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高效液相色谱法测定固体食品中的安赛蜜刁玉华，张加稳，陈娴（昆明市食品药品检验所，昆明 650032）摘要：建立一种高效液相色谱法测定固体食品中安赛蜜的方法。
以水为提取溶剂超声波提取安赛蜜，然后在提取液中加入沉淀剂除杂，采用C18反相色谱柱，紫外检测器，以0.02mol/L乙酸铵溶液∶甲醇=90∶10（v/v）为流动相，检测波长225nm，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量10μL进行检测，外标法定量。
安赛蜜出峰时间为4.348min，样品的检出限为0.57mg/kg，定量限1.89mg/kg，线性范围为0.5～50.0μg/mL，相关系数0.9998，安赛蜜的加标回收率在91.3%～99.3%之间，重复性实验的相对标准偏差在2% 以下（n=6）。
建立的前处理方法具有简单、快速、准确、实用性强的特点，可用于固体食品中安赛蜜的检测。
关键词：安赛蜜；高效液相色谱；固体食品中图分类号：TS207.3/TS202.1 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2021）03-0090-05 doi：10.19804/j.issn1006-2513.2021.03.015Determination of acesulfame K in solid food byhigh performance liquid chromatographyDIAO Yu-hua，ZHANG Jia-wen，CHEN Xian（Kunming Institute for Food and Drag Control，Kunming 650032）Abstract：A high performance liquid chromatography for determination of acesulfame K in solid food was developed. Acesulfame K was extracted using water，assisted by ultrasound，and purified by precipitation. Zinc acetate and potassium ferrocyanide was used for preparation. Acesulfame K was separated on a C18 column using 0.02mol/L ammonium acetate methanol（90∶10，v/v）as mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min and detected by ultraviolet detector at 225 nm. The column temperature was 30℃ and injection volume was 10μL. The quantitative detection was carried out by external standard. The retention time of acesulfame K was 4.348 min. The limit of detection was 0.57mg/ kg and limit of quantification was 1.89mg/kg. The linear range was between 0.5 and 50.0μg/mL with correlation coefficient of 0.9998. The mean spike recoveries for acesulfame K in a blank sample was between 91.3%and 99.3%，with a relative standard deviation below 2%（n=6） . The method was simple，rapid，accurate and practical. It can be used for determination of acesulfame K in solid food.Key words： acesulfame K；high performance liquid chromatography（HPLC）；solid food安赛蜜，学名乙酰磺胺酸钾（Acesulfame-K）是一种健康新型高强度甜味剂。
实验二高效液相色谱法检测饮料中甜味剂一、实验目的学习高效液相色谱仪的基本操作，分析测定汽水、可乐型饮料、果汁、果茶等食品中乙酰磺胺酸钾、糖精钠的色谱条件选择。
二、实验原理试样中乙酰磺胺酸钾、糖精钠经高效液相反相C18柱分离后，根据保留时间定性，外标峰高或峰面积定量。
三、实验器材1、试剂1.1 甲醇：色谱纯。
1.2 乙腈：色谱纯。
1.3 0.02 mol/L硫酸铵溶液，称取硫酸铵2.642 g，加水溶解至1000mL。
1.4 10%硫酸溶液。
1.5 中性氧化铝层析用，100目~200目。
1.6 乙酰磺胺酸钾、糖精钠标准储备液：精密称取乙酰磺胺酸钾、糖精钠各0.1000g，用流动相溶解后移入100mL容量瓶中，并用流动相稀释至刻度，即含乙酰磺胺酸钾、糖精钠各1mg/mL的溶液。
