新生大鼠缺氧缺血性脑损伤NF-κBp65和TLR4表达变化探讨要点
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陋７２ ｈ：ＮＦ二ＫＢｐ６５（０．２８９２±０．０３２０。０．２６０９±０．０２１ ２）ａｎｄＴＬＲ４（０．３００５±０．０２０９，０．２８２０±０．０２２６），
ａｎｄＨＩＥ ７ ｄ：卜限．ＫＢｐ６５（０．２４７９±０．０３４０，０．２４２ｌ±０．０２５４）ａｎｄＴＬＲ４（０．２７４４±０．０２８ ８，０．２５７１±０．０２７ ５）． Ｃｏｎｄｕｓｉｏｎ Ｔｈｅｒｅ ｉｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＮＦ—ＫＢＤ６５ ａｎｄ ｒｎ．Ｒ４ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ＨⅡ三．Ｉｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ
（收稿日期：２０１５—０７—２８）
ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｃｅｐｈａ－
（本文编辑：苏晗）
万方数据
展，临床上也无特异的治疗方法＂ｏ。近年来发现核 转录因子ＫＢｐ６５（ｎｕｃｌｅａｒ
ｆａｃｔｏｒ—ｋａｐｐａ Ｂｐ６５，ＮＦ－ ｒｅｃｅｐｔｏｒ４，
多聚赖氨酸包被的载玻片上，室温保存备用。
１．４
脑组织苏木精一伊红染色（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ—ｅｏｓｉｎ－
ｐｒｏ
ｈ及７ ｄ组，每组８只大鼠。参照Ｒｉｃｅ
法７日龄大鼠建立缺氧缺血性脑损伤模型，实验组术后
５
ｒｎｉｎ出现烦躁不安，１０—１５ ｒａｉｎ出现全身紫绀、呼吸加
深加快，２５ ｍｉｎ出现固定向结扎侧（左侧）旋转。对照 组仅将手术线从左侧颈总动脉穿过而不予结扎，也不予 缺氧处理。两组术后按规定时间点断头取脑。 １．３免疫组化标本制作两组按规定的时间点取材， ４％多聚甲醛溶液经心脏灌注固定后，根据大鼠脑立 体定位图谱，将固定的鼠脑从前囟后以视交叉为中心 前后３ｍｍ冠状切取材，连续冠状石蜡切片，黏附于
ｓｏ．０４２ ８，０．４１９３±０．０４１
３）表
ＮＦ－ｚＢｐ６５（０．２８９
２±０．０３２ ０，０．２６０ ９土０．０２１
２）和ＴＬＲ４（０．３００
５±０．０２０ ９，０．２８２ ０±
６）和７
ｄ
ＮＦ．ＫＢｐ６５（０．２４７９
ｓ０．０３４０，０．２４２
ｌ±０．０２５４）和ＴＬＲ４（０．２７４４
Ｓ０．０２８８，０＿２５７
・论著・ 新生大鼠缺氧缺血性脑损伤ＮＦ—ＫＢｐ６５和ＴＬＲ４ 表达变化探讨
梁桂娟
王迎涛刘艳红唐成和
关海山
【摘要】
ｌｉｋｅ
目的探讨核转录因子ＫＢｐ６５（ｎｕｃｌｅａｒ
ｆａｃｔｏｒ—ｋａｐｐａ
Ｂｐ６５，ＮＦ．ＫＢｐ６５）和Ｔｏｌｌ样受体４（Ｔｏｌｌ—
ｒｅｃｅｐｔｏｒ４，ＴＬＲ４）在新生大鼠脑组织中的表达及其变化规律及相关性，研究两者在新生儿缺氧缺血性 ｈ及７ ｄ取其脑组织制备光镜石蜡标本，观察脑 新生大鼠缺氧缺血性
１２ ｈ、２４ ｈ、７２ ｈ、
抗兔ｋＧ，３７℃温箱、湿箱内再次孵育３０ ｍｉｎ；加入 辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，３７℃温箱、湿 箱内孵育３０ ｍｉｎ；ＤＡＢ显色。阴性对照用ＰＢＳ代替 一抗，剩余步骤同上。
１．５
ＴＬＲ４蛋白、ＮＦ—ＫＢ－ｐ６５的检测
阳性细胞的判
断：ＮＦ．ＫＢ－ｐ６５显色主要在胞核，有明确棕色或棕黄 色染色为阳性细胞；ＴＬＲ４显色定位于细胞浆／膜， 有棕黄色染色为阳性细胞。每组每个时间点观察８只 大鼠，每只大鼠取相邻切片两张，光镜下观察组织切 片呈棕黄色阳性部分，每张切片在１０×４０倍下随机 取１０个不重叠视野观察ＮＦ—ＫＢｐ６５和ＴＬＲ４平均光密 度值，利用Ｉｍａｇｅ １．６统计学处
新生儿缺氧缺血性脑病（ｈｙｐｏｘｉａ—ｉｓｃｈｅｍｉａ
１３０ｌ：ｌＯ．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３・４４０８．２０１６．０７．０１８
