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原生质体诱变选育高纤维素酶活性枯草芽孢杆菌的研究谢凤行;张峰峰;周可;赵玉洁;刘韵娅【摘要】采用紫外诱变、化学诱变(DES诱变)及复合诱变的方法对产纤维素酶枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B6的原生质体进行诱变,选育出10个高纤维酶活突变株.摇瓶发酵试验结果表明,所选突变株酶活都显著高于B6,其中,紫外诱变处理的突变株Z12,化学诱变得到的突变株H1以及复合诱变处理的突变株F12的产酶能力相对较强,且产酶能力稳定,酶活值分别为448.3,450.9,491.8 U/mL,分别为对照的176%,178%,194%.试验结果说明,对枯草芽孢杆菌的原生质进行诱变可以提高菌株产纤维素酶的能力,而原生质体的复合诱变可提高诱变效应.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2010(025)005【总页数】4页(P211-214)【关键词】枯草芽孢杆菌;原生质体;紫外诱变;化学诱变;复合诱变;纤维素酶【作者】谢凤行;张峰峰;周可;赵玉洁;刘韵娅【作者单位】天津市农业生物技术研究中心,天津,300192;天津市农业生物技术研究中心,天津,300192;天津市农业生物技术研究中心,天津,300192;天津市农业生物技术研究中心,天津,300192;天津农学院,天津,300384【正文语种】中文【中图分类】Q933纤维素是植物纤维的主要成分，占其干质量的30%～50%，而所有动物生产都是以植物性日粮为基础，大量未被消化吸收的纤维素随粪便排到体外，造成巨大的资源浪费和环境污染。
纤维素酶是一类将纤维素水解成葡萄糖的酶的统称，它可破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用；同时，又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率[1]。
纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌和放线菌等，细菌中的芽孢杆菌由于具有环境适应性强、对温度和pH的耐受范围广、能在动物肠道内定殖调节肠道菌群平衡、提高机体的免疫力等优点，越来越受到人们的关注[2]。
写一篇近年来纤维素酶研究的进展的报告，600字
近年来，随着生物科学技术迅速发展，纤维素酶研究获得了长足的发展。
从2014年开始，研究者对纤维素酶的研究已经经
历了一个快速发展过程，他们找到了更多由细菌、真菌、植物和动物分泌出的纤维素酶，以及许多新发现的相关基因编码的纤维素酶。
首先，在过去的几年中，研究者发现了大量的细菌分泌的纤维素酶，并建立了一套分类体系，包括不同的组成单位、细螺旋结构、催化水解机制，以及不同的应用。
其次，研究者研究出了一些新的真菌分泌的纤维素酶，这些纤维素酶可以更好地解决人类工业和环境问题，其中包括果蔬纤维溶解酶、碳源利用酶等。
此外，研究者还发现了一些新型纤维素酶，例如哺乳动物纤维素酶，这些酶具有更高的水解效率，可以更好地利用纤维素消化产物，从而提高动物营养价值。
最后，近年来研究者还开始发展更先进的纤维素酶技术，例如表观遗传学技术和重组DNA技术，以指导酶催化剂的设计和
应用。
这些新技术有助于我们更好地了解和应用纤维素酶结构，提高酶水解效率，拓展纤维素酶的应用前景。
总之，在近几年的发展过程中，纤维素酶研究技术取得了长足的进步。
许多新的纤维素酶和技术已经被发现并应用，这些都为我们理解纤维素酶的结构和功能，改善纤维素酶的水解效率，和拓展纤维素酶研究和应用提供了许多有价值的信息。
论产纤维素酶黑曲霉菌的探究进展作为地球上含量最为丰富，分布最为广泛的可再生生物质资源，纤维素的开发与利用对于解决能源危机、环境污染、粮食资源紧张等问题意义重大。
纤维素由D - 葡萄糖分子以beta; - 1，4 糖苷键组成的大分子多糖，其分子结构结晶度与聚合度高，需要利用纤维素酶的水解作用，将其降解成为单糖，继而进行纤维素的合理利用与转化。
纤维素酶是一组复合酶系，通过多种酶的协同作用水解降解纤维素，纤维素酶主要来源于可产纤维素酶的细菌和真菌。
其中，由于丝状真菌纤维素酶产量高于细菌和酵母菌等真菌，被广泛应用于纤维素酶产业化生产。
作为丝状真菌中的一员，黑曲霉菌高产纤维素酶，且安全、无毒素，在产纤维素酶微生物研究领域，黑曲霉菌是开发、利用最为广泛的真菌之一。
近年来，在高产纤维素酶微生物，发酵产酶工艺，应用领域等方面国内外均开展了相关研究，且取得了一定的进展。
1 纤维素酶的组成与催化机制纤维素酶是由三种不同酶组成的复合酶系，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二塘水解酶、beta; - 葡萄糖苷酶。
