细胞复苏
细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细
胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。
一、实验前准备
实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。
消毒双手和超净台。取约1ml 细胞完全培养基放于 15ml 离心管中。
水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。
注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。
二、制备细胞悬液
吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1 ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中 DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。
离心： 1000rpm，室温离心3min。
注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。
三、细胞培养
离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。培养瓶内加入4ml完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。 24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。
四、注意事项
1、解冻速度要快
在常温下，冻存液中的 DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻
培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无
血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在
改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。
一、基础培养基
绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基
酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基
是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而
Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有
无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取
1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——
DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度
高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形
下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这
种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能
有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元
生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒
效应。
在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因
为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的
培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若
培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM
含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度
下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究
之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。
原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓
度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与
碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识
培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。
一、基础培养基
绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。
在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。
原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。
细胞培养基的基本知识
培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血
清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中
包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。
一、基础培养基
绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素
和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的
混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须
氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。
MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s
改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成
分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情
形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养
基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损
伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中
时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。
在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有
不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培
养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏
时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要
用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的
组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也
能有比较令人满意的结果。
原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2
培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对
良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细
