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叶绿素、类胡萝卜素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量;根据朗伯—比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C 和液层厚度L成正比,即A＝αCL式中：α比例常数;当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1cm 时,α为该物质的吸光系数;各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得;如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和;这就是吸光度的加和性;今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度;在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰;二、材料、仪器设备及试剂一材料：新鲜或烘干的植物叶片;二仪器设备：1分光光度计；2电子顶载天平感量；3研钵；4棕色容量瓶； 5小漏斗；6定量滤纸；7吸水纸； 8擦境纸；9滴管;三试剂：195%乙醇或80%丙酮v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液；2石英砂；3碳酸钙粉; 暗中2h,,25ml三、实验步骤1取新鲜植物叶片或其它绿色组织或干材料,擦净组织表面污物,剪碎去掉中脉,混匀;2将取好的样品放入25ml容量瓶中,加混合浸提液无水乙醇:丙酮=5:520ml,放在黑暗条件下,浸泡至叶片发白,用浸提试剂定容至25ml,摇匀备用;3把叶绿体色素提取液倒入1cm光径的比色皿内,以浸提试剂为空白测定吸光度;选择波长663 646 和470nm;四、实验结果计算叶绿素a 的浓度 = OD 633 – OD 646叶绿素b 的浓度 = OD 646– OD 663类胡萝卜素浓度=÷229 单位 mg/L Cmg/L 提取液总量ml叶绿体色素含量mg/g= ____________________________ 烟叶重量g1000注意事项：操作避光研磨时间短些。
水果、蔬菜汁类胡萝卜素含量的测定1 主题内容与适用范围本标准规定了水果、蔬菜汁中类胡萝卜素的分离提取方法及提取物中类胡萝卜素总量的测定方法。
本标准适用于水果、蔬菜汁中类胡萝卜素总量的测定。
2 原理果蔬滤液通过溶剂萃取,分离提取类胡萝卜素,在特定波长下用分光光度法测其吸光度。
该吸光度与类胡萝卜素含量成线性关系,通过换算即可得知类胡萝卜素之含量。
3 试剂和溶液本标准所用试剂除特殊规定外,均使用符合国家标准的分析纯试剂,均采用蒸馏水。
3.1 石英砂(Q/HG 22--467)；3.2 萃取剂,2/1(v/v)氯仿(GB 682)-甲醇(GB 683)混合。
4 仪器设备4.1 抽滤器；4.2 无灰分滤纸；4.3 分液漏斗：250mL；4.4 容量瓶,100mL；4.5 移液管,20mL；4.6 烧杯,50mL；4.7 分光光度计,使用的测量波长为440±10nm。
5 分析步骤注：由于类胡萝卜素本身性状的不稳定性,即见光易氧化分解,建议所有操作应避光进行。
5.1 试样的制备5.1.1 液体样品：混合均匀后取样。
5.1.2 固体样品：捣碎机捣碎后,纱布挤汁。
5.2 用移液管吸取20mL样液置50mL烧杯中。
5.3 过滤：在烧杯(5.2)中加入3g石英砂,摇动后用布氏漏斗过滤(布氏漏斗预先铺有无灰滤纸,纸上铺有2g石英砂),然后再用5mL水冲洗滤渣3次。
5.4 萃取：在250mL的分液漏斗中倒入滤液(5.3),再加入20mL萃取剂(3.2),振摇后静置,收集下部分有机相,再用20mL萃取剂提取两次,将三次萃取所得有机相合并,用萃取剂定容为100mL。
注：对果胶含量大的果蔬,萃取时,将三次合并的有机相重新倒回原分液漏斗,继续用20mL萃取洗涤一次,然后用萃取剂定容至100mL。
5.5 测定：在440±10nm波长下测定提取液的最大吸光度A。
6 结果的计算和表示类胡萝卜素总量用mg/L表示,按下式计算：类胡萝卜素(mg/L)＝A×20式中：A——测定的最大吸光度；20——换算系数。
一、实验目的1. 学习胡萝卜素的提取方法。
2. 掌握胡萝卜素含量的测定方法。
3. 了解胡萝卜的营养价值。
二、实验原理胡萝卜素是一种脂溶性色素，广泛存在于胡萝卜、菠菜、甘蓝等植物中。
胡萝卜素具有丰富的营养价值，对人体健康具有重要作用。
本实验采用有机溶剂提取胡萝卜素，并通过比色法测定胡萝卜素的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜胡萝卜、无水乙醇、蒸馏水、三氯甲烷、无水硫酸钠、硅胶、标准胡萝卜素溶液等。
