发光细菌GFP的表达机理及应用

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。

GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。

1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

实验一质粒DNA的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法。

该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。

二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。

迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA 分子，分子量范围从1kb到200kb。

质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。

绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用绿色荧光蛋白(GFP)是生物学中非常著名的一个标记蛋白，它可以帮助科学家们观察、追踪细胞内部分子的运动和位置变化。

本文将介绍GFP的结构、功能以及在细胞生物学中的应用。

GFP结构与功能GFP来自于海葵(海洋无脊椎动物)中的一种发光蛋白，它的结构中含有一个环状结构(环状柄)和一个β桶(β-barrel)。

环状柄中含有一个色素分子，称为染料环，贡献了GFP的光学特性。

β桶的作用是保护染料环，并使它的光学特性达到最佳状态。

GFP有着非常特殊的性质，它可以在自然光下发出荧光，荧光颜色为绿色。

当其暴露在213-488nm的紫外线照射下，GFP就会发射从蓝、绿到黄的荧光波长。

GFP的这种特性使得它成为了生物学家们进行光学研究的最佳工具。

1. 显微镜下的成像GFP是一种非常强的标记蛋白，通过将其融合到目标物分子上，可以非常清晰地显示该分子的位置和运动。

利用显微镜技术，研究人员可以观察到细胞器、蛋白质、RNA等生命大分子在细胞内的运动和相互作用，从而揭示其在生物学中的重要作用。

2. 基因表达与细胞注释通过将GFP基因转染到细胞中，可以实现在特定细胞和组织中进行特定基因的表达。

同时，在转染GFP的细胞中，人们也可以通过显微镜监测到特定细胞的位置和分布，用于细胞的标记与识别。

3. 胚胎发育研究GFP还可以用于观察和研究胚胎发育过程中各种细胞分子的运动和定位。

通过将GFP融合到发育过程中的标志性分子中，研究人员可以观察到该分子在胚胎发育的不同阶段中的表达和变化，从而揭示胚胎发育的机制。

总结GFP的发现和应用开创了一种全新的标记技术，使科学家们能够更深入地探究生命大分子的运动、位置和相互作用。

GFP的强烈荧光使得其在细胞生物学研究中具有广泛的应用价值，特别是在显微镜下的成像、基因表达与细胞注释以及胚胎发育研究中。

可以预见，在不久的将来，GFP的应用将会更加广泛，并将继续推动生命科学研究的进步。

gfp的应用原理步骤1. 简介GFP（Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白）是一种来自于蓝绿色发光苔藓（Aequorea victoria）的一种蛋白质，它能发出绿色荧光。

GFP在生物领域具有广泛的应用，特别是作为荧光标记的工具，用来研究细胞生物学和生物化学等方面的问题。

本文将介绍GFP的应用原理步骤。

2. GFP的应用原理GFP的应用主要基于其特殊的结构和发光机制。

GFP的分子结构中包含一个环状的花青质染色体，通过紫外线或蓝光激发后，花青质染色体接受能量并发出绿色荧光。

GFP的应用原理步骤可以大致归纳为以下几个方面：2.1. GFP的基因表达与转染要应用GFP进行生物学研究，首先需要将GFP的基因导入到待研究的目标细胞中。

通常使用基因转染技术，将GFP基因导入细胞质或细胞核中，并使其被目标细胞所表达。

2.2. GFP的定位与追踪一旦GFP基因在目标细胞内表达成功，GFP蛋白质将被合成并定位在细胞的特定位置。

通过显微镜观察，可以实时追踪GFP蛋白的定位，揭示细胞器、细胞结构以及其他目标的位置和形态。

2.3. GFP的功能分析GFP的应用不仅仅局限于细胞定位的研究，还可以用于功能分析。

通过将GFP 蛋白与其他感兴趣的蛋白质进行融合，可以观察到蛋白质在细胞内的表达和功能活性，从而研究蛋白质的功能和相互作用。

2.4. GFP的动力学分析还可以利用GFP技术进行动力学研究，通过观察GFP蛋白在细胞内的动态变化，如运动轨迹、生长速度、参与细胞分裂等，揭示细胞的生物学过程和机制。

3. GFP的应用步骤应用GFP进行细胞生物学和生物化学研究的步骤如下：步骤1：选择适当的表达载体选择合适的表达载体，将GFP基因插入其中，并与目标蛋白的编码序列进行融合，以实现目标蛋白的表达和GFP的定位。

步骤2：转染目标细胞采用合适的转染技术将表达载体导入目标细胞，并使用适当的筛选标记（如抗生素抗性基因）筛选成功转染的细胞。

GFP:绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。

它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。

发光机理:当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。

但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。

上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程,系由几位科学家分别研究完成的。

绿色荧光蛋白不仅无毒,而且不需要借助其他辅酶,自身就能发光,可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。

