶，浓缩胶多，可以保证不同分子量的蛋白充分压缩到同一起跑线。

b) 电泳时间：浓缩胶80V，300mA 50min,分离胶120V，300mA1h10min，分离胶时间不建议太长，只要把marker跑开，能够区分开内参和小分子蛋白就好了。

我的习惯是电泳的全程也会把机器放到冰水混合物中，防止温度过高，蛋白弥散。

c) 蛋白上样量：正常分子量蛋白30ug足够，可以建议小分子量蛋白先用二倍的量60ug试一下看看。