10kd蛋白转膜条件

western 转膜条件蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KDWB用膜类型、孔径：0.45 NC转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 minPS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。

蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KDWB用膜类型、孔径：0.45 PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V转膜时间：60~70 min设备名字是“ Bio-Rad mini ”。

蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KDWB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“ Bio-Rad mini ” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。

蛋白来源：293T 细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KDWB用膜类型、孔径：PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V ，控制电流不要超过300 mA。

转膜时间：70 min蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转Bio-Rad说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

Western Blot详解Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

WesternBlot实验方法及注意事项实验原理：WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。

如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。

实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris・Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。

0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。

小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。

2）4×Tris・Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。

用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

3）4×Tris・Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。

Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。

②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。

③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。

④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。

注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。

2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。

3.每种样品都最好留有副管，备用。

二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。

②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。

注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。

三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。

③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。

④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。

⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。

献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE 电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操作步骤详解（上）》。

下面就跟大家讲讲接下来的步骤。

四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。

对于转印90 kd 以下的蛋白，转膜液都不用加SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037% 的 SDS。

1.在电泳结束前20 min 开始准备转膜所需的东西。

转一张膜需准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1~8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。

切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。

PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。

目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

2.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。

除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。

也可取10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。

取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。

之后有两种方法供选择，一是按照marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。

在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF 膜和滤纸，平衡10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。

3.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3 张浸泡过缓冲液的滤纸。

大蛋白转膜条件
大蛋白转膜是一种常用的蛋白质分离与浓缩方法，可以通过电压驱动将蛋白质从凝胶中转移到膜上。

以下是常用的大蛋白转膜条件：
1. 凝胶类型：常见的凝胶类型包括聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）等。

根据
蛋白质的大小，选择合适的凝胶浓度和孔隙大小。

2. 转移缓冲液：转移缓冲液的选择取决于凝胶类型和蛋白质性质，常用的转移缓冲液成分包括Tris（pH 8.3-9.5）、甲胺基
乙烷磺酸（MES）、磷酸盐缓冲液等。

同时，可以添加适量
的SDS（Sodium dodecyl sulfate）来增加蛋白质的负电荷。

3. pH 值：转移缓冲液的 pH 值选择取决于目标蛋白的特性。

一般来说，聚丙烯酰胺凝胶转移使用 Tris 缓冲液（pH 8.3-
9.5），琼脂糖凝胶转移使用磷酸盐缓冲液（pH 7.0-8.0）。

4. 电压和时间：电压和时间的选择取决于凝胶类型和蛋白质大小。

常见的电压范围是10-30 V/cm，转移时间通常为1-4 小时。

5. 温度：转移过程可以在室温或低温条件下进行。

室温下的转膜通常速度更快，但低温条件可以减少蛋白质在转移过程中的变性和降解。

总结起来，大蛋白转膜的条件涉及凝胶类型、转移缓冲液的配
方和 pH 值、电压和转移时间，以及转膜温度等因素。

根据具体实验需求和蛋白质性质的不同，可以进行合理的调整。

蛋白转膜条件蛋白转膜（protein transmembrane）是指膜蛋白从胞浆一侧跨越细胞膜至胞外一侧的过程。

蛋白转膜在细胞中起着至关重要的作用，它参与了细胞内外信号传导、物质转运等多种生物功能。

在研究蛋白转膜过程中，选择合适的条件对蛋白进行转膜操作是至关重要的。

本文将介绍蛋白转膜的条件选择，并以蛋白转膜的经典方法电穿孔和lipofection为例，详细讨论其条件及操作步骤。

蛋白转膜的条件选择是根据所研究蛋白的性质以及转膜方法的原理来确定的。

一般来说，选择合适的转膜条件需要考虑蛋白的分子量、结构特点、理化性质等因素。

另外，对于不同的转膜方法，也需要考虑一些特殊的条件，比如电穿孔需要具备一定的电压、脉冲长度和频率，而lipofection则需要考虑转染试剂（lipofectamine等）的浓度和配比等。

对于蛋白结构较为复杂的情况，传统的电穿孔方法通常难以实现高效的转膜效果，可以考虑使用新一代的磁穿接法（magnetoporation）或微流控技术等方法来实现转膜。

