TSS感受态制作

感受态的制备
1.铺无抗性的LB平板。

为避免意外，一般铺两块无抗性LB平板。

2.用1ml的枪戳几下菌库中的菌种,使得枪头上带有少量冰渣。

这个过程要迅速，避免菌种发生冻融或污染。

3.将冰渣溶于1ml 37℃预热的LB中,充分混匀后,用枪吸取20ul转移至另一只装有1ml 37℃预热的LB的 EP中,混匀后取100ul涂板。

37℃孵育14个小时。

观察菌落数量和相关理化特征，用封口膜密封4℃冻存。

4.用牙签挑取单克隆至4～6ml无抗性LB小管中260rpm 12小时(活化)。

这一步可以多挑几个克隆，以防其长不出来和有明显的污染。

5.取500ul菌液到100ml无抗生素的LB锥形瓶中300rpm 3小时。

注意观察，控制菌的浓度在OD600时不要超过0.6。

6.把100ml菌液分装在两只50ml离心管（已灭过菌）中，冰浴10分钟。

7.5000rpm、4℃离心10分钟，弃上清。

离心机需要4℃预冷。

8.用0.1mol/l的氯化钙10ml重悬浮。

徒手将50ml离心管反覆戳于冰上从而使细菌重悬浮。

因为感受态细胞比较脆弱易破损，故重悬浮时不宜使用震荡仪。

悬浮要充分！
9. 5000rpm、4℃离心10分钟，弃上清。

10.用0.1mol/L的氯化钙加15%的甘油2ml重悬浮。

注意事项同8。

11.以200ul每管分装，分装后冻存于-80℃。

注明制备日期和菌名。

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。

本实验室一般用TSS 法制备感受态。

为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。

2 实验流程1.提取DNA并用琼脂糖凝结电泳检验2.用带GC发夹的引物进行PCR，并用琼脂糖凝结电泳检验3.DGGE将长度相同但序列不同的DNA片段分开，并切胶纯化4.用不带GC发夹的引物进行PCR5.连接转化，需要用到感受态细胞6.菌落PCR进行验证2.1 DNA提取用DNA提取试剂盒提取DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。

2.2 琼脂糖凝胶电泳将0.3g琼脂糖溶解于30ml的1×TAE缓冲溶液中，加热溶解（微波炉加热或沸水浴加热，至琼脂糖溶解），稍微降温后加入3µL的核酸染料，混匀后倒入托盘中，插入梳子，约半小时后其冷却。

将凝胶放入电解槽中，加样（加有loading buffer的DNA样品），在5V/cm 电压下电泳30min。

在紫外光下观察电泳条带。

2.3 PCR反应及产物纯化采用25µL的反应体系：PCR反应体系成分终浓度引物GC Clamp-F 0.2 μM引物R 0.2 μMM g2+(M g Cl2) 0.5 mMBSA 0.2 mg/lTaq DNA Polymerase 1.25 U10×Taq Buffer 1×dNTP Mixture 0.2 mMDNA模板1~2μldH2O To 25 μl反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45秒，65 ℃复性45秒，72 ℃延伸45秒，共30个循环；72 ℃最终延伸5min。

将PCR产物全部进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下用无菌刀割下含目的DNA片段的琼脂糖块，称重，放入1.5 ml的离心管中，用DNA纯化通用试剂盒纯化PCR产物。

并用紫外分光光度计测定DNA浓度。

2.4 DGGE2.4.1 药品配制：1）40%聚丙烯酰胺丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07g dH2O To 100ml 2）0%变性剂6%Gel 8%Gel 10%Gel 12%Gel 40%聚丙烯酰胺15ml 20ml 25ml 30ml50×TAE缓冲液2ml 2ml 2ml 2ml dH2O 83ml(to 100) 78ml 73ml 68ml脱气15min，用0.45µm的滤膜过滤。

大肠杆菌感受态细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。

野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。

为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出不同的方法处理细菌，经过多年的努力，科学家们发现了可以增加细胞吸收外源DNA效率的方法，那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。

这种经过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态，该细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。

这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。

细菌的转化有两种类型：一种是自然转化（natural transformation），在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是工程转化（engineered transformation），在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。

