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生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：2011506066班级：11级生技02班前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.一.实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。
2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。
3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。
二．实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。
再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。
将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达三.实验材料及仪器1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21；2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。
gfp绿色荧光蛋白序列概述及解释说明1. 引言1.1 概述GFP（绿色荧光蛋白）是一种具有独特发光特性的蛋白质，被广泛应用于细胞和分子生物学领域。
其绿色荧光可以通过外源激活而观察到，使得科学家们能够可视化细胞内发生的过程，并实时跟踪靶标分子的定位与转移。
GFP的序列是理解其结构、功能以及应用关键的基础。
1.2 文章结构本文将从多个方面对GFP绿色荧光蛋白序列进行概述及解释说明。
首先，我们将介绍GFP的历史和发现过程，以及其在现代生物学中的重要性。
随后，我们将详细探讨GFP序列的组成和编码基因信息，并解析与功能相关性方面的研究进展。
最后，我们将阐述GFP序列在生物学研究中的广泛应用，并就目前存在的问题和未来发展进行思考。
1.3 目的本文旨在提供有关GFP绿色荧光蛋白序列的全面概述及解释说明，深入探讨其组成、结构、功能和应用，并对其未来发展进行展望。
通过本文的阐述，读者将能够更好地理解和应用GFP序列在生物学领域中的价值，为相关研究提供指导和启示。
同时，我们也希望通过此文促进对GFP技术的探索和创新，推动生物科学的不断发展。
2. GFP绿色荧光蛋白序列概述2.1 GFP简介GFP（Green Fluorescent Protein）绿色荧光蛋白是一种来自于海洋水母的蛋白质。
它的主要特点是能够发出绿色荧光，并且在非生物致死条件下仍然保持稳定。
由于这些特性，GFP成为了生物学领域中一种广泛使用的标记工具。
2.2 GFP的发现历程GFP最早是在1960年代末期由奥斯汀·盖因斯、罗德南·麦迪安和道格拉斯·普里肯特等科学家在研究水母Aequorea victoria时发现的。
他们观察到当GFP暴露在紫外线下时会发出绿色荧光，并且将其提取出来进行进一步研究。
随后，科学家们发现GFP能够自身形成一个染色体，而不需要其他辅助物质。
2.3 GFP的结构特征GFP的序列长约238个氨基酸残基，具有高度保守性。
绿色荧光蛋白(GFP)原核表达情况分析姓名：韩吉梅学号：2013107001 专业：作物栽培学与耕作学摘要：将含有绿色荧光基因的重组载体导入大肠杆菌中,经IPTG诱导产生大量融合蛋白,用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量。
考马斯亮蓝染色4小时再过夜脱色，观察目的蛋白的分子量大约为31.9kD,与预期值相符。
关键字：绿色荧光蛋白SDS-PAGE 原核表达1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。
由于GFP检测具有高灵敏度,操作简单,无需使用同位素等优点,近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域[1-2]。
采用GFP作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[3-4]。
同时也正因为其荧光反应不是酶反应,所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下,GFP的检测可能会产生一些假相,不易对荧光进行定量的测定。
我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP,制备出GFP抗体,利用抗原与抗体之间的特异性,在体外对GFP进行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题,可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度[5]。
原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。
选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
EGFP的原核表达分析首都师范大学生命科学学院100048摘要：利用PCR反应扩增出所需要的EGFP基因，与pTrc His蛋白表达载体重组，转化大肠杆菌BL21,提取质粒，诱导EGFP蛋白表达，进行进一步的分离纯化并用SDS-PAGE和Western-blot 做检测。
这个实验让我们充分熟悉了整个流程。
关键词：绿色荧光蛋白蛋白的诱导表达、分离纯化表达蛋白检测 E.coli材料和方法：1、主要材料及仪器1.1、菌株和质粒：大肠杆菌BL21为本实验室保存；重组筛选质粒pTrcHis购自Invitroge公司。
1.2、培养基：LB培养基（液/固）内含氨苄青霉素浓度为100 ug/ml。
1.3、器材和试剂器材：移液枪、PCR仪、离心机—（HetticZENTRIFUGEND-78532 Tuttlingen）、SIGMA2-16K(4℃离心机)、SIGMA 3-18K(离50ml大离心管)、紫外透射观察仪、水浴锅、核酸电泳仪（BIO-RAD）、超声波破碎仪（SONICSVIbra cell）、气浴恒温振荡器（THZ-82江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）、SDS-PAGE电泳装置、WesternBlotting电转移装置、水平摇床（WD-9405）、胶片观察灯（WD-9406）、封口机、超净台、250ml锥形瓶。