三种酶通过协同作用将纤维素降解为寡糖和纤维二塘，并最终水解为葡萄糖。
内切葡聚糖酶主要作用于纤维素分子的非结晶区，随机水解beta; - 1，4 糖苷键并产生大量带有非还原末端的小分子纤维，此外，也能水解纤维素的某些基团取代产物，如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素等。
外切葡聚糖酶主要作用于微晶纤维素分子的还原端和非还原端，水解beta; - 1，4 糖苷键，从而裂解下二糖分子。
beta; - 葡萄糖苷酶可将纤维二糖和其他可溶性寡糖水解为葡萄糖。
2 产纤维素酶微生物产纤维素酶的微生物主要包括细菌、真菌和放线菌。
放线菌和细菌纤维素酶产量相对较低，放线菌生长缓慢，相关研究较少，细菌纤维素酶多为内切葡聚糖酶，对结晶纤维素无活性，且分离难度较大，影响其产业化开发。
高产纤维素酶的真菌主要包括曲霉菌属、木霉菌属、青霉菌属、镰孢菌属和枝顶孢雄属等。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展近年来，随着对可再生能源的需求增加，纤维素酶作为生物质能源转化的重要酶类受到了广泛关注。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究成为了热点和难点，本文将以此为核心，对其研究进展进行综述。
1. 产纤维素酶菌的研究目前已发现的产纤维素酶菌主要包括枯草芽孢杆菌、放线菌、真菌等。
其中，枯草芽孢杆菌是目前被广泛应用于纤维素酶生产的菌种之一，因为其产酶量高、生长速度快、生长条件较为简单等特点而备受青睐。
同时，枯草芽孢杆菌的基因组测序也为其分子遗传学和代谢分析等研究提供了可能。
除枯草芽孢杆菌外，还有放线菌属和糯米壳属等菌种也被报道能够分泌纤维素酶。
这些菌株相对于枯草芽孢杆菌的优点在于产酶能力更强，而缺点在于生长周期长、生长条件较苛刻，且在发酵过程中容易受到杂菌的污染等。
因此，在生产实践中，不同菌种或不同菌株的选择需要根据具体情况进行。
2.1 筛选纤维素酶的筛选方法主要有传统筛选和高通量筛选两种。
传统筛选方法常常是采用纤维素颗粒为基质，利用纤维素降解能力较强的菌株筛选；或者采用含有纤维素的大量自然产物、如木屑等物质进行筛选。
此外，还有利用血红蛋白作为指示物的筛选方法。
这些方法的优点在于操作简单易行，且与实际应用环境接近，但筛选效率较低、筛选速度较慢。
高通量筛选方法是近年来发展起来的一种新型筛选方法。
该方法利用微流控技术，快速筛选出高效纤维素酶生产菌株，并能够评估其酶的活力和稳定性。
同时，还可以利用基因工程手段进行优化，以提高酶的产量和稳定性。
该方法具有快速、高效、高精度等优点，可以大大缩短筛选周期和降低筛选成本。
2.2 改良为了提高纤维素酶的产量和性能，研究人员采用了多种改良方法，包括物理改良、化学改良和基因工程改良等。
物理改良是利用辐射、超声波、高压等物理手段对纤维素酶生产菌株进行改良。
该方法具有操作简单、安全易行、无毒副作用等优点，但改良效果不一定理想。
化学改良主要是利用化学物质处理菌株，使其产生变异，进而产生更高产的纤维素酶。
课程论文课题名称纤维素酶产生菌的研究进展专业名称2013级生物工程学生姓名付燕指导教师高健2016年4月10日内容摘要 (2)目录1.纤维素酶的研究概况 (2)1.1纤维素酶的来源 (2)1.2纤维素酶的种类 (2)2纤维素酶产生菌选育的研究进展 (2)3培养体系的优化 (3)3.1碳源的作用 (3)3.2氮源的作用 (4)3.3表面活性剂 (4)4培养条件的优化 (4)4.1温度的影响 (4)4.2 pH的影响 (5)4.3溶氧量的影响 (5)5.菌种改造 (5)5.1物理诱变 (6)5.2化学诱变 (6)5.3基因工程法 (6)6.结语 (7)摘要纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖。
该酶在解决当前世界面临的能源、粮食、环境污染等危机方面具有重要意义。
然而，迄今为止纤维素酶活和产率均较低、生产周期长、成本高，都严重地阻碍其工业化的应用。
纤维素的降解有赖于纤维素酶。
自然界中很多微生·物可以产生纤维素酶。
因此，如何提高纤维素产生菌产酶能力是近年来研究的热点。
近年来，国内外对细菌、真菌等产纤维素酶的微生物进行了大量的研究，利用化学、物理以及紫外诱变等方法获得了大量纤维素酶高产菌株。
本文对国内外选育纤维素酶高产菌的研究以及利用木霉等菌产纤维素酶、产纤维素酶菌种选育、混合菌产纤维素酶等方面的研究进展进行了综述。
关键词纤维素酶；纤维素；微生物；培养体系；培养条件；菌种改造纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源，据估计，纤维素生成量每年高达1 000亿吨。
我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。
纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。
但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限，目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展产纤维素酶菌是一类能够分解纤维素的微生物。
纤维素酶具有重要的工业应用价值，可以用于生产生物燃料、食品添加剂、饲料酶和纸浆加工等。
研究纤维素酶菌及其筛选改良方法对于提高纤维素酶的产量和活性具有重要意义。
纤维素酶菌主要包括细菌、真菌和原生动物等。
细菌是目前研究的重点，主要有属于泛菌纲的革兰氏阴性细菌和厌氧细菌、属于革兰氏阳性细菌的放线菌等。
真菌中的木霉属和曲霉属是常见的纤维素酶产生菌。
原生动物中的淀粉硬蛋白原核为革兰氏阳性细菌，同样具有较高的纤维素酶产生能力。
纤维素酶菌的筛选方法可以分为传统筛选和基因工程筛选两大类。
传统筛选主要通过菌落特征、纤维素酶活力和酶促介质分析等方法来确定纤维素酶产生菌。
基因工程筛选主要利用纤维素酶基因在基因库中的表达情况进行筛选。
目前，纤维素酶菌的改良方法主要包括传统遗传改良和基因工程改良两种。
传统遗传改良主要包括辐射诱变、化学诱变和选择性培养等方法。
辐射诱变是通过辐射来引发细菌基因突变，从而获得新的纤维素酶产生菌。
化学诱变则是通过化学物质来诱发细菌基因的突变。
选择性培养是在特定的培养基中培养纤维素酶产生菌，然后通过对菌群的筛选来获得高产菌株。
基因工程改良主要是通过将高效纤维素酶基因导入到微生物中，从而提高纤维素酶的产量和活性。
常用的基因工程改良方法包括限制性酶切、DNA连接、转化和表达等。
限制性酶切是通过酶切酶将目标基因切割成特定长度的DNA片段。
DNA连接是将目标基因片段连接到载体DNA上，形成重组DNA。
转化则是将重组DNA导入到宿主细胞中。
表达是使宿主细胞能够表达目标基因所编码的纤维素酶。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究进展主要包括纤维素酶菌的分类研究和筛选方法的改良研究。
通过对纤维素酶菌的筛选和改良，可以提高纤维素酶的产量和活性，为纤维素酶的工业应用提供技术支持。
未来的研究将更加注重基因工程筛选和改良方法的研究，以提高纤维素酶的产量和活性。
第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年3月 Vol. 27 No.2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2005────────── 收稿日期：2004-10-20作者简介：高凤菊（1978-），女，河北乐亭人，四川农业大学生命科学学院硕士研究生。
- 7 -真菌与细菌纤维素酶研究进展高凤菊1，李春香2（1.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014；2.唐山师范学院 生物系，河北 唐山 063000）摘 要：对分解纤维素真菌及细菌的种类，纤维素酶的组成和分类，分子结构、作用机理，纤维素酶基因工程及研究展望进行了综述。
关键词：真菌；细菌；纤维素酶中图分类号：Q556+.2 文献标识码：B 文章编号：1009-9115（2005）02-0007-04资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。
生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用的产物高达1.5×1011~2.0×1011t ，是人类社会赖以生存的基本物质来源。
其中90％以上为木质纤维素类物质，[1]其中的纤维素是地球上最丰富的多糖物质，[2]这类物质是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。
我国的纤维素资源极为丰富，每年农作物秸秆的产量达5.7×108t ，约相当于我国北方草原年打草量的50倍。
目前这部分资源尚未得到充分的开发利用，主要用于燃料，畜牧饲料与积肥，不仅利用率低，还对环境造成一定的污染。
[3]随着世界人口迅速增长、粮食、矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重大的现实意义和光明的发展前景。
在自然界中，许多霉菌[4]和细菌[5]都能产生纤维素酶，但有关细菌纤维素酶的报道很少。
由细菌所产生的纤维素酶一般最适中性至偏碱性，因为这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。
近十几年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。
