纤维素酶稳定性的研究

纤维素酶稳定性的研究一．背景介绍纤维素是地球上最丰富、最廉价的再生资源。

有资料表明 ,全世界每年的植物体生成量达1500亿吨干物质 ,其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨。

纤维素的基本单位是葡萄糖 ,但由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造 ,其外围又被木质素包围着 ,要把它水解成可利用的葡萄糖非常困难。

所以到目前为止仍没有得到很好地利用。

当前 ,新能源、新食品资源的开发利用是世界各国都在研究的重大课题 ,因此 ,纤维素酶的研究成为其主要组成部分。

纤维素是一种多糖, 是葡萄糖以β- 1,4-糖苷键结合的聚合物, 在自然界中储量极其丰富, 在纤维素酶的催化条件下可分解产生二糖或葡萄糖, 纤维素的利用目前尚未完全开发, 造成资源及能源的巨大浪费。

为了更好地利用纤维素, 愈来愈多的国内外学者开始关注纤维素酶的研究与应用, 期望能借助纤维素酶将地球上最丰富(占全球总生物量 80%)、最廉价的可再生资源纤维素转化为能直接利用的能源和资源。

现在纤维素酶的应用已扩展到食品发酵、医药、纺织、日用化工、造纸、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域, 其应用前景十分广阔。

[1]1. 纤维素酶的组成纤维素酶是指 3种起协同作用的一组酶的总称 ,现已确定纤维素酶主要组分如下: 内切型葡聚糖苷酶、外切型葡萄糖苷酶、纤维二糖酶。

[2]2. 纤维素酶的特性2.1 内切型葡聚糖苷酶也称 Cx酶、CMC酶。

它以随机的形式在纤维素聚合物内部的非结晶区进行切割 ,对末端键的敏感性比间键小。

其主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖等带非还原性末端的小分子纤维素。

[2]2.2 外切型葡萄糖苷酶又叫纤维二糖水解酶或微晶纤维素酶。

该酶在天然纤维素的降解过程中起主导作用 ,它能从纤维素链的还原或非还原性末端切割糖苷键 ,生成可溶的纤维糊精和纤维二糖。

[2] 2.3 纤维二糖酶也称β2 葡萄糖苷酶 ,简称 BG。

它能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖。

内切酶首先切割纤维素链使暴露出末端 ,然后外切酶连续切割纤维二糖单位 ,而β2 葡萄糖苷酶通过水解纤维二糖或纤维糊精完成协同反应全过程。

[2]3 纤维素酶的作用机理研究人员对纤维素酶使纤维素转化为葡萄糖的过程提出了不同看法。

1950 年 Reese 对纤维素酶的作用方式提出了著名的 C1- Cx假说, 并得到大多数人的支持。

C1-Cx理论要点是 C1酶首先作用于结晶纤维素, 使其改变成可被 Cx酶作用的形式, Cx酶随机水解非结晶纤维素, 即可溶性纤维衍生物和葡萄糖的β - 1, 4- 寡聚糖, β - 葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖 ( 如图所示)。

上述的 C1和 Cx分阶段水解纤维素的理论在以后的实验中没得到证实。

若先用 C1酶作用结晶纤维素, 然后将 Cx酶与底物分开再加入 Cx酶, 如此顺序作用并不能将结晶纤维素水解, 只有当 C1、 Cx以及β - 葡萄糖苷酶同时存在才能水解天然纤维素。

对于纤维素酶的作用机理,目前尚不十分明了, 有待进一步研究。

[1][2]4 纤维素酶的热稳定性的研究4.1 酶热失活中的动力学与热力学酶的动力学研究中一般只考虑初始反应速率及可逆反应，但在酶的应用及工艺设计时，酶的失活速率就显得十分重要，特别是在连续流动的酶反应过程中，过程的经济可行性往往取决于酶的使用寿命。

在失活动力学研究中，对于温度和失活速率常数之间的关系，可以用Arrhenius关系式：0exp(/)ak k E RT=-（1-2）许多酶的失活反应在一定温度范围内都服从Arrhenius关系。