2. 实验仪器：电子天平、离心机、分光光度计、研钵、烧杯、试管、漏斗、滤纸等。
四、实验步骤1. 胡萝卜素的提取（1）将新鲜胡萝卜洗净，去皮，切成小块，放入研钵中。
（2）加入适量无水乙醇，研磨成匀浆。
（3）将匀浆倒入漏斗中，用滤纸过滤，收集滤液。
（4）将滤液倒入烧杯中，加入适量无水硫酸钠，搅拌均匀，静置。
（5）待滤液分层后，取出上层清液，用分液漏斗分离。
（6）将分离出的上层清液倒入试管中，加入适量硅胶，搅拌均匀，静置。
（7）待硅胶沉淀后，取出上层清液，用分光光度计测定其吸光度。
2. 胡萝卜素含量的测定（1）将标准胡萝卜素溶液稀释成一系列浓度，分别测定其吸光度。
（2）以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（3）根据实验测得的胡萝卜素吸光度，从标准曲线上查得胡萝卜素含量。
五、实验结果与分析1. 胡萝卜素的提取通过实验，成功提取了胡萝卜素，提取率为（此处填写提取率）。
2. 胡萝卜素含量的测定根据标准曲线，计算出实验样品中胡萝卜素的含量为（此处填写含量）mg/g。
六、实验结论1. 本实验成功提取了胡萝卜素，提取率为（此处填写提取率）。
2. 通过比色法测定，实验样品中胡萝卜素的含量为（此处填写含量）mg/g。
3. 胡萝卜中含有丰富的胡萝卜素，具有很高的营养价值。
七、实验讨论1. 实验过程中，提取胡萝卜素的关键步骤是研磨、过滤和分离。
在研磨过程中，要注意研磨时间不宜过长，以免胡萝卜素氧化降解。
2. 在分离过程中，要注意分液漏斗的使用，避免混合液分离不完全。
新鲜蔬菜中β-胡萝卜素的提取、分离和测定
班级：临五一班（2小班）姓名：任依梦学号：5117119051
【实验目的】
●掌握从新鲜胡萝卜中提取、分离β-胡萝卜素的方法
●掌握应用紫外-可见吸收光谱法测定β-胡萝卜素的紫外光谱图
●了解共轭多烯化合物π→π*跃迁吸收波长的计算方法及共轭多烯化合物的紫
外吸收光谱特征
【实验原理】
简介胡萝卜素是维生素A的前体，具有类似维生素A的活性，有α、β、γ异构体，其中以β-胡萝卜素生理活性最强。
β-胡萝卜素的结构如下：
β-胡萝卜素是长链多烯化合物，它的π-π*跃迁吸收带处于可见光区，因此纯β-胡萝卜素是橘红色晶体。
提取胡萝卜素不溶于水，可溶于有机溶剂，故可用有机溶剂来提取。
分离采用柱层析法将提取液中β-胡萝卜素分离出来。
测定经分离提纯的β-胡萝卜素含量可以直接用紫外-可见分光光度法测定。
【实验步骤】
1.β-胡萝卜素的提取
20g新鲜胡萝卜+40mL1：1丙酮-石油醚混合溶剂研磨5min（研钵）萃取（分液漏斗）
2.柱层析
在层析柱中加入少许浸有石油醚的脱脂棉→加入一半层析柱高的石油醚→加入20g中性氧化铝→在氧化铝上面加一圆形滤纸→加入β-胡萝卜素提取液→用9:1（体积比）石油醚-丙酮溶液洗脱，进行层析
3.β-胡萝卜素的紫外-可见吸收光谱的测定
将层析分离得到的橙黄色试样稀释后加到1cm的比色皿中，以石油醚作空白试剂，用分光光度计测定400~600nm范围内的吸收
【实验结果】
β-胡萝卜素的吸收曲线。
（一）检测原理：类胡萝卜素含量测定(酶标仪96T)叶绿体中所含色素主要有两大类，叶绿素(包括叶绿素a和叶绿素b)和类胡萝卜素(包括胡萝卜素和叶黄素)，它们与类囊体膜上的蛋白质结合，成为色素蛋白复合体，其含量多少及其组成决定了植物对不同光的吸收、利用效率，常常作为研究光合生理的重要指标。
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，在649nm和665nm处测定叶绿素提取物的吸光值，在470nm处测定类胡萝卜素；然后利用经验公式计算出样品中叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量及类胡萝卜素含量。
（二）试剂组分与配制：试剂名称规格保存要求试剂一粉剂×1瓶4℃保存乙醇（自备）1000mL×1瓶4℃保存抽提Buffer配制：（体积比）乙醇：丙酮=95:5（三）所需的仪器和用品：酶标仪、96孔板、天平、10mL玻璃试管、锡箔纸、无水乙醇，丙酮。
（四）测定步骤：建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！1、样本制备（1）取新鲜植物叶片或其它绿色组织，去掉中脉。
（2）称约0.1g剪碎，用蒸馏水洗干净，然后加入1mL抽提Buffer，少量试剂一（约50mg），叶绿素对光敏感，务必在黑暗或弱光条件下充分研磨（难磨叶片可以添加少量石英砂助磨），然后转移至10mL玻璃试管。
（3）用抽提Buffer冲洗研钵，将所有冲洗液及研钵中所有的绿色物质转入10mL玻璃试管，用抽提Buffer补充至10mL，玻璃试管置于黑暗条件下或者包上锡箔纸浸提3h，观察试管底部组织残渣完全变白则提取完全，若组织残渣未完全变白，继续浸提至其完全变白。
2、上机检测分别取200μL浸提液和200μL抽提Buffer于96孔板，记为测定管和空白管，分别于665nm 和649nm和470nm处读取吸光值A，△A665=(A测定-A空白)665，△A649=(A测定-A空白) 649，△A470=(A测定-A空白)470。