枯草杆菌中的转化属于自然转化，E.coli转化就属于工程转化。

对于E.coli，目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。

其中，电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。

其转化效率为109～1010 转化子/μg DNA。

而对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。

转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。

496361450一、CaCl2感受态细胞的制备CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

TSS法制备高效感受态细胞Competent Cell Preparation and Transformation TSS method for competent cell preparationReagent:TSS solution85% LB medium10%PEG(wt/vol,MW8000)5%DMSO(vol/vol)50mM MgCl2(PH6.5)Autoclave or filter sterilize.Storage at 4℃ for 2 weeks.1. Streak the cell stock on a LB plate.Incubate the plate at 37℃ overnight.2. Pick a signle ,well –isolate colony and incubate it into 5ml of LB broth.Incubate at 37℃ overnight with shaking at 220rpm.3. Transfer 1 ml of the saturated overnight culture to a a sterile 500-ml flask containing 100ml of LB medium .Incubate the cell at 37℃with the shaking at 220 rpm,until OD600 reach 0.5,this usually takes 2.5-3.0 hr.4. Then chill the flask on the ice fir 20 mins and then collect the cells by centrifugation at 3000 rpm for 5 min at 4℃.5. Resuspend the cells in 10 ml of ice-cold TSS solution.Now the competent cells are ready to be transformed. Please do this for two times.6. Aliquot 150μl competent cells to 1.5 ml tube.Storage for a long time at -70℃.CM solution:5×KCM= 100ml 10ml0.5M KCl 3.73g 2.5ml(2MKCl)0.15M CaCl2 2.21g 2.5ml(1M MgCl2)0.25M MgCl2 5.08g 1.5ml(1M CaCl2)H2O up to 10 ml1. Slow thaw an aliquot of cells on ice.2. Set up a second tube containing 20μl of 5×KCM ;Add DNA and H2O up to a total volume of 100μl.K eep on ice.3. Add 100μl of the cell suspension to the second tube;mix and keep on ice for 20 mins.4. Heat shock the cells by transferring to 42 ℃ for 90s.5. Add 1 ml of pre-warmed LB medium to the tube;incubate at 37℃ for 40-60minutes.6. Plate out 100μl of the transformation onto selective medium.Spin down the remaining cells,resuspend into 100μl of fresh LB and plate onto a second plate.。

感受态大肠杆菌制备方法四川大学生命科学学院试剂配制：A液：1M，MnCl2；mol/LB液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液：称取CaCl20.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。

将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

TB缓冲液：方法步骤：1、溶液配制取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。

2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h），挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（328rpms）培养，3、其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，4、加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。

5、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率非常高，一般可到10×8，好时可到10×9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

洁净是最重要的。

无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。

离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g5min。

涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。

涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

预冷是必要的。

整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。

TSS方法（又称一步法）制备感受态细菌傻瓜程序一、准备工作1、配置1M 氯化镁或硫酸镁氯化镁（一般含6个水分子）或硫酸镁（二者效果一样）母液，不用灭菌，用时根据需2、配制1×TSS溶液（20ml）tryptone(1%) 0.2gYeast extract(0.5%) 0.1gNaCl(1%) 0.2gPEG(MW= 3350-8000) (10%) 2gDMSO（5%）1mlMgCl2(20-50mM) 1M MgCl2 400ul-1ml，或0.081~0.203 g六水氯化镁加14ml水（最好是超纯水）溶于三角瓶或烧杯中，搅拌使溶解，用量筒定容至20ml，用稀盐酸或氢氧化钠调ph至6.5(6.4-6.8均可)，过滤除菌（0.22或0.45um滤膜），4℃保存备用（可保存6月左右）。