对于高分子量的蛋白，由于其分子尺寸较大，传统的转膜方法效果有限，可以尝试使用特殊的电极和膜片材料，如静电纺丝法、脂质管道法等。

此外，对于具有较高的疏水性的蛋白，传统的lipofection方法往往效果不佳，可以尝试使用膜蛋白融合剂（membrane fusion）法或化学修饰法等。

以经典的电穿孔法为例，蛋白转膜的基本步骤如下：1. 准备电穿孔实验所需材料，包括电穿孔仪、电穿孔膜片、胞外液和胞内液等。

2. 将待转膜的蛋白加入胞内液中，使其达到适当的浓度。

3. 将胞内液注入电穿孔膜片内，确保液体充满整个膜片。

4. 连接电穿孔仪，调整电穿孔参数，如电压、脉冲长度和频率等，以及膜片和电极之间的距离。

5. 将电穿孔膜片放置于仪器中央，开始电穿孔过程。

6. 调整胞外液流速，保持恒定，以保证蛋白转膜的稳定性。

7. 在一定的时间范围内，观察蛋白转膜的效果，可以使用蛋白定量方法，如Western blot等，来检测蛋白的转膜效率。

wb小分子蛋白半干转条件-回复WB小分子蛋白半干转条件小分子蛋白半干转（Western Blot Semi-Dry Transfer）是一种常用的蛋白转印技术，用于将蛋白质从制备好的凝胶转移到膜上，以便进一步进行免疫印迹分析。

WB半干转法具有时间短、样品消耗少、结果可靠等优点，逐渐成为了实验室中最被推崇的蛋白转印方式之一。

本文将为您一步一步回答关于WB小分子蛋白半干转条件的问题。

第一步：准备工作在开始实验之前，您需要准备以下实验材料以及仪器设备：1. 蛋白凝胶：可以是SDS-PAGE凝胶、Native凝胶或者IEF凝胶等。

2. 转膜设备：一般使用膜构（membrane sandwich）装置。

3. 蛋白质转膜膜：可以选择PVDF膜或者NC膜等，根据需要选择合适的膜材。

4. 电源：选择合适电源以供电转印。

5. 混合溶液：制备半干转膜缓冲液。

第二步：制备半干转膜缓冲液半干转膜缓冲液一般由粗转膜缓冲液（Cathode Buffer）和精转膜缓冲液（Anode Buffer）混合而成。

其中，粗转膜缓冲液可视实验室条件选择具体配方，一般包括Tris-HCl缓冲液、甘油（glycerol）和SDS等成分；精转膜缓冲液包括甘油、Tris-HCl缓冲液以及SDS等。

具体的条件可以从文献中找到或者咨询相关实验室的技术人员。

第三步：装置装配1. 在半干转膜装置上安装内外层的导电网（wick）和滤纸等辅助物质。

内层wick（即离孔层）可以是滤纸或者海绵，而外层wick一般是滤纸。

2. 将内外层wick放置在半干转膜装置的相应位置上。

确保内外层wick与电极完全贴合，且相对平整。

3. 在内层wick上还可以放置一块滤纸，以增加液体的吸收能力。

第四步：蛋白转膜条件确定好实验条件后，即可进行蛋白转膜：1. 首先，在浸泡一段时间的转膜膜上进行标记，将蛋白凝胶与转膜膜定位对齐。

2. 将架于内阴极涂抹有粗转膜缓冲液的内层wick上，确保内外层wick贴合时形成一个平滑的表面。

[1]各位朋友：请教关于SDS—PAGE的问题。

我的配胶体系如下:15%分离胶4%浓缩胶水2.3ml2.7ml30％丙烯酰胺5。

0ml 0。

67mlTris—HCL PH8。

8 2。

5ml PH6.8 0.5ml10％SDS 0.1ml 0。

04ml10％APS 0。

1ml 0.04ml TEMED 0。

004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是11kd,浓缩胶60V,40min，分离胶90V，70min.跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因?我的试剂都是新配置的。

谢谢！！！答：【1】胶的配制方法；配制不同体积15%胶SDS—PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15％胶（毫升）： 5 －－10 －－15－－20－－30－－50 蒸馏水: 0。