当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时,蛋白质既能保持其原有的活性,绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。

钱永健的贡献钱永健及其合作者,还解决了绿色荧光蛋白的晶体结构问题,从而允许能够较合理地对具不同性质的变体合成进行设计。

这些新变体有的荧光更强,有的呈黄色,有的呈蓝色,有的呈红色,有的可激活、可变色。

这意味着除绿色以外,还可以用其他颜色荧光蛋白标示不同的蛋白质和细胞。

GFP的发光特性GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder).GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察.GFP的性质GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定.GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.在生物技术中的应用1.分子标记除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。

对绿色荧光蛋白的了解及应用学院：生命科学学院姓名：马宗英年级：2011学号：2011012923前言绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。

这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。

但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。

【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用一、绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。

其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。

野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。

生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。

GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。

图2为生色团的形成机制。

图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列图2生色团的形成机制目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。

二、GFP在生命科学中的应用1、作为蛋白质标签（protein tagging）利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。

gfp帧定界-回复GFP帧定界：从基因到应用的全面鉴定和分析引言：在现代生物学中，研究者们常常需要对细胞或生物体内特定的基因进行定位和表达的分析。

为了更好地理解和研究生物体内的基因表达以及寻找新的治疗方法，研究者们发展了一种叫做GFP帧定界的技术。

本文将一步一步详细介绍GFP帧定界的原理、方法以及其在生物学研究和应用中的重要作用。

第一步：GFP的概述GFP，全称为绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein)，是一种从奇异鼠尾草(Aequorea victoria)中得到的荧光蛋白。