3.7 乙酰磺胺酸钾、糖精钠标准使用溶液：吸取乙酰磺胺酸钾、糖精钠标准储备液2mL于50mL容量瓶，加流动相至刻度，然后分别吸取此液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于10mL容量瓶中，各加流动相至刻度，即得各含乙酰磺胺酸钾、糖精钠4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL、16μg/mL、20μg/mL的混合标准液系列。
3.8 流动相：0.02mol/L硫酸铵（740~800）+甲醇（170~150）+乙腈（90~50）+10%硫酸（1mL）。
2、仪器高效液相色谱仪（配有紫外检测器）；超声清洗仪（溶剂脱气用）；离心机；抽滤瓶；G3耐酸漏斗；微孔滤膜0.45μm；层析柱，可用10ml注射器筒代替，内装3cm高的中性氧化铝。
四、实验步骤1、试样处理1.1 汽水：将试样温热，搅拌除去二氧化碳或超声脱气。
吸取试样2.5mL于25mL 容量瓶中。
加流动相至刻度，摇匀后，溶液通过微孔滤膜过滤，滤液作HPLC分析用。
1.2 可乐型饮料：将试样温热，搅拌除去二氧化碳或超声脱气，吸取已除去二氧化碳的试样2.5mL，通过中性氧化铝柱，待试样液流至柱表面时，用流动相洗脱，收集25mL洗脱液，摇匀后超声脱气，此液作HPLC分析用。
第二十章 高效液相色谱法思考题和习题1． 简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点：2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。
优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。
目前常用的Si-O-Si-C 型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。
①非极性键合相：常见如ODS 键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。
3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。
用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。
反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。
用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。
4．简述反相键合相色谱法的分离机制。
典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。
固定相，常用十八烷基（ODS 或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。
非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。
反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。
硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。
对于反相色谱的分离机制两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。
分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。
高效液相色谱测定法
高效液相色谱测定法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和定量技术，可
以用于分离和测定复杂的混合物。
它基于物质在流动相（溶剂）和固定相（色谱柱上的填料）之间的相互作用的差异，利用流动相的流动将待测样品分离成不同的组分。
通过分析组分的保留时间和色谱峰的峰面积或峰高，可以定量不同组分的含量或浓度。
高效液相色谱测定法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，因此在许多分析领域得到广泛应用。
它可以应用于生物医药、环境监测、食品安全等多个领域，用于分析和监测有机化合物、无机化合物、药物、天然产物、食品成分等。
高效液相色谱测定法的基本步骤包括：样品预处理、制备流动相、样品进样、流动相流动、色谱柱分离、检测器检测、结果处理等。
根据样品的性质和分析要求，可以选择不同的检测器，如紫外检测器（UV）、荧光检测器、质谱检测器等。
需要注意的是，高效液相色谱测定法在操作过程中需要注意样品制备和仪器条件的优化，以提高分离效果和分析结果的准确性。
此外，也需要注意流动相成分的选择、色谱柱的使用寿命等因素对分离效果的影响。
第16章高效液相色谱法【16-1】从分类原理、仪器构造及应用范围，简述气相色谱及液相色谱的异同点。
答：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行分离的。
从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。
同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。
气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。
而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。