5 －－ 1.0－－ 1.5 －－ 2.0 －－3。

0 －－5.0 30％Acr-Bis(29:1）: 2。

5 －－5。

0 －－7.5 －－10。

0 －－15。

0－－25.0 1M Tris, pH8。

8: 1.9－－3。

8 －－5.7－－7.6－－11。

4 －－19。

0 10%SDS ：0。

05－－0.1－－0。

15 －－0.2－－0。

3－－0.5 10％过硫酸铵：0.05 －－0.1 －－0.15－－0。

2 －－0.3 －－0.5 TEMED：0。

002－－0.004 －－0。

006 －－0。

008 －－0.012 －－0.02 配制不同体积4%胶SDS—PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升) 4%浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水： 3.16ml40％Acr/Bic（37。

5：1）: 0。

5ml0。

5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）：1.26ml10％SDS ：50 微升μ微升μ10％AP(过硫酸胺）：25 TEMED ：5 微升μ加TEMED后，立即混匀即可灌胶.【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比较重要.如果玻璃板洗不干净,很容易造成楼主所说的现象。

Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。

这会直接影响到样品浓缩的效果。

此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。

2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。

因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。

2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。

因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。

WesternBlot实验经验分享，你都知道吗？Western blot真的是让人头疼的实验，辛苦付出和完美结果不成正比的实验，是整个研究生阶段最磨练我个人忍耐力的实验，要掌握整体操作并不难，但是需要注意的细节却很多，而且，三分靠努力，七分靠运气，当你把能做的都做了的时候，能修改的条件都修改了，结果仍然是空白条带，what can I do for you?今天，小编给大家简单整理一下，自己在跑小分子蛋白和大分子蛋白时，摸索出来的经验和条件，欢迎大家积极讨论分享。

一、小分子蛋白小编当时在跑S100A4，分子量12kDa。

首先，要注意的一点就是，小分子蛋白很容易在提取的过程中降解，所以整个操作过程一定要保证在冰上低温快速充分的研磨提取，具体的裂解组织的步骤我就不说了，不过说到组织，小编想提一句，组织提蛋白有一点需要注意，就是这个蛋白在组织中的表达丰度、以及蛋白定位。

胞浆或者核内的蛋白提取方式会有不同，细胞核内的蛋白可能需要特殊的裂解液，一是通过阅读文献，清楚相同的蛋白和组织，别人的跑出来的情况如何；二是可以通过在The Human Protein Atlas网站（不懂看这个（工具篇）S5E50：航母级神器——蛋白组学结果大收录！）上查询。

1、电泳条件：a) 小分子的蛋白电泳建议选择15%分离胶，5%浓缩胶。

正常配胶时，一个迷你垂直电泳仪的配制，5ml分离胶，2ml浓缩胶，跑正常分子量的蛋白是没有问题的。

但是跑小分子蛋白，浓缩胶的长度要再长一些，最起码要保证三分之一浓缩胶，三分之二的分离胶，浓缩胶多，可以保证不同分子量的蛋白充分压缩到同一起跑线。

b) 电泳时间：浓缩胶80V，300mA 50min,分离胶120V，300mA1h10min，分离胶时间不建议太长，只要把marker跑开，能够区分开内参和小分子蛋白就好了。

我的习惯是电泳的全程也会把机器放到冰水混合物中，防止温度过高，蛋白弥散。

c) 蛋白上样量：正常分子量蛋白30ug足够，可以建议小分子量蛋白先用二倍的量60ug试一下看看。

western转膜条件蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KDWB用膜类型、孔径：0.45 NC转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA转膜时间：60~90 minPS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。

蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT蛋白分子量：65 KD & 56 KDWB用膜类型、孔径：0.45 PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压 100 V转膜时间：60~70 min设备名字是“Bio-Rad mini”。

蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KDWB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压 12 V转膜时间：30-40 min设备：“Bio-Rad mini”建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。

蛋白来源：293T细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KDWB用膜类型、孔径：PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压 90 V-110 V，控制电流不要超过300 mA。

转膜时间：70 min蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转 Bio-Rad说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

蛋白来源：成纤维细胞蛋白名称（可保密）：smad3蛋白分子量：54 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min转膜设备：湿转 Bio-Rad蛋白来源：胰腺癌细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：16 KDa and 42 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：120 V 恒压转膜时间：90 min转膜设备：湿转 Bio-Rad蛋白来源：大鼠血管平滑肌细胞蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：72 KD，42 KD 和22 KDWB用膜类型、孔径：一般的PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流一张膜0.26 A，两张膜0.3 A。