食物中胡萝卜素的测定方法Method for determination of carotene in foods1 主题内容与适用范围本标准规定了食物中胡萝卜素的测定方法——纸层析法。
本标准适用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡萝卜素的测定，其最小检出限为0.11μg。
2 原理以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色纱分离；剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。
3 试剂3.1 石油醚（沸程30～60℃）：同时是展开剂。
3.2 丙酮：分析纯。
3.3 丙酮-石油醚混合液：3：7（V/V）。
3.4 无水硫酸钠：分析纯。
3.5 5%硫酸钠溶液。
3.6 1：1氢氧化钾溶液：取50g氢氧化钾溶于50mL水。
3.7 无水乙醇：需经脱醛处理。
3.8 β-胡萝卜素标准溶液：取5mgβ-胡萝卜素标准品，溶于10mL三氯甲烷中，浓度约为500μg/mL，准确测其浓度。
取标准溶液10.0μL，加正己烷3.00mL，混匀，测吸光值，比色杯厚度1cm，以正己烷为空白，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值。
计算公式： (1)式中：X1——胡萝卜素标准溶液浓度，mg/mL；A——吸光值；E——β-胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm，比色杯厚度为1cm，溶液浓度为1ppm的吸光系数，为0.2638；——将ppm,换算成mg/mL;——测定过程中稀释倍数的换算。
3.9 β-胡萝卜素标准使用液：将已标定的标准液用石油醚准确稀释后，每毫升溶液相当50μg，避光保存于冰箱中。
4 仪器和设备4.1 实验室常用设备。
4.2 玻璃层析缸。
4.3 分光光度计。
4.4旋转蒸发器：具150mL球形瓶。
4.5 恒温水浴锅。
4.6 皂化回馏装置。
4.7 点样器或微量注射器。
4.8 新华滤纸：定性，快速或中速，101号。
5 样品的采集和处理5.1 粮食：样品用水洗三次，置60℃烤箱中烤干，磨粉，储于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。
文章编号：1673—2103（201205— 0030— 05螺旋藻粉B-胡萝卜素含量测定方法的优化*赵楠1,李勇勇1,邵明飞2,郁章玉1,3，秦松4（1 •曲阜师范大学化学与化工学院，山东曲阜273165;2 •南京农业大学资源与环境科学学院江苏省海洋生物学重点实验室，江苏南京210095;3 •菏泽学院化学与化工系，山东菏泽274015;4•中国科学院烟台海岸带研究所生物资源实验室，山东烟台264003摘要:采用可见分光光度法测定螺旋藻藻粉中B-胡萝卜素含量，并对测定过程中有关B—胡萝卜素的提取工艺进行了优化，确定了最佳工艺参数为：提取剂为v （正庚烷?V（丙酮?（无水乙醇?V （甲苯=10?7?6?7,提取剂体积为30mL ,浸提时间为12h，浸提温度为35?.在该工艺下测得螺旋藻藻粉的B—胡萝卜素含量为134. 15mg /100g.关键词:螺旋藻粉；阡胡萝卜素；含量;测定中图分类号：Q562文献标识码:A螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻，具有很高的药用及营养价值，被联合国粮油组织推荐为“21 世纪最优秀的食品”.螺旋藻中B—胡萝卜素的含量非常丰富，所含的B—胡萝卜素达1700mg /kg （干重［1］•B-胡萝卜素是维生素A的前体物质，大量研究证实B-胡萝卜素是有效的抗氧化剂，能消除人体中的活性氧，消除自由基，在防癌［2］抗癌［3］、预防心血管疾病，增强免疫功能［4］等方面有明显作用［5］•螺旋藻粉中的B—胡萝卜素含量为所有食物之冠，比胡萝卜中的B—胡萝卜素含量还要高出10倍⑹•B—胡萝卜素作为螺旋藻综合开发利用的一种功能因子，有很大的商业化前景•因此，有关螺旋藻中B—胡萝卜素成分的研究和测定方法倍受重视•目前常用的测定p-胡萝卜素含量的方法有纸层析法、分光光度法和高效液相色谱法［7,8］•由于高效液相色谱法样品的前处理较为麻烦且所需仪器昂贵,所以还未能广泛普及•而纸层析法步骤比较繁琐，故本文采用分光光度法进行螺旋藻粉B-胡萝卜素含量的测定，并对该方法操作条件进行优化•1材料与方法材料螺旋藻粉,2011年12月份购于广西，置于阴凉抽屉中避光保存.1. 2试剂与仪器仪器:恒温水浴锅，上海福玛试验设备有限公司产品；电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；TU - 1901紫外可见分光光度计，北京普析通用有限责任公司产品；50mL具塞比色管，分液漏斗等.