[6][7][8] 1 纤维素分解微生物1.1 纤维素分解性细菌 (cellulose decomposingbacteria )纤维素分解性细菌是能分解纤维素的细菌。
由于纤维素酶等的作用，纤维素可一直被分解到葡萄糖为止，有时在分解过程中会积累纤维二糖。
这类细菌多见于腐植土中。
好氧性细菌如纤维单胞菌属（Cellulomonas ）、纤维弧菌属（Cellvibrio ）、噬胞菌属（Cytophaga ）等能分解纤维素；但在好氧条件下土壤中纤维素的分解，主要是纤维素分解真菌在起作用。
而在厌氧条件下纤维素的分解，一些厌氧性的芽孢梭菌属（Clostridium ）的细菌具有重要作用。
纤维素分解细菌亦可栖息于草食动物的消化道、特别是反刍动物的瘤胃中。
它们在其中进行分解纤维素的活动，这些细菌是厌氧性细菌，例如产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides succinogenes ）、牛黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens ）、白色瘤胃球菌（R.albus ）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens ）（程光胜 译）等。
细菌纤维素酶多数结合在细胞膜上，菌体细胞需吸附在纤维素上才能起作用，使用很不方便，酶的分离提取也较困难。
但是细菌主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶。
碱性纤维素酶由于在洗涤剂工业中有良好的应用价值，也成为研究热点，其产生菌主要集中在芽孢杆菌属[9]。
由于酶的耐热性在生产中具有现实意义，所以耐热细菌也是研究的热点。
1.2 纤维素分解性真菌真菌类有黑曲霉、血红栓菌、卧孔属、疣孢漆斑菌QM460、绳状青霉、变幻青霉、变色多空霉、乳齿耙菌、腐皮镰孢、绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、嗜热毛壳菌QM9381和嗜热子囊菌QM9383等[10]；丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物。
真菌纤维素酶通常是胞外酶，酶被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。
目前饲用纤第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年第2期 - 8 -维素酶的生产多采用真菌，其中木霉纤维素酶产量高、酶系全，故而被广泛应用。
2 纤维素酶的组成及分类纤维素酶是一种多组分的酶系，采用各种层析、电泳等技术可将纤维素酶分成不同的组分。
此酶指的是能降解纤维素β-1，4-葡萄糖苷键的一类酶的总称，因此纤维素酶又有纤维素酶复合物之称，是一个由多种水解酶组成的复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。
纤维素酶的组成与分类有两种主要的分类形式。
第一种分类方法是根据各酶功能的不同主要分为三类：（Ⅰ）葡聚糖内切酶（EC3.2.1.4，1，4-β-D-glucan glucanohydrolase 或endo-1，4-β-D-glucanase ，来自于真菌简称为EG ；来自于细菌简称为Len ），此酶又称Cx 酶（Cx enzyme ）、CMC 酶（羧甲基纤维素酶）（carboxymethyl cellulase ），缩写为EC ：3。
（Ⅱ）葡聚糖外切酶（1，4-β-D-glucan cellobilhydrolase 或exo-1，4-β-D-glucanase ，EC3.2.1.91，来自于真菌简称Cbh ；来自于细菌简称Cex ），此酶又称C 1酶（C 1enzyme ）、微晶纤维素酶（avicelase ）、纤维二糖水解酶（cellobihyddrolase ），缩写为：CHB ：2。
（Ⅲ）β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21，β-1，4-glucosidase 或glycosidase ），又称为纤维二糖酶（cellobiase ），缩写为：BG ，这类酶将纤维二糖和短链纤维寡糖水解成葡萄糖分子。
对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。
该酶的专一性差，实际上可作用于所有的葡萄糖β-二聚物。
[11]第二类通常认为主要包括C 1酶、C X 酶和β-葡萄糖苷酶。
C 1酶主要作用天然纤维素，将其转变成水合非结晶纤维素；C X 酶又可分为C X1酶和C X2酶，C X1酶是内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-1，4-葡萄糖苷键，生成纤维糊精和纤维二糖，C X2酶为外断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子的非还原性末端作用于β-1，4-葡萄糖苷键，逐步切断β-1，4-糖苷键生成葡萄糖。