ｅｎ－
ｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ＨＩＥ）是围生期窒息或缺氧缺血性应激 所引起的部分或者完全脑部病变，可造成新生儿早期 死亡或存活者智能发育障碍、脑性瘫痪和癫痫等中枢 神经系统损害‘卜２｜。近年来国Ｆ勺＃Ｉ－ｘ，－Ｊ－ＨＩＥ的基础和 临床进行了大量的研究，但目前仍未取得突破性进
ＫＢｐ６５）和Ｔｏｌｌ样受体４（Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ
ＴＬＲ４）与心和脑缺血性病理损伤关系密切Ｈ。５ Ｊ。我 们通过建立新生大鼠ＨＩＥ模型，测定不同时间点脑 组织ＮＦ—ＫＢｐ６５和ＴＬＲ４的表达，探讨两者在新生大 鼠缺氧缺血后的表达变化规律及其相关性，为ＨＩＥ 发病机制提供思路。
１材料和方法
ｓｔａｉｎｉｎｇ，ＨＥ）和免疫组织化学法检测ＮＦ—ＫＢｐ６５和 ＴＬＲ４石蜡切片二甲苯透明和脱蜡各１０ ｍｉｎ，梯度 乙醇水化，苏木精染色５ ｍｉｎ，自来水冲洗５ ｍｉｎ，盐 酸乙醇分色５—１０ Ｓ，自来水冲洗５ ｍｉｎ，伊红复染
ａｔ脏６ｈ：ＮＦ－ＫＢｐ６５（０．２１９
０．０３０４）ａｎｄ ＴＬＲ４（０．３２７ １±０．０３３ ３，０．３０３ ９±０．０３７ ９），ａｎｄ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｔｈｅ ｈＪ【ｇｈｔｅｓｔ
ａｔ脏２４ｈ：ＮＦ－ＫＢｐ６５
ａｔ
（０．３５６ ４±０．０２３ ５．０．３３６ ５±０．０２３ ２）ａｎｄ １１．Ｒ４（０．４３４ ２±０．０４２ ８，０．４１９ ３±０．０４１ ３），ｔｈｅｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ．１１豫ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｍｏｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｔ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ａｎｄ ｈｉｐｐｏｃａｒｎｐ．Ｈｏｗｅｖｅｒ． ３±０．０２４ ７。０．２１５ ７± ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＦ—ＫＢｐ６５ａｎｄ ｒ１１凰４ ｂｅｇａｎ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ
Ｎｅｕｒｏｌ，２０１４，７５（３）：４１１－４２８．ＤＯＩ：１０．１００２／ａｎａ．２４１１７．
１００７／ｓ１００９６－００９－０７９９－０．
２０１４，７５（３）：４１１－４２８．ＤＯＩ：１０．１００２／ａｎａ．２４１１７． ［１４］ Ｇａｂｌｅ ＭＳ，Ｇａｖａｌｉ Ｓ。Ｒａｄｎｅｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉ—ＮＭＤＡ
作者单位：４５００５３郑州人民医院新生儿科（梁桂娟、刘艳红、 关海山）；４５００４２郑州，解放军第一五三医院检验中心（王迎涛）； ４５３００３新乡医学院第一附属医院新生儿科（唐成和） 通信作者：唐成和，Ｅｍａｉｌ：ｔｃｈｅｘｅｒ＠１２６．ｃｏｒｎ ［１３］
Ｔｉｔｕｌａｅｒ
ＭＪ，Ｈ６ｆｌｂｅｒｇｅｒ Ｒ，Ｉｉｚｕｋａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ
ｄａｍａｇｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｅｖｅｎ．ｄａｙ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｅｘ－ ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｂｒａｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｔ ６ ｈ、 １２ ｈ、２４ ｈ、７２ ｈ、７ ｄ ａｆｔｅｒ阳匠．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＬＲ４ ａｎｄ ＮＦ－ＫＢｐ６５ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｉｎｌｍｕ－ ｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＮＦ．ＫＢｐ６５ ａｎｄ ＴＬＲ４ ｗｅｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅＢｌ＂ｏｎ ａｎｄ ｍｉｅｒｏｇｌｉａ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ
Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ－ｋａｐｐａ Ｂｐ６５（ＮＦ－ＫＢｐ６５）ａｎｄ Ｏｂｊｅｅｔｉｖｅ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｔｏｌｌ．１ｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ４（ＴＬＲ４）ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ７－ｄａｙ．ｏｌｄ Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｈｙ． ｐｏｘｉａ—ｉｓｃｈｅｍｉａ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ（卸匝）ａｎｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ １１．Ｒ４ ａｎｄ ＮＦ．ｚＢｐ６５ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｎｅｏ－ ｎａｔａｌ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｏｘｉｃ．ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ
ｐｌｕｓ５．０图像分析系统定量评定
ＮＦ－ＫＢｐ６５及ＴＬＲ４的表达。
各组数据均采用均数±标准差
（Ｘ±Ｓ）表示，应用ＳＰＳＳ １７．０软件用成组设计两样本均数比较
Ａ：对照组大脑皮质（ＨＥ ｈ细胞水肿（ＨＥ
ｘ２００）；Ｂ：对照组大脑皮质（ＨＥ ｘ４００）；Ｃ：对照组海马（ＨＥ×２００）Ｄ：对照组海马（ＨＥ×４００）Ｅ：实验组６ ｘ４００）；Ｆ：实验组２４ｈ细胞坏死及核固缩（ＨＥ ｘ４００）；Ｇ：实验组７２ｈ核固缩及出现胶质细胞增生（ＨＥ ｘ４００）Ｈ：实验组７ ｄ
１：１５０，ＮＦ－ＫＢｐ６５
１．１实验动物与试剂８０只７日龄（出生日为０ ｄ） Ｓｐｒａｇｕｅ．Ｄａｗｌｅｙ（ｓＤ）大鼠，由新乡医学院动物实验中 心提供。体重１２—１６ ｇ，兔抗大鼠ＴＬＲ４抗体、兔抗大 鼠ＮＦ—Ｉ‘Ｂｐ６５抗体购自美国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ生物技术有限公 司。标本切片常规脱蜡、水化，按试剂盒说明书进行ＳＰ
于缺氧缺血后６ｈＮＦ．ＩｃＢｐ６５（０．２１９３±ｏ．０２４７，０．２１５７ ｓ０．０３０４）和ＴＬＲ４（０．３２７１±０．∞３ ３，０．３０３９ｓ０．０３７９）表 达增加，２４ｈＮＦ－ＫＢｐ６５（０．３５６４±０．０２３ 达达到峰值，７２
０．０２２ ｈ ５，０．３３６５ ｓ０．０２３
２）和ａ阿＿ａ４（０．４３４ ２
脑损伤发病机制中的作用。方法出生７ ｄ新生大鼠随机数字表法分对照组和缺氧缺血组，制备新生儿缺 氧缺血性脑损伤模型，并于缺氧缺血术后６
ｈ、１２ｈ、２４ｈ、７２
组织的病理变化。采用免疫组织化学方法分析ＮＦ．ＫＢｐ６５和ＴＬＲ４的表达。结果
脑损伤过程中，ＮＦ—ＫＢｐ６５和ＴＬＲ４在神经元、小胶质细胞均有表达，以大脑皮质和海马部位表达变化明显；
３。５
ｒａｉｎ。梯度乙醇脱水，二甲苯二级透明，中性树