试剂:标准B—胡萝卜素（Sigma公司产品，质量分数〉97%,无水硫酸钠、正庚烷、丙酮、无水乙醇、甲苯、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、石油醚均为国产分析纯.1. 3B-胡萝卜素最大吸收波长的测定及标准曲线的绘制[5]取一定量的胡萝卜素标准品，溶解在石油醚中,在波长300 600nm范围内，用紫外可见分光3第34卷第5期Vol . 34No. 5菏泽学院学报Journal of Heze University 2012年10 月Oct. 2012*收稿日期:2012- 10- 09基金项目：国家海洋公益性行业科研专项经费项目（201205027国家海洋公益性行业科研专项经费项目（200905021—3;山东省自然科学基金资助项目（JQ200914山东省自然科学基金资助项目（ZR2012DQ015作者简介:赵楠（1987—,女,山东临沂人，在读硕士研究生，研究方向：分析化学.有障玉（I960—，男，山东临沂人教授，博士生导师，研究方向：生命电分析化学•秦松（1968—，男，山东莱州人，研究员，博士生导师，研究方向:海岸带生物技术.光度计进行波谱扫描，得到B-胡萝卜素的特征吸收峰，作为B-胡萝卜素的测定波长.准确称取2. 50mg3—胡萝卜素标准品，溶于石油醚，并定容于100mL棕色容量瓶中,配制成25ug/mL的B—胡萝卜素标准溶液，分别吸取0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0mL于5个10mL棕色容量瓶中，用石油醚定容，以石油醚为参比溶液，在450nm处测定各样品的吸光度，并绘制标准曲线.1. 4样品的测定准确称取0. 2g左右的螺旋藻藻粉于50mL的比色管中加入30mL提取剂和1mL 质量浓度为400g/L的KOH溶液，混合均匀；比色管放于35?恒温水浴中浸泡12h后,将浸泡液过滤，滤液倒入内盛50mL的20g/L硫酸钠溶液的250mL分液漏斗中，用10mL提取剂冲洗滤渣，重复两次,将洗液、过滤液收集到分液漏斗中.向分液漏斗中加入30mL乙醚及100mL蒸馏水，振摇后静置分层，弃去下层溶液，上层溶液再重复萃取两次.萃取所得上层溶液通过一装有10g无水硫酸钠的小漏斗滤入100mL棕色容量瓶中，用少量石油醚洗涤分液漏斗，并洗去无水硫酸钠表面的色素，定容至刻度线，摇匀，用分光光度计测定其在450nm处的吸光度.1. 5提取剂在50mL具塞比色管中加入0. 2g螺旋藻粉后再分别加入30mL下列溶液:V（正庚烷?V（丙酮?V（无水乙醇?V（甲苯=10?7?6?7;V （石油醚?V（丙酮=1?1;V（甲醇?V（石油醚=2?1;乙酸乙酯;V（石油醚?V（丙酮=4?1;V （丙酮?V（氯仿=1?2;V（丙酮?V（甲醇=7?2;石油醚.其余步骤按1. 4所述步骤进行操作.1. 6浸提温度在50mL具塞比色管中加入0. 2g螺旋藻粉、30mL最佳提取剂后，分别于25,35,45,55,65, 75?恒温水浴中浸泡12h,其余步骤按1. 4所述步骤进行操作.1. 7提取剂体积在50mL具塞比色管中加入0. 2g螺旋藻粉后，再分别加入15,20,25,30,35,40mL 最佳提取剂，于最佳浸提温度恒温水浴中浸泡12h其余步骤按1. 4所述步骤进行操作.1. 8浸提时间在50mL具塞比色管中加入0. 2g螺旋藻粉、最佳提取剂体积的提取剂后，于最佳温度恒温水浴中，分别密封避光浸泡2,4,6,8,10,12h其余步骤按1. 4所述步骤进行操作.1. 9正交试验设计采用L9（33正交试验表，以V（正庚烷？V（丙酮?V（无水乙醇?V（甲苯=10?7?6?7为提取剂，选取浸提温度、提取剂体积、浸提时间3个因素，每个因素取3个水平，其因素水平见表1.表1L9（33正交试验的因素水平水平A浸提温度/?B提取剂体积/mL C浸提时间/h 125258235301034540122结果与分析2. 1 p-胡萝卜素的吸收光谱及标准曲线图B—胡萝卜素的吸收光谱，如图1所示•从图1可见，—胡萝卜素在波长300 600nm范围内有两处较大的吸收峰，其中在450nm处吸收峰值最大,是B—胡萝卜素的特征吸收峰,本试验选择450nm作为阡胡萝卜素的测定波长Alflgbhblip-.1 'Hww ■didLLiMlMtdf 耳Imui E图1 B—胡萝卜素光谱扫描曲线B—胡萝卜素的质量浓度（p在0 2. 5ug/mL范围内与吸光度值（A呈现很好的线性关系，如图2所示.其标准曲线公式为:A=0 . 3089p—0. 0088, r2=0. 999ChhnAllMhiriwt I low.■.J FWW jeribLnil1*4-101 Tl lMWtniN' Iwni* fJiKWnwfl:-Hr(4*n-■fl.t5.图2 B—胡萝卜素的标准曲线132012年赵楠，等:螺旋藻粉B-胡萝卜素含量测定方法的优化第5期2. 2提取剂对B-胡萝卜素含量测定的影响各提取剂对胡萝卜素含量测定的影响见表2.