纤维二糖酶又称β-葡萄糖苷酶，其作用于纤维二糖，生成葡萄糖。
这些酶协同作用可将纤维素彻底降解为还原糖——葡萄糖。
[12][13] 3 纤维素酶的分子结构纤维素酶分子是由球状的催化结构域Catalytic Domain （CD ）通过一个富含脯氨酸或羟基氨基酸的连接桥（Linker ）和没有催化作用纤维素结合结构域，被称为Cellulose Binding Domain （CBD ）三部分组成。
纤维素酶分子的催化结构域（CD ），主要体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。
内切酶的活性位点位于一个开放的裂口（cleft ）中，它可结合在纤维素链的任何部位并切断纤维素链。
外切酶的活性位点位于一个长环状通道中，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。
纤维素结合结构域（CBD ）在纤维素酶中位于肽链的氨基端或羧基端，通过连接桥与催化结构域相连。
纤维素结合结构域不具备水解纤维素的功能，但有助于纤维素酶与底物的结合，它的三维结构极其复杂，对酶的催化活力起决定作用。
人们推测，CBD 可能通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由CBD 上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链从纤维素表面脱离开来，以利于催化区的水解作用。
但有一些纤维素酶并没有CBD ，如热纤梭菌是依靠纤维素酶系中的纤维小体(celluosome)吸附纤维素的。
CBD 执行着调节酶对可溶和非可溶性底物专一性活力的作用，对酶的催化活力是非常必需的。
CBD 是一面亲水，另一面疏水的楔形结构，能插入和分开纤维素的结晶区，在其吸附于纤维素分子链表面后，酶分子连接到纤维素上，可能提高了底物表面有效酶的浓度，或者可能促进了纤维素表面单个葡聚糖链的增溶溶解，具有疏解纤维素链的作用。
不同的CBD 以不同的拓扑学结构与结晶纤维素结合，都具有相似的刚性支柱结构，以便进行识别和结合所需的侧链能正确定位。
[14]连接桥（Linker ）是一段相当长、高度糖基化的连接肽，此区大多富含脯氨酸和羟脯氨酸，它的作用可能是保持CD 和CBD 之间的距离；有助于同酶分子间形成较为稳定的聚集体。
[15]虽然真菌和细菌产生的纤维素酶分子差别很大，但它们的催化区在一级结构上氨基酸数量和三维结构上的大小却基本一致。
但它们的Linker 和CBD 却存在明显的差异。
真菌和细菌来源的纤维素酶的CBD 的三维结构也得到了解析，真菌CBD 由33－36个氨基酸组成，且具有高度的同源，而细菌由100－110个氨基酸组成，同源性较低。
真菌的外切酶的CBD 的结构形状呈“楔型”，一面亲水，另一面疏水；结构中芳香族氨基酸只有3个Tyr ，它们位于平坦的亲水面，执行吸附纤维素的功能；细菌外切酶的CBD 很大，且包含很多芳香族氨基酸，它们中的Trp54和Trp72暴露于蛋白分子表面，执行吸附功能。
细菌纤维素酶linker 富含Pro 和Thr ，完全由Pro-Thr 这样的重复顺序组成，而真菌的纤维素酶linker 富含Gly ，Ser 和Thr 。
不同维素酶linker 的糖高凤菊，李春香：真菌与细菌纤维素酶研究进展- 9 -基化程度和糖链也不同，糖化不是纤维素酶活力所必需的。
在高级结构的分子形状上，细菌纤维素酶CD 与CBD 夹角为135°；真菌纤维素酶CD 与CBD 夹角为180°[17][18][19]。
有限酶切时，真菌纤维素酶只具有一个酶切位点，在靠近CD 与连接桥边结区，酶切时可将CBD 与连接桥一并切去；而细菌的外切酶具有两个酶切位点，有限酶切时，可将CBD 和连接桥分别切去。
[15]4 纤维素酶对纤维素的作用机理1950年，Reese 等曾阐明没有一种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维素的酶，但发现有的菌株生产的酶能分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素，因而提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的C 1—Cx 假说。
其中C 1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区，使氢键破裂，呈无定形可溶态，再由Cx 催化它们形成纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。