试剂：PCR反应体系缓冲液（10~50 mMTris-HCl，50 mM KCl，1.5 mMMgCl2）、DNA聚合酶（Taq E）、dNTPs混合物（每种2.5mM）、博大泰克PCR产物快速回收试剂盒、限制性核酸内切酶（BglII、EcoRI）、0.5M EDTA、琼脂糖凝胶（1g琼脂糖、100ml1xTAE、10ulEB）、电泳缓冲液（50 xTAE、Tris—乙酸、EDTA）、溴酚兰、蔗糖、甘油、连接酶（购于Promega公司的T4DNA连接酶及10×ligation buffer）、0.1MCaCl2、碱裂解液（溶液I：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl，pH=8.0、10mM EDTA；溶液II：0.2 M NaOH，1％SDS；溶液III：5 M KAc，11.5 ml冰醋酸，加水定容至100ml）、RNaseA、无水乙醇、PBS缓冲液、裂解缓冲液（含20mM咪唑）、冲洗液（含100mM咪唑）、洗脱液（含500mM咪唑）、5×样品缓冲液、30%凝胶贮液、4×分离胶缓冲液、4×浓缩胶缓冲液（4℃保存）、TEMED原液、10%过硫酸铵、Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3）、考马斯亮蓝G250染色液、GFP抗体（200ug/ml，用pH=7.5 TBS配置)、转移缓冲液、TBS、封闭液（5%脱脂奶粉）、显色液（氯萘酚，30mg/ml于甲醇中）、ddH2O、脱色液（（100 ml冰乙酸:100 ml乙醇:800 ml蒸馏水）2、方法2．1、EGFP基因的PCR扩增及其电泳检测在一灭菌的0.2mL小离心管中依次加入(总体积为50ml)：10×buffer(Mg2+)5ml4×dNTPs （每种 2.5mM ）8mlEGFP-F1mlEGFP-R1mlTemplate(模板)34mlTaq E1ml--------------------------------------------------------------------------------Total volume 50µl循环参数94 ℃3min94 ℃30s55 ℃30s 27cycle72 ℃1min72 ℃10min4 ℃保存2.2、PCR扩增产物的回收———试剂盒法1)、柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ml的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。
绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测孟庆文;曹素芳;李媛;金红;于康震【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2000(000)0S1【摘要】拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因的真核表达载体ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ，并观察其在ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。
以ＮｏｔⅠ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3，以ＢａｍＨⅠ鉴定方向，以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣＫ，经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆，荧光显微镜下观察。
结果证实成功构建了含ＧＦＰｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ，并成功转染ＭＤＣＫ，在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。
ＧＦＰ基因可在ＭＤＣＫ细胞中成功表达，并发出绿色荧光，是一良好的报告基因和筛选标记。
【总页数】2页(P)【作者】孟庆文;曹素芳;李媛;金红;于康震【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所【正文语种】中文【中图分类】S85【相关文献】1.携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体构建、转染及活性鉴定[J], 段炼;周波;李启富2.携带增强型绿色荧光蛋白基因的shRNA真核表达载体的构建 [J], 姜晓兵;赵洪洋;周凤3.人源化绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测 [J], 代文杰;吕晓颖;周保国;姜洪池;曲欣4.携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体构建及鉴定 [J], 肖钟迪;张玉成;房学东5.携带增强绿色荧光蛋白基因的人14-3-3σ真核表达载体的构建及其在转染乳腺癌MCF-7细胞的表达 [J], 郝苗;齐凤杰;马玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
原核表达及检测摘要：本实验采用IPTG诱导GFP在大肠杆菌中的表达，表明随着时间的推移GFP的表达量越来越多。
随后用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况关键词：原核表达SDS-PAGE凝胶电泳广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。
狭义的原核表达，常出现于生物工程中。
是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。
一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。
如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。
因为只有融合体蛋白才具有生物活性，所以还要进行融合体/包涵体检测。
选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。
绿色荧光蛋白( green fl uorescent protei n, GFP)是238个氨基酸组成的单体蛋白, 其分子量为27kDa 。
1974年由Morie等从海洋生物水母中分离出来[ 1], 并且Prasher等在1992年从水母Aequoreavictoria中成功克隆出了GFP的cDNA[ 2 ]。
GFP作为一种新的报告基因,与以往lacZ、CAT等报告基因相比, 有很多无可比拟的优越性: GFP不具有种属依赖性, 在多种原核和真核生物细胞中都表达;荧光强度高, 稳定性高; 不需要反应底物与其他辅助因子,受蓝光激发产生绿色荧光, 尤其适用于体内的即时检测; 另外GFP分子量小,易于融合, 适用于多种转化方式,对受体无毒害,安全可靠; 并且通过替换一些特殊氨基酸,可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要。
SDS-PAGE的原理：组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的pH值和离子强度。
聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合形成三维的网状结构。
绿色荧光蛋白原核表达载体的构建赵轶君;董浩;潘红艳;徐芳;赵佳;步怀宇;李红民【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2013(000)003【摘要】为开发以绿色荧光蛋白（GFP）为基因的原核表达载体，根据 NCBI 基因序列设计引物，通过 PCR 扩增获得GFP 编码基因，经限制性核酸内切酶消化后将 GFP 定向克隆至原核表达载体 pMAL－c2X 中 malE 基因下游的EcoRⅠ与Hind Ⅲ位点之间，与 malE 基因融合为一个表达框。