由表2知,V（正庚烷？V（丙酮?V （无水乙醇?V（甲苯=10?7?6?7为最佳提取剂，其提取到的胡萝卜素含量测定最高，以下实验中均以此为提取剂.表2提取剂对B-胡萝卜素含量测定的影响提取剂B—胡萝卜素测定含量/（mg/100g标准偏差V（正庚烷?V（丙酮?V（无水乙V（甲苯=10?7?6?7134. 51?）. 869 V（石油醚?V（丙酮=1?198. 75?）. 800 V（甲醇?V（石油醚=2?178. 97?1. 640乙酸乙酯119. 7?1. 253 V（石油醚?V（丙酮=4?185. 85?1. 523 V（丙酮?V（氯仿=1?294. 42?1. 406 V（丙酮?V（甲醇=7?291. 69?2. 193 石油醚125. 83?3. 1872. 3浸提温度对胡萝卜素含量测定的影响随着浸提温度的升高,，胡萝卜素的测定含量呈先增大后减小的趋势，见表3.当恒温水浴温度为35?时，卜胡萝卜素测定的含量最大，为134. 15mg/100g.此后随着恒温水浴温度的升高,，胡萝卜素的测定含量开始平缓地减小.这表明适当地提高浸提温度可提高胡萝卜素的测定含量，过高的温度可能会影响B-胡萝卜素的稳定性，可能会使阡胡萝卜素发生降解而被破坏，使得阡胡萝卜素的测定含量较低.表3浸提温度对B-胡萝卜素含量测定的影响浸提温度/?旷胡萝卜素测定含量/(mg/100g标准偏差25125. 79?3. 463 35134. 15?0. 869 45127. 59?0. 723 55118. 36?1. 562 65121. 56?2. 785 75109. 89?1. 2602. 4提取剂体积对B—胡萝卜素含量测定的影响当提取剂体积为30mL时提取效果较好，此时提取物中的f—胡萝卜素的测定含量达到最高值，见表4.试验表明，提取剂的体积过大或过小，都不利于f—胡萝卜素的提取，因此30mL为最佳提取剂体积.表4提取剂体积对f—胡萝卜素含量测定的影响提取剂体积/mL f-胡萝卜素测定含量/(mg/100g标准偏差15113. 88辺.10920118. 34?3. 06925118. 78?5. 21230134. 5170. 86935116.517. 65440121. 8772. 698232012年菏泽学院学报第5期2. 5浸提时间对胡萝卜素含量测定的影响当浸提时间为12h时，浸提效果最好，此时提取物中的3-胡萝卜素测定含量达到最高值为134. 15mg/100g见表5.浸提时间过短，不利于3-胡萝卜素的充分溶出.随着浸提时间的延长,-胡萝卜素测定含量逐渐增大.表5浸提时间对3—胡萝卜素含量测定的影响浸提时间/h —胡萝卜素测定含量/（mg/100g标准偏差2109. 17?2. 3274111. 85辺.613 6115. 11?2. 023 8117. 04?2. 544 10126. 4271. 732 12134. 5170. 8692. 6正交设计优化提取工艺3—胡萝卜素含量测定的正交试验结果见表6.由表6可知，影响3—胡萝卜素含量测定的因素依次为：浸提温度〉提取剂体积〉浸提时间，最佳提取工艺为A2B2C3,即以V（正庚烷?V（丙酮?V（无水乙醇?V（甲苯=10777677为提取剂，提取剂体积为30mL,浸提时间为12h,浸提温度为357.表6L(33正交试验结果与分析试验号A浸提温度/?B提取剂体积/mL C浸提时间/h阡胡萝卜素含量/(mg/100g 111199. 20212297.773133103.284212105.675223126.42623112187.731397.458321108.03933295.82K1100. 08100. 77109. 70K2117. 99110. 7499. 75K100. 43106. 99109. 05R17. 919. 979. 95优水平A2B2C3主次因素A > B >C3讨论与结论1 3-胡萝卜素易被氧化，见光易分解，故本试验须在遮光条件下进行.样品在提取过程中，遮光条件下浸泡12h,在一定程度上减少了3-胡萝卜素的损失，从而提高了3—胡萝卜素的测定含量.2通过正交试验得出,提取3-胡萝卜素的最佳工艺条件为：V（正庚烷？V（丙酮?V（无水乙332012年赵楠，等:螺旋藻粉3-胡萝卜素含量测定方法的优化第5期醇?V（甲苯=10?7?6?7为提取剂，提取剂体积为30mL,35?下浸提12h;在最佳工艺条件下3—胡萝卜素的测定含量为134. 5mg/100g.3本试验方法简单，实验所需仪器均较为普通，便于企业生产过程对3-胡萝卜素进行快速检测及监控.参考文献：[1] 王文博.螺旋藻的生物活性成分分析及其免疫特性研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2009.[2] 赵文恩，韩雅珊，苏震，等.类胡萝卜素对H202—NaCIO体系生成的102的淬灭作用[J].生物物理学报,1997,13(1:137—142.[3] Gregory G K,Chen T S,Philip T. 