10%分离胶的电泳和转膜条件
10%分离胶的电泳和转膜条件如下：
电泳条件：
1. 电源：采用恒压或恒流的电源，电压根据分离胶的厚度和电泳槽的体积而定，一般设置为60\~100V。

2. 温度：电泳过程应保持恒温，温度过高可能导致凝胶溶化，电泳速率降低；温度过低则可能导致电泳时间延长，对电泳效果产生影响。

3. 缓冲液：使用适当的电泳缓冲液，以保证电泳的稳定性和分离效果。

4. 凝胶浓度：10%分离胶的凝胶浓度为10%，适合分离相对分子量较大的蛋白质。

5. 电场强度：电场强度越高，电泳速率越快，但过高的电场强度可能导致凝胶溶化和电泳条带变形。

转膜条件：
1. 转膜方法：常用的转膜方法包括湿转法和半干转法。

湿转法操作简单，转移效率高，但需要使用昂贵的硝酸纤维素膜；半干转法适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少，但操作相对复杂。

2. 转膜缓冲液：通常使用含有甲醇、甘氨酸和Tris等成分的转膜缓冲液，根据具体实验条件调整配方。

3. 转移时间：根据蛋白大小和所需的转移效率而定，一般小分子蛋白的转移时间较短，大分子蛋白的转移时间较长。

4. 电流密度：电流密度越高，转移效率越高，但过高的电流密度可能导致蛋白烧伤和膜破裂。

5. 温度：保持恒温的转移温度，温度过高可能导致蛋白丢失和膜溶化；温度过低则可能导致转移效率降低。

[1]各位朋友：请教关于SDS—PAGE的问题。

我的配胶体系如下:15%分离胶4%浓缩胶水2.3ml2.7ml30％丙烯酰胺5。

0ml 0。

67mlTris—HCL PH8。

8 2。

5ml PH6.8 0.5ml10％SDS 0.1ml 0。

04ml10％APS 0。

1ml 0.04ml TEMED 0。

004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是11kd,浓缩胶60V,40min，分离胶90V，70min.跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因?我的试剂都是新配置的。

谢谢！！！答：【1】胶的配制方法；配制不同体积15%胶SDS—PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15％胶（毫升）： 5 －－10 －－15－－20－－30－－50 蒸馏水: 0。

5 －－ 1.0－－ 1.5 －－ 2.0 －－3。

0 －－5.0 30％Acr-Bis(29:1）: 2。

5 －－5。

0 －－7.5 －－10。

0 －－15。

0－－25.0 1M Tris, pH8。

8: 1.9－－3。

8 －－5.7－－7.6－－11。

4 －－19。

0 10%SDS ：0。

05－－0.1－－0。

15 －－0.2－－0。

3－－0.5 10％过硫酸铵：0.05 －－0.1 －－0.15－－0。

2 －－0.3 －－0.5 TEMED：0。

002－－0.004 －－0。

006 －－0。

008 －－0.012 －－0.02 配制不同体积4%胶SDS—PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升) 4%浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水： 3.16ml40％Acr/Bic（37。

5：1）: 0。

5ml0。

5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）：1.26ml10％SDS ：50 微升μ微升μ10％AP(过硫酸胺）：25 TEMED ：5 微升μ加TEMED后，立即混匀即可灌胶.【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比较重要.如果玻璃板洗不干净,很容易造成楼主所说的现象。

western转膜条件蛋白来源：总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70KDWB用膜类型、孔径：转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400mA转膜时间：60~90minPS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。

蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin&AKT蛋白分子量：65KD&56KDWB用膜类型、孔径：转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100V转膜时间：60~70min设备名字是“Bio-Radmini”。

蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65KD&55KDWB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12V转膜时间：30-40min设备：“Bio-Radmini”建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。

蛋白来源：293T细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95KD&35KDWB用膜类型、孔径：PVDF转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90V-110V，控制电流不要超过300mA。

转膜时间：70min蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350mA恒流转膜时间：150min转膜设备：湿转Bio-Rad说明：相同条件曾用于数个30-70KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

蛋白来源：成纤维细胞蛋白名称（可保密）：smad3蛋白分子量：54KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：350mA恒流转膜时间：150min转膜设备：湿转Bio-Rad蛋白来源：胰腺癌细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：16KDaand42KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：120V恒压转膜时间：90min转膜设备：湿转Bio-Rad蛋白来源：大鼠血管平滑肌细胞蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：72KD，42KD和22KDWB用膜类型、孔径：一般的PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流一张膜，两张膜。