重组产物转化 E．coli TB1感受态细胞，在添加有50 mg/mL AMP、10μmol/L IPTG 的 LB 平板上于37℃培养12～16 h 后放置于25～30℃的培养箱中继续培养4～6 h，365 nm UV 照射下挑取转化克隆，经扩大培养后用 IPTG 诱导 GFP 的表达并用 SDS－PAGE 检测表达效率。
结果表明，融合在麦芽糖结合蛋白下游的 GFP 编码基因可以在宿主细胞中有效表达，在365 nm UV 照射下，可以直接从加有50 mg/mL AMP、10μmol/L IPTG 的 LB 平板上挑取发绿色荧光的重组克隆，SDS－PAGE 分析结果显示其扩大培养物经 IPTG 诱导后可高效表达 GFP。
该结果为进一步构建以 GFP 为标记基因取代抗生素筛选标记的原核表达载体提供了切实的试验依据。
【总页数】4页(P73-76)【作者】赵轶君;董浩;潘红艳;徐芳;赵佳;步怀宇;李红民【作者单位】西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西省生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院分子生物学课程组，陕西西安 710069;西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西省生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院分子生物学课程组，陕西西安 710069;西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西省生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院分子生物学课程组，陕西西安 710069;西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西省生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院分子生物学课程组，陕西西安 710069;西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西省生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院分子生物学课程组，陕西西安 710069;西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西省生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院分子生物学课程组，陕西西安 710069;西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西省生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院分子生物学课程组，陕西西安 710069【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达 [J], 刘华伟;张宏;孙超;王庆贺;宋艳瑞2.增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达 [J], 段斯亮;于声;苏晓庆3.乳酸乳球菌NZ9000中增强型绿色荧光蛋白报告系统的构建 [J], 刘璐; 艾连中; 夏永军; 熊智强; 管彤; 宋馨4.基于绿色荧光蛋白的冷鲜猪肉中大肠杆菌预测模型的构建 [J], 刘变芳;胡辉帆;张义奎;蔡锦;杜双奎;李俊丽;曹梦茜;吕欣5.表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用 [J], 张晓战;边传周;王增;杨磊;邓同炜;赵攀登;彭志锋;陈露露;郭懿文;夏艳勋;乔宏兴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生姓名学号专业年级、班级指导教师所在学院中国·新疆·石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。
本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。
关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1 前言1.1实验目的掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。
1.2实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。
正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。
绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。
采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。
同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。
我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。
原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。
选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。
本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。
1.3流程图：2材料与方法2.1材料2.1.1实验材料质粒DNA;PCR产物、酶切质粒、DNA Marker;外源DNA片段：PCR扩增回收目的片段A和PGM-Tvector(Amp’,lacZ),带限制性内切酶末端的DNA溶液（目的片段A和载体片段pBL）;E.coli DH-5α受体菌（R-M-），自提的质粒或重组子;重组质粒DNA的菌落、BL21;重组GFP质粒、标准蛋白。
2.1.2实验仪器PCR仪、PCR管、移液枪、离心机、电泳仪、涡旋振荡器、冰箱、透射仪、紫外透射仪、刀片、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、Eppendorf管、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、振荡培养箱、移液器、摇床、酒精灯、培养皿、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、分光光度计。
2.1.3实验试剂模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、Buffer(内含Mg2+)、ddH2O、pGM-T载体、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒，其它生化试剂皆为国产分析纯。