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Biological Resources Laboratory,Yantai Institute of Coastal Zone Research,Chi nese Academy of Scie nces,Ya ntai Sha ndo ng264003,Chi naAbstract:I n this paper,the beta- carote ne of Spiruli na Powder was determ ined by UV —visible spectropho-tometry. The process for the extraction of bet—carotene was optimized as followed:n —hepta ne?acet on e?etha-nol ?toluene=10?7?6?7as extracti on age nt,extracti on solve nt volume30mL,the extract ion time12h,extrac-ti on temperature35?Key words:Spiruli na Powder;Beta— carote ne;c onten t;determ ine2012年菏泽学院学报第5期。
对Β-胡萝卜素测定方法的认识姓名：***班级：应用化学122班学院：化学工程学院学校：新疆农业大学对β-胡萝卜素测定方法的认识摘要：食品中的β-胡萝卜素可以用纸上层析法、薄层色谱法、分光光度法及高效液相色谱法等方法测定。
本文简述了这些方法的原理条件及优缺点，并谈了谈自己的认识。
Β-胡萝卜素作为维生素A的前体，是人体重要营养素，也能够影响蛋白质的合成和利用，促进体内软组织的生长发育。
同时，β-胡萝卜素还有一定的防癌作用。
因此，对β-胡萝卜素的研究倍受广注。
β-胡萝卜素分子中存在多个共轭双键结构，对许多物理、化学、生物等因素都不稳定，例如光辐射、高温、酸、碱、游离卤素、水分等，但氧是影响胡萝卜素稳定的主要因素。
它不溶于水、丙二醇、甘油、酸和碱，溶于二硫化碳、苯、氯仿、己烷及植物油等，几乎不溶于甲醇和乙醇。
1 测定方法1·1 天然β-胡萝卜素的提取取切碎混匀的菜样30g，加入适量水(一般约l：0.5—2)，于捣碎机中捣碎，使匀浆呈稠糊状。
因β-胡萝卜素对弱碱比较稳定，所以选用氨水：乙醇（5:35）作为稳定剂。
稳定剂可以加快沉淀且使沉淀完全，从而减少β-胡萝卜素损失，提高提取率。
加入2%的CaCl2·2H2O其沉淀量最大，且β-胡萝卜素的含量最高。
因β-胡萝卜素是脂溶性物质，可以溶解在有机试剂中，根据相似相溶规律和β-胡萝卜素的理化性质，我们选用亲脂性较强的有机溶剂。
为避免β-胡萝卜素的不必要损失，在除去溶剂时应避免高温，故应优先选择低沸点的溶剂。
同时，根据β-胡萝卜素在不同溶剂中的溶解度；可以得出石油醚可以作为很好的β-胡萝卜素的溶剂。
因为蔬菜糊中含有大量的水分，直接选用石油醚很难从其中萃取β-胡萝卜素，选用水溶性的丙酮和石油醚的混合液萃取，这样丙酮会有效地使渣干燥因而在随后的萃取中，色素可以高效地进入萃取液，提高了萃取率。
故在萃取过程中，为了提高萃取率，应加入氨水：乙醇（5:35）作为稳定剂，2%的CaCl2·2H2O作为沉淀剂；用石油醚和丙酮混合物作为提取剂。
食物中胡萝卜素的测定方法Method for determination of carotene in foods1 主题内容与适用范围本标准规定了食物中胡萝卜素的测定方法——纸层析法。
本标准适用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡萝卜素的测定，其最小检出限为μg。
2 原理以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色纱分离；剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。
3 试剂石油醚（沸程30～60℃）：同时是展开剂。
丙酮：分析纯。
丙酮-石油醚混合液：3：7（V/V）。
无水硫酸钠：分析纯。
5%硫酸钠溶液。
1：1氢氧化钾溶液：取50g氢氧化钾溶于50mL水。
无水乙醇：需经脱醛处理。
β-胡萝卜素标准溶液：取5mgβ-胡萝卜素标准品，溶于10mL三氯甲烷中，浓度约为500μg/mL，准确测其浓度。
取标准溶液μL，加正己烷，混匀，测吸光值，比色杯厚度1cm，以正己烷为空白，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值。
计算公式： (1)式中：X1——胡萝卜素标准溶液浓度，mg/mL；A——吸光值；E——β-胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm，比色杯厚度为1cm，溶液浓度为1ppm的吸光系数，为；——将ppm,换算成mg/mL;——测定过程中稀释倍数的换算。
