A549细胞的培养
A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1：2～1：3传代培养都是可行的。
一、 [所需溶液]
1， 细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)——无Ca、Mg
NACL 8.00g；
KCL 0.20g;
KH2PO4 0.20g;
Na2HPO4 .。12H2O 1.15g
加水至 1 000mL,将PH调至7.4，高压灭菌。
2， 胰酶-PBS消化液
结晶胰酶 2.5g;
高压灭菌后的PBS 1000ml
用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。
3， 细胞培养液：RPMI 1640培养液
二、［细胞的维持和培养］
１， 细胞的复苏
（１） 准备一个盛有40℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有Ａ５４９细胞的冻存管，放于40℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化（2-3 min）。 （２） 在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。
（３） 加入10ml以上预热的细胞培养液至25cm2培养瓶中。
（４） 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。
（５） 8-10h后，更换新的培养液。
（６） 常规传代培养。
２， A549细胞更换新的培养液
（１） 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
（２） 用PBS反复冲洗细胞2～3遍。
（３） 加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。
（４） 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。
３， A549细胞的传代
细胞培养试题
1、体外培养包括几类？什么是组织培养技术？
体外培养包括组织培养、细胞培养、器官培养三类；组织培养技术是指：从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
2、进行细胞培养的基本条件包括哪些？
（1）无污染的环境。无毒和无菌培养环境是保证培养细胞生存的首要条件。（2）适宜温度。人体细胞的适宜温度为36.5℃+0.5℃，偏离时，会影响细胞代谢，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力比对高温强。（3）气体和pH值。开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般置于95%的空气加5%CO2混合气体环境中。O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。多数细胞缺氧不能生存。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，作用是维持培养基的pH值，细胞要求7.2-7.4。（4）营养物质。包括糖，无机盐，氨基酸，维生素，促细胞生长因子等。牛血清是提供生长因子和细胞所需物质的来源。（5）渗透压。260-320 m Osm/L 培养基
3、原代培养、传代培养、二倍体细胞、克隆细胞株的概念。
原代细胞：直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。传代细胞：初代培养细胞从第一次传代培养后具有增殖能力的细胞群。二倍体细胞：细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同的细胞群。克隆细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单个细胞增殖形成的细胞群。
4、制备单细胞悬液的方法主要有哪些？
（1）悬浮细胞的分离方法是离心法，最简单方法是采用1000r/min的低速离心10min。
（2）实体组织材料的分离方法有机械分离法和消化分离法，机械分离法包括切割分离法（组织培养法）和机械挤压分离法；消化分离法包括胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和胶原酶协同用法、EDTA消化法。
5、简述细胞冻存、复苏和运送的方法。
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悬浮细胞传代及细胞计数
一、 细胞传代
实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。进一步掌握细胞培养的操作技术。
实验原理：
培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
实验用品：
（一）仪器
净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；
（二）玻璃器皿
吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、
（三）塑料器皿
吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架
（四）其他物品
微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪
（五）试剂
1640培养液、PBS
操作步骤：
1. 准备：
打开培养液，PBS；
取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。
2. 从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。
3. 首先观察培养板孔中培养液量。用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，精品教学课件设计 | Excellent teaching plan
吸出转入离心管。
4. 离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。
5. 取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。
6. 吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。
7. 其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。
8. 吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。
9. 镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。
二、细胞计数及生长曲线测定
培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期
潜伏期(latent phase)
细胞培养之细胞计数
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
一.准备工作：
取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用.
二.细胞悬液制备：
用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数：
1.取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑。活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104
说明：/4因为计数了4个大格的细胞数；×2因细胞悬液：染液=1：1稀释；×104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3
四.细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；