注：如配制2×TSS溶液，试剂加倍即可，其它操作不变。

3、准备器具注射器，过滤器及滤膜——自来水洗净，去离子水冲洗数次，最后用超纯水浸泡并洗数次，保证器具不含干扰物质，然后装至一干净烧杯（去离子水冲洗过）中高温高压灭菌，注射器可不灭试剂瓶，1个，自来水洗净，去离子水冲洗数次，最后用超纯水浸泡并洗数次，灭菌，用于过滤除菌时接收过滤液50ml管子（管底注意圆或尖，4℃离心时与配备的冷冻离心机转头相配）2个（可多准备几个），自来水洗净，去离子水冲洗数次，用超纯水涮洗一次，然后装2/3管超纯水高温高压灭菌，用时把水倒掉1.5ml离心管（新开包装的，保证干净），200个（用来分装感受态），用干净的铝盒装好，铝盒外用报纸包住，橡皮条扎紧，灭菌，用前20小时整个置于-20℃冰箱预冷。

镊子1个，灭菌干净，锡箔纸包好灭菌，用来夹取1.5ml离心管。

液氮或预冷到-70℃的工业酒精（提前20h用500ml玻璃瓶装好置于-70℃冰箱中预冷），用于后面速冻分装好的感受态细胞不含抗生素的平板数个，含抗生素的平板数个250ml三角瓶（棉塞或锡箔纸封住）3-4个，全部自来水洗净，去离子水冲洗数次，一个装10-30mlLB，另一个装50ml，灭菌，用来培养细菌灭菌一次性吸头，全部新鲜灭菌，且用前未开过吸头盒盖4℃离心机（最好能装50ml离心管），超净工作台，酒精灯等二、制作感受态1、划线平板取-20℃或-70℃保存甘油菌划线于无抗生素平板，不要用4℃或常温保存菌，过夜培养（12-18h）2、扩大培养和培养指数初期细胞挑单菌落至10-30 m lLB（三角瓶或50ml管）中过夜培养（12-16h）。

感受态细胞的制备一、实验原理受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。

本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。

二、材料及准备工作一）材料准备二)试剂配制1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）蛋白胨 2.0g酵母提取物 1.0g氯化钠（NaCl） 2.0g2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）蛋白胨2×1.0g酵母提取物2×0.5g氯化钠（NaCl）2×1.0g琼脂粉2×1.5g温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。

4℃保存备用。

3、TSS液（100ml）（有效期2周）聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10%DMSO 5ml 终浓度5%MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/LLB 85ml 终浓度85%去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用注：聚乙二醇分子量可以为3000-80004、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）KCl（2mol/L） 2.5mlCaCl2(1mol/L) 1.5mlMgCl2(1mol/L) 2.5ml水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃保存备用三）仪器设备1、低温大容量离心机2、恒温水浴锅3、超净台4、高压锅5、37℃孵育箱6、恒温摇床7、制冰机8、分光光度计9、微量移液枪10、低温冰箱三、步骤及注意事项一）感受态制备（TSS法）1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。

大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。

2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。

【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。

未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。

重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。

本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。

2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。

进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。

一、金黄色葡萄球菌感受态制备1、平板上挑单菌落于TSB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。

2、按1%接种于2ml:200ml 培养基培养2h，OD600=0.4-0.53、2个50ml管冰上预冷，4℃将培养的菌分装2个50ml管中，5000rpm离心6-8min，去上清。

4、加10ml 0.5M蔗糖，打散菌体，再加40ml 0.5M蔗糖混匀，5000rpm离心5min，去上清。

5、重复4 .6、再重复4，但加到50ml 0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm离心5min，去上清。

7、用600ul 0.5M蔗糖垂悬。

8、分装菌液，每管100ul。

9、液氮冷冻10s，存于-80℃。

二、大肠杆菌感受态1、平板上挑单菌落于LB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。

2、按1%接种于2ml:200ml LB培养液体基培养2h（用50ml管），到OD600=0.4-0.6。

3、冰浴10min。

4、4℃5000rpm离心5min，去上清。

5、加30ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。

6、2 ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。

7、分装每管100ul，存于-80℃。

三、超级感受态（一）溶液1、TB （1L）终浓度MnCl2-4H20 10.88g 55mmol/lCaCl2 1.665g 15mmol/lKCl 18.65g 250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph 6.7) 20ml 10mmol/lH2O 补至1L0.45um 过滤除菌1、PIPES(0.5mol/l,ph 6.7),哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES),≥99.5% 英文名称：Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid1.5g PIPES溶于80ml水，5mol/l，KOH调Ph=6.7，定容100ml。