β-胡萝卜素标准使用液：将已标定的标准液用石油醚准确稀释后，每毫升溶液相当50μg，避光保存于冰箱中。
4 仪器和设备实验室常用设备。
玻璃层析缸。
分光光度计。
旋转蒸发器：具150mL球形瓶。
恒温水浴锅。
皂化回馏装置。
点样器或微量注射器。
新华滤纸：定性，快速或中速，101号。
5 样品的采集和处理粮食：样品用水洗三次，置60℃烤箱中烤干，磨粉，储于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。
蔬菜与其他植物性食物：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱内保存备用。
6 测定步骤（以下步骤需在避光条件下进行）样品提取6.1.1 取适量样品，相当于原样1～5g（含胡萝卜素约20～80μg）的匀浆，粮食样品视其胡萝卜素含量而定，置100mL带塞锥形瓶中，加入丙酮20mL，石油醚5mL，振摇1min，静置5min，将提取液转入盛有100mL5%硫酸钠溶液的分液漏斗中，再于锥形瓶中加入10mL丙酮-石油醚混合液，振摇1min，静置5min，将提取液并入分液漏斗中。
如此提取2～3次，直至提取液无色为止。
6.1.2 植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品（＜10g＝，加脱醛乙醇30mL，再加10mL1：1氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液无色为止。
洗涤6.2.1 将提取液（）静置分层，弃去下层水溶液，反复用5%硫酸钠溶液振摇洗涤，每次约15，直至下层水溶液清亮为止。
6.2.2 将皂化后样品提取液（）用水洗涤至中性。
6.2.3 将或的石油醚提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。
浓缩与定容将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为60℃，蒸发至约1mL时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入石油醚定容，备层析用。
纸层析6.4.1 点样：在18cm×30cm滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点（如图1所示），吸取～浓缩液在AB和CD间迅速点样。
图16.4.2 展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。
6.4.3 洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中。
比色测定用1cm比色杯，以石油醚调节零点，于450nm波长下，测吸光度，以其值从标准曲线上查出β-胡萝卜素的含量，供计算时使用。
标准曲线绘制取–胡萝卜素标准使用液（浓度为50μg/mL）、、、、、分别置于100mL具塞锥形瓶中，按样品测定步骤进行操作，点样体积为，标准曲线各点胡萝卜素含量依次为、、、、、μg。
为测定低含量样品，可在0至μg间加做几点，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线（见图2）。
图2 实测图例胡萝卜素标准曲线图7 计算 (2)——样品中胡萝卜素的含量，以β-胡萝卜素计，mg/100g；式中：X2——在标准曲线上所查得的胡萝卜素的含量，μg；——点样体积，mL；——样品石油醚提取液浓缩后的定容体积，mL；——样品质量，g。
8 结果的允许差同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值、应用范围该方法用于预混料中β－胡萝卜素的定量分析2、原理样品被KOH水溶液皂化，β－胡萝卜素被乙醇和环己烷萃取出来，用乙醇和异丙醇稀释后，用分光光度计测定β－胡萝卜素含量。
3、分析过程3mol/L的KOH溶液：将溶于水，然后定容到样本溶液配制精确称取含大约10mgβ－胡萝卜素到锥形瓶中。
加入20ml 3mol/L的KOH溶液，在65℃（超声或水浴中震摇）15min，冷却后加入环己烷和无水乙醇，用磁搅拌子以700转/分的速度搅拌至少5min，（或强烈震摇10min,使均匀），取该溶液1ml用异丙醇定容到10ml在最大波长452nm测定吸光度，用异丙醇做空白。
4、计算结果A（吸光度）×稀释量×（校正因子）取样量（mg）×250A（吸光度）×50（环己烷量）×10（异丙醇定容量）×（校正因子）取样量（mg）×2501％β－胡萝卜素取－GB/ 食物中胡萝卜素的测定本方法检出限：高效液相色谱法为kg（L），线性范围为0~100mg/L；纸层析法为μg，线性范围1 ng～20ng。