2.2实验方法2.2.1 PCR扩增目的基因片段(1)依次混匀下列试剂，反应体系如下：PCR反应体系各成分的量ddH2O 9.5 μl上游引物 1.0 μl下游引物 1.0 μl模板DNA 1.0 μlTaqDNA聚合酶12.5 μlTotal 25 μl混匀后瞬时离心(2)将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。
预变性94℃3 min，变性94 ℃30s，退火52℃30s，延伸72℃40s 30个循环。
总延伸72℃ 4 min；温度时间预变性94℃3min变性94℃30S退火52℃30S延伸72℃40S总延伸72℃240S(3)PCR扩增完毕后，取出PCR管放在冰盒上；(4)取5μl扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。
2.2.2目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测（1）加20ml 1×TAE缓冲液于三角瓶中；（2）精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化；（3）冷却至60℃左右，加1μl的Goldview溶液，摇匀；（4）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上；（5）轻轻拔除梳子，将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE），使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm；（6）取5μl质粒DNA及2μl加样缓冲液混匀上样；（7）110v约电泳0.5～1小时；（8）紫外透射仪观察结果。
2.2.3 DNA的回收和纯化回收PCR产物（采用天根时代DNA回收试剂盒）:（1）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，分别放入 1.5ml 离心管中；（2）以0.1g凝胶对应300μl的体积加入PN;（3）50℃水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解；（4）将上述的得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，12000rpm离心60s，弃掉废液；（5）加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；（6）加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；（7）将离心吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min；（8）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适当的洗脱缓冲液EB 30μl，洗脱缓冲液先在65℃水浴预热，冷却至室温，12000rpm 离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，12000rpm离心1min；（9）电泳检测回收产物，余置于-20℃下保存。
透射仪观察结果，并拍照。
2.2.4重组质粒的连接把PCR扩增的目的基因片段产物与pGM-T载体连接，反应体系如下：2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备采用CaCl2法。
（1）将实验室保存的E.coli DH-5α菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养过夜，活化E.coli DH-5α菌株；（2）按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转瓶接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37℃,200rpm震荡培养至OD600值为0.5左右；（3）在已灭菌的10ml离心管中吸取上述培养液10ml，冰水浴10min后，4℃、6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；（4）加2ml冰冷预热的0.1mol/LCacl2溶液，重悬菌体，冰浴10min，4℃、6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；（5）将每一份沉淀轻缓地悬于0.4～1ml含有20%甘油的0.1mol/L Cacl2的溶液中，轻轻重悬菌体沉淀，冰上放置10分钟；（6）分装100μL/管（冰浴分装），置于-70℃冰箱中保存。
2.2.6连接产物转化感受态细胞(1)转化用固体LB培养基平板制备：向含100μg/ml氨苄青霉素（AMP）的固体LB培养基平板上加50mg/ml的IPTG16μl和20mg/ml的X-gal 40μL，用灭菌弯头玻璃棒涂布均匀，37℃避光倒置3h，让溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。
加入ITPG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。
（2）连接产物转化E.coli DH-5α感受态细胞：①取5μl连接产物加到100μl E.coli DH-5α感受态细胞中。
轻弹混匀，水浴20min。
②取出离心管，42 ℃水浴中热激90 后，立即置冰浴中冷却5min。
③向离心管中加入800μL 37℃预热的无抗生素的LB液体培养基。
④取出离心管，12000rpm离心2min，弃上清800μL，用剩余的约100μL上清将沉淀菌体吸打混匀后，在LB平板上涂布ITPG和X-gal。
将平板倒置在37℃恒温箱中培养14h～18h，直至长出菌落，观察结果。
2.2.7重组质粒的菌落鉴定本次实验所用的pGM-T vector 含Ampr、lacZ基因，所以有重组质粒的菌落为白色，没有重组质粒的菌落为蓝色。
具体操作如下：①挑取菌落：使用无菌枪头随即挑取5个白色菌落，放入含氨苄青霉素的LB液体培养基的1.5ml EP管，振荡培养4h以上，吸取0.5ul菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。
②PCR反应体系与反应程序均与目的基因扩增条件一致。
③扩增产物取5ul用1%琼脂糖凝胶进行检测。
2.2.8提取重组质粒将鉴定为阳性重组子的质粒EP管挑取出来，按照实验室提取质粒的试剂盒说明书操作。
提取后，取5ul用1%琼脂糖凝胶进行检测。
2.2.9重组质粒双酶切用限制性内切核酸酶BamHⅠ和SalⅠ对PCR阳性菌落提取的质粒做双酶切鉴定。
酶切反应体系如下表。
体系成分体积质粒 5.0ul去离子水11ul10×Buffer T 3.0ulBamHⅠ（120U/ul）0.5ulSalⅠ(100U/ul) 0.5ul总体积20ul37℃酶切过夜，70℃灭活酶活性。
1%琼脂糖凝胶进行检测。
2.2.10 GFP基因重组表达质粒及诱导表达（1）将上步经酶切鉴定得到的GFP目的片段与表达质粒连接，并转化至大肠杆菌BL21菌株。
转化菌涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；（2）观察菌落生长情况，进行菌落PCR鉴定；（3）将鉴定为阳性的菌落接种于20ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃摇菌培养过夜。
