均相时间分辨荧光技术

时间分辨荧光光谱中
时间分辨荧光光谱是一种用于研究物质在光激发后发射出的荧光光谱的技术。

它可以提供关于分子结构、动力学和相互作用的有用信息。

时间分辨荧光光谱通常涉及到以下几个方面：
1. 时间分辨测量原理，时间分辨荧光光谱是通过对样品施加脉冲激发光源，然后测量样品在不同时间点上发射的荧光信号来实现的。

这种方法可以提供有关分子在不同时间尺度上的行为的信息，比如激发态寿命、能级交叉和分子内动力学等。

2. 应用领域，时间分辨荧光光谱在生物化学、材料科学、环境监测等领域有着广泛的应用。

例如，在生物医学领域，可以利用时间分辨荧光光谱研究荧光标记的生物分子在细胞内的动态过程；在材料科学中，可以通过时间分辨荧光光谱来研究半导体材料的光致发光和退火过程。

3. 数据分析，时间分辨荧光光谱产生的数据通常需要经过复杂的数据处理和分析。

这包括对光谱数据进行去噪、拟合和解卷积等处理，以提取出样品的动力学信息。

4. 仪器设备，进行时间分辨荧光光谱实验通常需要高性能的激发光源、光学检测系统和数据采集设备。

常见的实验装置包括飞秒激光器、光电倍增管、光栅和高速数字采集卡等。

总的来说，时间分辨荧光光谱技术在研究分子的动力学过程和相互作用方面具有重要的应用，对于揭示物质的性质和行为具有重要意义。

kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法kinase-glo激酶发光法和均相时间分辨荧光法是两种常用的生物分子检测方法。

kinase-glo激酶发光法是一种非放射性检测方法，用于检测激酶活性。

该方法基于ATP的化学发光反应，通过测量发光强度来定量测定激酶活性。

该方法具有高灵敏度、高特异性和可重复性强的优点，因此在生物分子检测中广泛应用。

均相时间分辨荧光法是一种基于时间分辨技术的荧光检测方法。

该方法使用具有长寿命的荧光标记物，可以在无需分离样品的情况下进行直接检测。

该方法具有高灵敏度、高选择性、低背景干扰和可同时检测多个分子的优点。

在生物分子检测中，均相时间分辨荧光法可以用于检测蛋白质、核酸和细胞等生物样本中的目标分子。

这两种方法在生物分子检测中各有优缺点，选择哪种方法取决于具体的实验需求和条件。

在实际应用中，需要根据实验目的、样本类型、检测灵敏度和特异性等方面进行综合考虑，选择最适合的方法进行检测。

时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。

大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。

时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。

荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。

但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。

因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。

解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。

但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。

不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。

平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。

（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。

Bagnols-sur-Cèze法国-2009年11月5日-Cisbio Bioassays ()公司是IBA旗下的子公司，也是药物研究和药物筛选领域HTRF (均相时间分辨荧光)技术的发明者。

今天Cisbio公司宣布，其在中国和韩国已建立了自己的销售团队，以便进一步开发亚洲市场。

本土销售团队将能让Cisbio为这两个迅速增长的生物制药市场的客户提供GPCR和激酶研究的HTRF平台、生物标志物检测以及其他相关的服务。

Cisbio Bioassays公司所销售的基于HTRF技术的产品包括：IP1, cAMP, Cellul’erk 以及Tag-lite™细胞表面受体平台。

这些业务将会通过IBA集团旗下的IBA中国分公司()来操作。

为了在亚洲市场拓展应用于癌症诊断和治疗方面的放射药物产品、仪器和方法, IBA集团于2007年建立了IBA中国公司。

韩国的销售业务则由位于首尔的代理商JCBio公司(www.jcbio.co.kr)负责。

JCBio公司专注于为制药和生物技术实验室提供相关商品。

“在过去的10年里，我们一直致力于在欧洲、北美和亚洲建立本土化的团队，针对特定市场并拓展我们在当地的业务。

” Cisbio Bioassays 市场部主管François Degorce说道，“我们的目标是成为一个客户至上的服务性公司，并让业务遍及全球。

我们在中国和韩国的团队将帮助我们促进与该两个重要市场的客户的关系。

”作为2009年度 Frost & Sullivan北美技术创新奖项的获得者，Cisbio Bioassays凭借着其专利技术HTRF领先于均相荧光方法领域。

HTRF是一种很灵敏且稳定的技术，主要应用于药物研发的高通量筛选阶段。

除了基于HTRF的一些产品外，Cisbio还能提供一系列的定制服务，其包括：为客户特定的实验蛋白，抗体或化合物等进行标记，为客户设计和研发实验方法，以及为客户提供HTRF 技术培训。

1.1 时间分辨荧光分析技术时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。

本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。

1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。

其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。

图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。

1020152530355E N E R G Y ,103c m -16H 5/2G 5/26H 15/27F 0F 2D 05D17F 6F 545D313/249/2Sm 3+Eu 3+Tb 3+Dy 3+H 9/2图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。

当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。

以铕(III)配合物为例，其荧光发光机理如图1.2所示[9]，包括三线态发光机理和单线态发光机理。

HTRF (homogeneous time resolved fluorescence)HTRF®是均相时间分辨荧光技术的简称，HTRF®技术是对TR-FRET技术的进一步改良，提供了更高的灵敏度和稳定性，为法国Cisbio公司的专利技术。

HTRF®技术结合了FRET 和时间分辨荧光（TRF''Time Resolved Fluorescence)）两种技术。

能量供体：Eu或Tb标记的穴状化合物元素；能量受体：XL665或d2----基于穴状化合物的供体与受体（第二荧光标记物）之间的荧光共振能量转移（FRET）。

在FRET中，受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。

因为Eu 的荧光衰减周期较长，所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。

当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm；另一部分能量转移到受体（acceptor）上，发射波长为665nm。

665nm的发射光仅仅由供体（donor）引起的FRET产生。

所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm和665nm；当不存在相互作用时，只有620nm一个激发光。

FRET利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）。

Donor 被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与Acceptor 比较接近，可以将能量共振转移到在Acceptor 上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。

将Donor 和Acceptor 分别与相互作用的生物分子结合，生物分子的结合可以将Donor 和Acceptor 拉到足够近的距离，产生能量转移，由于Acceptor 的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。