因此，在ln k～1/T图上可以获得频率因子k0和失活活化能E a。

但应该强调的是，对酶失活反应而言，往往只在很小的温度范围内满足Arrhenius关系。

基于酶的蛋白质本性，许多酶在45～50℃就会部分变性，在55℃时变性已经很严重了，会造成蛋白质球形结构的破坏，使酶活性迅速下降。

因此，在研究较宽范围内酶的失活动力学时，不能简单的依靠Arrhenius关系式。

酶的热失活可能是可逆的、不可逆的或介于两者之间，根据平衡模型，在失活的初始阶段，存在一个简单的可逆过程，可以描述广泛温度范围内的酶失活动力学和活性的关系。

在天然条件下，蛋白质折叠可以是自发进行的，根据热力学原理，蛋白质折叠是自由能减少过程，即折叠过程的自由能变化为负值。

在高温和低温条件下，失活的自由能都可能为正值，此时去折叠过程是自发的。

热力学参数是判断失活过程能否发生的基本物理参数。

[1][2] 热引起酶失活首先使蛋白质分子构象改变而伸展，随时丧失生物活性。

该变形过程可用下述方法测定，圆二色性、光旋度、差失扫描量热法、随加热测量pH的变化以及加热后测量剩余活力等。

[3]4.2 影响纤维素酶热稳定性的因素酶的化学本质是在氨基酸顺序排列成一级结构的基础上，通过氢键、盐键、疏水作用和静电作用等次级键再折叠成对活性发挥关键作用的二、三级结构(构象)的存在。

因此，通过改变酶的内在氨基酸结构和外界化学微环境可影响酶的构象而提高其热稳定性。

随着细胞工程、基因工程、固定化技术的兴起，纤维素酶的研究特别是对提高纤维素酶的活性和稳定性等方面也取得长足进展。

如今提高纤维素酶热稳定性方法有：（1）改良菌种及培养条件对纤维素酶的稳定性的影响日本花王公司的组成型碱性纤维素酶产生菌—嗜碱性芽孢杆菌 KSM2635的研究进展最为显著,他们分别用非纤维素碳源如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等作为碳源,可使酶活由1194U/mL 提高到 3198U/mL;用半连续培养法,在菌体生长对数期或延滞期,把30%～9919%的培养液用新鲜培养液取代,到第八批连续培养时,酶活达到了4165U/mL～5176U/mL;在培养液中添加015 %的木聚糖,30℃培养3d,使酶活由212U/mL提高到6127U/mL;以抗生素万古霉素、瑞斯托菌素作为筛子, 用甲基磺酸乙酯、亚硝基胍等诱变剂进行诱变处理,筛选抗性菌株,使酶活由 4128U/mL～4159U/mL提高到1618U/mL～20105U/mL。

并且木村曦晴还发现在培养基中添加3×1028g/L～100×1028g/L含铁无机盐或300×1028g/L肌红蛋白,能使酶活力由20U/mL提高到40U/mL～60U/mL,该酶活是迄今为止相关文献中报道的最高的。

[4]（2）表面活性剂对纤维素酶的稳定性的影响表面活性剂对纤维素酶活性的影响程度，依其离子型大概可以排序为：阳离子表面活性剂>阴离子表面活性剂>两性表面活性剂>非离子表面活性剂。

不同表面活性剂对酶活性的影响方向及程度不同，一方面受制于表面活性剂电性的影响，纤维素酶是蛋白质，本身是带有一定电荷的高分子物质，与荷电的表面活性剂可能相互吸引或排斥，可能由此改变酶的空间结构等从而改变纤维素酶活性，而表面活性剂所带电荷的性质和数量除受处理液 pH 影响外，同时受到表面活性剂离子型的影响，即便是同类型的表面活性剂其解离情况也不同，这大概是非离子型表面活性剂对酶活性一般不产生明显抑制的原因。

另一方面表面活性剂影响纤维素酶作用的基材、纤维素纤维（织物）表面的荷电、膨润和表面状态，对酶在纤维上的平衡吸附产生影响从而影响酶处理的最终结果。

同时，表面活性剂的胶束对表面活性剂的影响也在逐步得到证实，表面活性剂的浓度不同对酶活性的影响不同这一点可以基本肯定，或许可通过调控表面活性剂浓度实现纤维素酶活性的调控。