第一法高效液相色谱法2. 原理试样中的β-胡萝卜素，用石油醚丙酮（80 20）混合液提取，经三氧化二铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。
3 试剂石油醚：沸程 30℃~60℃。
甲醇：色谱纯。
丙醇。
己烷。
四氢呋喃。
三氯甲烷。
乙腈：色谱纯。
三氧化二铝：层析用，100-200目，140℃活化2h，取出放入干燥器备用。
含碘异辛烷溶液：精确称取碘1mg，用异辛烷溶解并稀释至25mL，摇匀备用。
α-胡萝卜素标准溶液：精确称取1mgα-胡萝卜素，加入少量三氯甲烷溶解，然后用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入25mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为40μg/mL，放入-18℃储存备用。
β-胡萝卜素标准溶：精确称取β-胡萝卜素于烧杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入50mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为250μg/mL。
-18℃储存备用。
二个月内稳定。
根据所需浓度取一定量的β-胡萝卜素标准液用移动相稀释成100μg/mL。
β-胡萝卜素标准使用液：分别吸取β-胡萝卜素标准溶液、、、、、于10mL容量瓶中，各加移动相至刻度，摇匀后，即得β-胡萝卜素标准系列，分别含β-胡萝卜素5、10、20、30、40、50μg/mL。
β-胡萝卜素异构体：精确称取β-胡萝卜素于10mL容量瓶中，充入氮气，快速加入含碘异辛烷溶液10mL，盖上塞子，在距20W的荧光灯30cm处照射5分钟，然后在避光处用真空泵抽去溶剂，用少量三氯甲烷溶解结晶，再用石油醚溶解并定容至刻度，浓度为150μg/mL，-18℃保存。
4仪器高效液相色谱仪离心机旋转蒸发仪5分析步骤试样提取5.1.1淀粉类食品：称取试样于25mL带塞量筒中（如果试样中β-胡萝卜素量少，取样量可以多些），用石油醚或石油醚丙酮（80 20）混合液振摇提取，吸取上层黄色液体并转入蒸发器中，重复提取直至提取液无色。
合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干（水浴温度为30℃）。
5.1.2液体食品：吸取试样于250mL分液漏斗中，加入石油醚丙酮（80 20）20mL提取，然后静置分层，将下层水溶液放入另一分液漏斗中再提取，直至提取液无色为止。
合并提取液，在旋转蒸发器蒸发至干（水浴温度为40℃）。
5.1.3油类食品：称取试样于25mL带塞量筒中，加入石油醚丙酮（80 20）提取。
反复提取，直至上层提取液无色。
合并提取液，于旋转蒸发器蒸发至干。
纯化将5.1.1，，的试样提取液残渣，用少量石油醚溶解，然后进行氧化铝层析。
氧化铝柱为（内径）×4cm（高）。
先用洗脱液丙酮石油醚（5：95）洗氧化铝柱，然后再加入溶解试样提取液的溶液，用丙酮石油醚（5：95）洗脱β-胡萝卜素，控制流速为20滴/min，收集于10mL容量瓶中，用洗脱液定容至刻度。
用微孔滤膜过滤，滤液作HPLC分析用。
测定5.3.1HPLC参考条件：色谱柱： Spherisorb C18柱 mm×150mm。
流动相：甲醇乙腈（90 10）流速：min波长：448nm5.3.2试样测定：吸取“”项已纯化的溶液20ul依法操作，从标准曲线查得或回归求得所含β-胡萝卜素的量。
5.3.3标准曲线：分别进标准使用液20ul，进行HPLC分析，以峰面积对β-胡萝卜素浓度画标准曲线。
6结果计算见式（1）。
V×C 1X=--------×1000×------------ (1)m 1000×1000式中：X－试样中β-胡萝卜素的含量，单位为克每千克或克每升（g/kg或g/l）；V－定容后的体积，单位为毫升（mL）；C－试样中β-胡萝卜素的量（在标准曲线上查得），单位为微克每毫升（μg/mL）；m－试样的量，单位为克或毫升（g或mL）；计算结果保留两位有效数字。
7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。
第二法纸层析法8 原理试样经过皂化后，用石油醚提取食品中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。
9 试剂石油醚（沸程30℃～60℃）：同时是展开剂。
氢氧化钾溶液（1 1）：取50g氢氧化钾溶于50mL水。
无水乙醇：不得含有醛类物质。
9.3.1检验方法：9.3.1.1银氨液：加浓氨水于5％硝酸银液中，直至氧化银沉淀溶解，加入L氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加浓氨水使之溶解。
9.3.1.2 银镜反应：加2mL银氨液于试管内，加入几滴乙醇摇匀，加入少许 mol/L氢氧化钠溶液加热。
如乙醇中无醛，则没有银沉淀，否则有银镜反应。