10kd蛋白转膜条件概述10kd蛋白转膜是一种常用的实验技术，用于将10kd蛋白从一个细胞膜转移到另一个细胞膜中。

本文将详细介绍10kd蛋白转膜的条件及相关操作步骤。

转膜条件在进行10kd蛋白转膜实验之前，需要准备以下条件和试剂：细胞培养1.选择适当的细胞系进行培养，常用的细胞系有HEK293和CHO细胞。

2.细胞培养基的选择要根据细胞系的要求进行，常用的培养基有DMEM和RPMI-1640。

3.细胞培养需要在37°C恒温培养箱中进行，保持细胞的稳定生长。

转染试剂1.转染试剂的选择要根据实验需要和细胞类型进行，常用的转染试剂有聚乙烯亚胺（PEI）和脂质体。

2.转染试剂的浓度和使用量要根据实验要求进行优化，通常需要进行不同浓度的试验来确定最佳条件。

转膜膜1.转膜膜的选择要根据实验要求进行，常用的转膜膜有聚酰胺凝胶膜和聚丙烯酰胺膜。

2.转膜膜的孔径大小要根据目标蛋白的分子量进行选择，通常使用10kd的蛋白选择10kd孔径的转膜膜。

转膜缓冲液1.转膜缓冲液的选择要根据实验要求进行，常用的转膜缓冲液有Tris-Glycine缓冲液和CAPS缓冲液。

2.转膜缓冲液的pH值要根据实验要求进行调整，通常在6.8-8.5之间。

其他试剂和设备1.需要使用蛋白提取试剂、电泳胶和电泳仪等设备和试剂。

2.根据实验需要可能需要使用Western blot试剂盒进行蛋白检测。

操作步骤以下是进行10kd蛋白转膜的详细操作步骤：1. 细胞培养1.将细胞培养在适当的培养基中，保持细胞的稳定生长。

2.当细胞达到一定的密度后，将细胞收集并进行下一步的处理。

2. 转染1.根据转染试剂的说明书，将转染试剂与目标蛋白进行混合。

2.将转染混合物加入到细胞中，并进行适当的培养时间，以确保目标蛋白被成功转染到细胞内。

3. 细胞收集1.在转染后适当的时间点，将细胞从培养瓶中收集。

2.使用洗涤缓冲液洗涤细胞，以去除细胞培养基和转染试剂的残留。

wb转膜条件公式【最新版】目录1.概述2.转膜条件公式的定义3.转膜条件公式的应用4.转膜条件公式的优缺点5.总结正文1.概述在科学研究和工程技术中，膜分离技术被广泛应用。

其中，转膜条件公式作为一种重要的数学模型，对于理解和优化膜分离过程具有重要意义。

本文将介绍转膜条件公式的定义、应用、优缺点等方面的内容。

2.转膜条件公式的定义转膜条件公式，又称为膜传输条件公式，是用于描述膜分离过程中物质传输行为的数学公式。

它主要包括以下几个方面：(1) 膜的透过率：表示膜对某种物质的选择性透过能力。

(2) 膜的阻力系数：反映了膜对物质的阻力大小。

(3) 膜的厚度：影响物质透过膜的时间和效率。

(4) 溶液的浓度差：驱动物质透过膜的动力。

3.转膜条件公式的应用转膜条件公式在实际应用中具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：(1) 膜材料的选择：通过转膜条件公式可以预测不同膜材料对某种物质的透过性能，从而指导膜材料的选择。

(2) 膜过程的优化：通过调整膜的透过率、阻力系数、厚度等参数，可以优化膜分离过程，提高分离效果。

(3) 膜分离过程的模拟：利用转膜条件公式可以建立膜分离过程的数学模型，实现对膜分离过程的模拟和预测。

4.转膜条件公式的优缺点转膜条件公式具有一定的优点，如能够描述膜分离过程中的物质传输行为，为膜材料的选择和膜过程的优化提供理论依据。

然而，它也存在一定的局限性，如公式中一些参数的取值受到实验条件和膜材料的影响，导致预测结果的准确性受到一定程度的影响。

5.总结转膜条件公式作为一种重要的数学模型，对于理解和优化膜分离过程具有重要意义。

通过应用转膜条件公式，可以有效地指导膜材料的选择、膜过程的优化以及膜分离过程的模拟和预测。