GFP具有自身发光的特性，因此在生物学研究中广泛应用。

该发光特性源自GFP蛋白中存在的三个氨基酸残基，它们之间形成的环结构可以吸收蓝色光并发射出绿色荧光。

第二步：帧定界的原理帧定界是一种通过GFP融合蛋白来定位和表达特定基因的技术。

通过将GFP与感兴趣的基因连接在一起，我们可以在细胞或生物体中使用荧光显微镜追踪和观察该基因的表达情况。

帧定界的原理基于两个关键因素：GFP 的发光特性和与GFP连结的基因的表达。

第三步：构建GFP帧定界融合基因首先，我们需要开发一个融合基因，将GFP和目标基因连接起来。

这可以通过DNA重组技术来实现。

在DNA重组过程中，目标基因的编码序列将与GFP的编码序列相连，形成一个带有GFP标记的新基因。

该基因可以被转录和翻译为GFP带有标签的融合蛋白。

第四步：基因表达和荧光显微镜观察通过将帧定界融合蛋白基因导入到感兴趣的细胞或生物体中，我们可以观察并监测GFP信号，并推测目标基因在特定组织或细胞中的表达情况。

为了实现这一点，研究者们通常使用荧光显微镜来观察GFP信号。

当被激活时，GFP会发出绿色荧光，从而使得目标基因的表达区域能够在显微镜下清晰可见。

第五步：数据分析与解读通过观察和记录GFP信号，研究者们可以分析和解读目标基因的表达模式。

这些数据可以用于揭示细胞活动、基因调控、生物发育和疾病机制等方面的重要信息。

gfp荧光蛋白发光原理GFP（Green Fluorescent Protein）是一种源自于海葵的荧光蛋白，因其独特的发光性质而被广泛应用于生物学研究领域。

GFP的发现和研究为科学家们提供了一种非常有用的工具，可以用来追踪和观察生物体内的分子和细胞。

GFP的发光原理可以追溯到其分子结构。

GFP由238个氨基酸组成，形成一个螺旋状的结构。

在这个结构中，存在一个特殊的色氨酸残基（Trp-66），它被称为“光子转换器”。

当GFP受到紫外线或蓝光的激发时，色氨酸残基会吸收能量并进入激发态。

然后，这些激发态的能量会通过共振能量转移的方式传递给GFP分子中的另一个色氨酸残基（Tyr-66）。

这个过程会导致Tyr-66残基发生氧化反应，产生一个高能态的中间体。

在这个高能态的中间体中，Tyr-66残基会与GFP分子中的一个氨基酸残基（Glu-222）发生共价键的形成。

这个共价键的形成会导致GFP分子的结构发生变化，使得GFP从原来的非发光态转变为发光态。

在发光态下，GFP会发出绿色的荧光。

GFP的发光原理还与其环境有关。

在GFP分子内部，存在一个环境敏感的氨基酸残基（Ser-65）。

当GFP分子受到外界环境的影响时，这个氨基酸残基会发生结构变化，从而影响GFP的发光性质。

例如，当GFP分子处于酸性环境中时，Ser-65残基会发生质子化反应，导致GFP的发光峰值发生红移。

相反，当GFP分子处于碱性环境中时，Ser-65残基会发生去质子化反应，导致GFP的发光峰值发生蓝移。

GFP的发光原理不仅仅是一种有趣的现象，还具有广泛的应用价值。

科学家们利用GFP的发光性质，可以将其与其他蛋白质或分子标记结合，从而实现对这些分子在生物体内的追踪和观察。

通过将GFP与特定的蛋白质或分子标记结合，科学家们可以研究细胞的生理过程、蛋白质的定位和交互以及基因表达的调控等。

此外，GFP还可以用于研究疾病的发生机制和药物的研发。

总之，GFP荧光蛋白的发光原理是基于其分子结构和环境敏感性质的。

GFP基因及其应用研究一、GFP基因的发现和结构GFP是由Aequorea victoria这种海洋生物中发现的一种荧光蛋白质。

简单来说，GFP是由238个氨基酸组成的蛋白质，具有绿色荧光。

GFP蛋白质的分类基因为亚稳蓝蛋白基因，全长716bp，编码238个氨基酸，分子量为27kDa。

GFP的主要结构与功能区域包括：β桶、环绕色氨酸残基、环肽、或许存在的水分子和色氨酸区域。

二、GFP基因在生命科学中的应用1. 应用于细胞追踪和分化状态研究GFP基因已经被广泛用于细胞定位、示踪和分化状态的研究。

比如，在细胞定位方面，研究人员可以将GFP融合到要研究的蛋白质中，然后通过观察GFP的荧光信号来确定这种蛋白质在细胞内的位置。

2. 应用于药物筛选和评估GFP基因已经被发现可以用于药物筛选和评估。

比如，研究人员可以将GFP融合到需要研究的药物靶点上，然后通过观察GFP 的荧光信号来确定药物的有效性。

3. 应用于基因定位和功能研究GFP基因也被广泛用于基因定位和功能研究。

比如，在基因定位方面，研究人员可以将GFP融合到要研究的基因中，然后观察GFP的荧光信号来确定这个基因在细胞中的位置。

4. 应用于基因治疗GFP基因还可以用于基因治疗。

比如，在基因治疗方面，研究人员可以将GFP融合到需要治疗的细胞中，然后通过观察GFP的荧光信号来确定治疗效果和细胞存活情况。

三、GFP基因的优缺点1. 优点GFP基因是一种非常有用的基因，具有广泛的应用前景。

它的主要优点包括：绿色荧光信号容易被检测、可以被化学和物理变化激发、不需要外部底物、容易被光学显微镜观察和肉眼观察等。

2. 缺点尽管GFP基因有很多优点，但是它也有一些缺点需要考虑。

比如，绿色荧光信号的强度相对较低、GFP蛋白质的稳定性较差、特别是在高温、酸碱度大等条件下容易失活。

此外，GFP荧光标记的分辨率也有限制。

四、总结GFP基因是生命科学领域中的一种非常有用的基因，已经被广泛用于细胞定位、示踪、分化状态的研究、药物筛选和评估、基因定位和功能研究以及基因治疗等方面。

绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。

所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。

将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。

关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。

1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。

长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。

1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。

GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。

基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。

GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。

本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。

其上有所用酶的酶切位点。