但是二者均可与MS等联用。
二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。
而只要试样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。
【16-2】高效液相色谱仪由几大部分构成？各部分的主要功能是什么？答：高效液相色谱仪由高压输液系统，进样系统，分离系统，检测系统和记录系统五大部分组成。
高压输液系统：主要是通过高压输液泵将溶剂储存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使试样在色谱柱中完成分离过程。
进样系统：把分析试样有效地送入色谱柱中进行分离。
分离系统：将试样各组分分离开来。
检测系统：对被分离组分的物理或物化特性有响应；对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应。
记录系统：记录被分离组分随时间变化的信号。
【16-3】液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比其主要区别何在？答：液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。
在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。
另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。
【16-4】何谓化学键合相色谱、正相色谱和反相色谱？答：化学键合相色谱是指在化学键合固定相上进行物质分离的一种液相色谱法。
正相色谱是采用极性键和固定相流的相用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂。
反相色谱采用非极性键和固定相流的相为强极性的溶剂。
【16-5】何谓化学键合固定相？它的突出优点是什么？答：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面形成的固定相称为化学键合固定相。
优点: 固定相表面没有液坑,比一般液体固定相传质快的多；无固定相流失,增加了色谱柱的稳定性及寿命；可以键合不同的官能团,能灵活地改变选择性,可应用与多种色谱类型及样品的分析；有利于梯度洗提,也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。
【16-6】什么叫梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同？答：梯度洗脱是指将两种或两种以上不同极性但可互溶的溶剂，随着时间的改变而按一定比例混合。
以连续改变色谱柱中淋洗液的极性，离子强度或pH等，从而改变被测组分的相对保留值、提高分离效率、加快分离速度的一种洗脱方式。
液相色谱中梯度淋洗和气象色谱中程序升温作用相同。
不同的是：在起诉相色谱中通过改变温度条件，达到高效快速分离目的；而液相色谱是通过改变流动相极性来达到目的。
【16-7】指出下列各种色谱法中最适宜分离物质。
（1）气液色谱；（2）正相色谱；（3）反相色谱；（4）离子交换色谱；（5）凝胶色谱；（6）气固色谱；（7）液固色谱。
答：（1）气液色谱：适宜分离气体或易挥发性液体和固体。
（或可转化为易挥发性液体和固体。
）（2）正相色谱：适宜分离极性化合物。
（3）反相色谱：适宜分离多环芳烃等低极性化合物。
（4）离子交换色谱：适宜分离离子型和可离解化合物。
（5）凝胶色谱：适宜分离大分子化合物，（分子量>2000）例蛋白质、氨基酸、核酸等生物大分子。
（6）气固色谱：适宜分离永久性气体及烃类化合物。
（7）液固色谱：适宜分离不同极性的化合物，或不同类型的化合物，特别适合分离异构体。
【16-8】指出下列化合物被液体流动相从氧化铝柱中洗脱的峰序：正丁醇、1-丁基氯、正己酸、正己烷、2-己烯。
答：正己烷，2-己烯，1-丁基氯，正丁醇，正己酸。
【16-9】指出下列化合物从氧化钙柱中流出的顺序：正丁醇、甲醇、正己醇、乙醇。
答：甲醇，乙醇，正丁醇，正己醇。
【16-10】指出下列物质在正相色谱中的洗脱顺序。
（1）正己烷，正己醇，苯；（2）乙酸乙酯，乙醚，硝基丁烷。
答：（1）正己烷，苯，正己醇（2）乙醚，硝基丁烷，乙酸乙酯【16-11】指出习题10中物质在反相色谱中的洗脱顺序。
答：（1）正己醇，苯，正己烷（2）乙酸乙酯，硝基丁烷，乙醚【16-12】指出下列离子从阴离子交换柱中流出的顺序：Cl-，I-，F-，Br-。
答：F-，Cl-，Br-，I-。
【16-13】预测下列离子从阳离子交换柱中流出的可能顺序：Ca2+，Ba2+，Mg2+，Be2+，Sr2+。
答：Be2+，Mg2+，Ca2+，Sr2+，Ba2+。
【16-14】相对分子质量约为120000的蛋白质在1根排阻极限为80000的凝胶柱上的保留体积为15mL，萘（MW128）在同1根柱上的保留体积为124mL，某特定试样组分的保留体积为87mL。
假定萘的相对分子质量小于凝胶的渗透极限，计算总孔容积和试样组分的分配系数。
答：109mL ，0.66【16-15】 用1根以二甲基甲酰胺作为流动相的排阻色谱柱检测聚氧化乙烯的保留体积，试利用表中结果估计保留体积为13.5mL 的聚氧化乙烯聚合物的相对分子质量。