研究结果表明纺织工业中常用非离子表面活性剂对纤维素酶没有抑制作用，有些对酶还有激活作用。

李明与徐秀雯（1996 年）用JFC 和平平加 O、吐温 80 及聚乙二醇的实验显示，当非离子表面活性剂浓度在 0.1%、0.8 时，是纤维素酶的激活剂。

[5][6](3)染料对纤维素酶稳定性的影响染料对纤维素酶活性的影响程度，可排序为阳离子染料、阴离子、还原染料，当然还与酶处理的工艺流程等等因素有关。

染料与表面活性剂同样，溶液中的染料对酶的影响也可能具有双向性，一方面荷电的染料与酶可相互吸引或排斥；另外可与织物结合减少酶作用位点，如具有刚性结构和较高的分子量还会对酶向织物的扩散及吸附产生空间位阻作用染料没有表面活性不会降低织物的表面张力，因此吸附并结合在织物上的染料对酶的影响基本属于负向性。

[5][6]（4）不同糖类对纤维素酶稳定性的影响实验研究了海藻糖、葡聚糖、葡萄糖和蔗糖对纤维素酶的保护作用, 并对它们在不同温度下的作用效果进行了比较, 研究发现:在 20℃下海藻糖和葡萄糖对纤维素酶的活性都有同样好的保护作用, 蔗糖次之, 葡聚糖几乎没有保护作用。

[7]温度升高, 葡萄糖和蔗糖对纤维素酶活性的保护作用减弱, 破坏作用增大。

在85℃高温下, 酶的活性几乎完全丧失。

相反葡聚糖在高温下对酶表现出较强的保护能力, 海藻糖也有较好的保护作用, 但比葡聚糖稍差。

[7]糖保护酶活的机理可能是: 在低温下葡萄糖的羟基代替水分子同蛋白质表面分子作用, 可以防止酶的失活。

在高温下葡聚糖会在酶蛋白分子的周围形成玻璃态, 从而保护酶分子免受失水所带来的损伤。

海藻糖有效保护酶活性的机理可能是: 一方面海藻糖的羟基替代水分子同酶分子表面结合,另一方面海藻糖以分子的形式填充到酶蛋白的空隙中, 干燥脱水后海藻糖呈玻璃态, 将酶分子支撑和包裹起来。

在这两种机理的共同作用下, 海藻糖能在较宽的温度范围内, 有效地防止蛋白质分子发生三维结构的变化, 使酶避免失活。

[7][8] （5)环境因素对纤维素酶热稳定性的影响不同PH值对纤维素酶活力的影响：酸性纤维素酶活力在 PH值为 4.85 条件下最大，低于4.85 时活力下降较小但大于4.85 时活力下降较快， PH为7.5 时有的纤维素酶几乎全部失活。

碱性纤维素酶在PH6.0时活力最大 7.2不同温度对纤维素酶活力的影响，实验得出：酸性纤维素酶最适宜的PH值为 4.85，温度为 60℃或65℃碱性纤维素酶最适宜的 PH 值为 6.0，温度为60℃或65℃。

[9][10][11]不同的盐，如氯化钡，氯化钙，氯化镁，氯化锂，氯化钠和氯化钾在不同浓度对纤维素酶的稳定性影响不同，纤维素酶的稳定性随这些单价离子结合两种浓度的水的能力增加而增加。

研究得出酶活性是由各种离子的动力学能力支持的。

来自绿色木霉的纤维素酶活性的最佳温度为55~60 ℃，以及要求单价阳离子以便得到最佳活性和稳定性。

[14]K+、 NH4+、 Ca2+、 SO4 2 -、 HPO42 -通过影响水分子作用 ,和相邻残基形成离子键、配位键起到类似二硫键的桥连作用 ,从而稳定酶分子的三维结构。

某些底物分子也可以通过稳定酶分子的活性位点来使其适应高温环境。