相对分子质量 V /mL 相对分子质量 V /mL 1.1×103 17.2 7.7×104 14.1 5.1×103 16.3 7.0×10512.7 2.0×10415.1解：以相对分子量Mr 取对数logMr 作为纵坐标以保留体积V 为横坐标，求出斜率K341lg 5.110lg1.11016.317.(2)K ⨯⨯=－－10.744K =-442lg 7.710lg 2.01014.1 4.)3(K ⨯⨯=－－20.57K =－1220.657K K K =+=－ 保留体积为13.5mL 的相对分子质量lg7.0105lg 0(.65712.735)1.Mr ⨯=－－－ 解得52.110Mr =⨯ 【16-16】 为了解决下列分析课题，可否采用色谱法（应指出其具体的方法名称）？若不能采用，应当用哪些方法较为合理？（1）液体中的烯烃、炔烃和芳烃三族物质的分类和分析； （2）水溶液中甲酸、乙酸、丙酸和丁酸的总酸度的测定； （3）甲酸、乙酸、丙酸和丁酸混合物中含量的分别测定；（4）某工厂临时购得一批乙醇原料，其中含丙酮约为5%~10%，要求比较准确测出原料中丙酮的含量；（5）混合物中对、间、邻二甲苯含量的分别测定； （6）鉴定某一商品高聚物；（7）生物化学制品，如蛋白质、胆汁酸的分类分析； （8）空气中氟化氢、二氧化硫气体的分析；（9）氯化钾和氯化钠水溶液中两种正离子含量的分别测定； （10）钢铁中为了N 2、O 2、H 2的测定。
【16-17】 欲测定下列试样，采用哪种色谱法较为适宜？并指出所选用的固定相、流动相和检测器。
（1）（蒽）和（菲）；（2）CH3CH2OH和CH3CH2CH2OH；（3）Ba2+和Sr2+；（4）C4H9COOH和C5H11COOH；（5）高相对分子质量的葡糖苷；（6）苯和丁酮；（7）丁酮和乙醇；（8）正己烷、正庚烷、正辛烷和正癸烷；（9）分析苯中微量水分；（10）苯乙酮、苯、硝基苯；（11）苯、萘、联苯、菲、蒽；（12）ClOCOOC2H5HH和ClOCOOC2H5HH（13）F-、Cl-、Br-、NO3-；（14）乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸；（15）OH，OHCH3，OHCHO，OHClCl（16）N2和O2；（17）邻二甲苯、间二甲苯和对二甲苯。
解：部分答案如下表：【16-18】电渗流是如何产生的？讨论电渗流在毛细管电泳分类中的意义。
答：电渗现象中整体移动着的液体称为电渗流。
HPCE中通常使用石英作为毛细管材料，石英的等电点约为1.5，因此在常用缓冲溶液中(pH＞3)，管壁带负电，石英毛细管表面的硅羟基(≡SiOH)电离为硅氧基负离子(≡SiO-)，并将溶液中水合离子(一般为阳离子)吸附到毛细管表面附近，形成双电层。
当在毛细管两端加电压时，双电层中的阳离子向阴极移动，由于离子是溶剂化的，所以带动了毛细管中整体溶液向阴极移动，形成电渗流(EOF)。
电渗流在电泳分离过程中的有重要意义。
体现在：①使混合物中的正、负离子和中性分子产生差速迁移而实现分离；②通过EOF的大小和方向的控制，可以提高CE的分离效率、选择性和分离度。
【16-19】毛细管电泳有哪些主要分离模式？答：（1）毛细管区带电泳（CZE）将待分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。
中性组分彼此不能分离。
出峰时间称为迁移时间（tm），相当于高效液相色谱和气相色谱中的保留时间。
（2）毛细管凝胶电泳（CGE）在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶，这种方法主要用于分析蛋白质、DNA等生物大分子。
另外还可以利用聚合物溶液，如葡聚糖等的筛分作用进行分析，称为毛细管无胶筛分。
有时将它们统称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。
（3）毛细管等速电泳（CITP）采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移至各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。
（4）毛细管等电聚焦电泳（CIEF）将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自等电点（pI）时变为中性形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值的办法使溶质通过检测器。
（5）胶束电动毛细管色谱（MEKC或MECC）当操作缓冲液中加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂时表面活性剂就聚集形成胶束，其亲水端朝外憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分配系数存在差别而被分离。
（6）毛细管电色谱（CEC）将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液（有时再加辅助压力）进行分离。
【16-20】试比较毛细管电泳与高效液相色谱方法。
高效毛细管电泳仪（HPCE）是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，利用荷电粒子之间的淌度差异和分配系数差异进行分离，是分析科学继高效液相色谱仪（HPLC）之后的又一重大进展，使分析科学从微升级进入到了纳升级水平，不仅使单细胞乃至单分子分析成为可能，也使蛋白质和核酸等生物大分子分析有了新的转机。
