【精品】实验四 土壤微生物的分离和计数

土壤微生物的分离与平板菌落计数实验二土壤微生物的分离与平板菌落计数一、实验目的(1)几种常用分离纯化微生物的基本操作技术(2)掌握倒平板(3)学习平板菌落计数的基本原理和方法二.实验原理微生物的分离与纯化是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。

分离纯化微生物的常用方法有平板表面画线法、平板表面涂布法和琼脂培养基浇注法等，因为其方法简单、设备简单、分离效果好，所以一直被实验室普遍选用。

活菌计数的基本方法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

三.实验器材1.材料:土壤2.培养基:牛肉膏蛋白胨培养基3.仪器或其他用具:无菌培养皿，盛有9ml无菌水的试管，1ml移液器，玻璃涂布器，恒温培养箱四.实验步骤(一)采样取表层以下5-10cm处的土样，放入灭菌的袋中备用，或放在4 ?冰箱中暂存。

(二)倒平板(无菌操作)培养基加热溶化，待冷至55-60? ，然后在无菌操作条件下倒入培养基于无菌培养皿中，并在各培养皿上作好标记。

(三)制备土壤稀释液(无菌操作)1.制备土壤悬液用电子天平称取 5g土于装有45ml无菌水的三角瓶中，振摇约20min,使土壤与水充分混匀2.梯度稀释取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管，以此类推制成10-1 、10-2、10-3等不同稀释度的土壤溶液。

(四)平板分离单菌落(无菌操作)选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌的土壤悬液，在酒精灯旁进行划线操作，用左手控制培养皿，右手捏接种环，在标记处划3-4条连续的平行线作当作初步稀释的菌源。

烧去接种环上的残余菌样。

将烧去残余菌样后的接种环在平板培养基边缘冷却以下，然后将培养基另一区转至划线位置，将接种环通过菌源区而移至现在的划线区，依次类推划上几次。

土壤微生物别离纯化及测数土壤微生物|别离纯化及测数来源：生物秀时间：2021-5-28一、实验目的要求了解土壤微生物的别离纯化及测数的根本原理。

学习并掌握微生物别离纯化技术方法。

学习并掌握微生物平板菌落计数的技术方法。

二、根本原理土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过别离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。

根本原理是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。

三、实验步骤〔一〕土壤样品采集在待测田块上，假设田块面积小于50平方米那么按对角线三点采样，假设田块面积大于50平方米按对角线五点采样。

采样一般定点于耕作层0--20cm，先除去表土 1--2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。

〔二〕好气性细菌的别离纯化及测数1.制备土样稀释液吹吸三次混匀无菌操作另留一管不稀释留作对照〔C K〕2.培养基的准备融化牛肉膏蛋白胨培养基，融化后保温在48℃。

并取6个无菌培养皿，分别在皿底贴好标签，注明10-5、10-6、CK〔每个稀释度要两个平行皿，对照要两个平行皿〕。

3.倾注法接种先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中〔每个平皿接入1ml〕，再向每个平皿倾注约15ml的牛肉膏蛋白胨培养基〔48℃〕待冷凝，混合均匀。

4.保温培养将已经接种的平皿静置10min后，放入温箱倒置培养3--5日〔30℃〕，观察结果。

5.分区划线法纯化平板划线别离，其划线方法有以下两种：6.计数要求30~300之间计数。

CK除外。

每克湿土样细菌数量＝平均菌落数×稀释倍数土壤样品水分系数1∕〔1—样品水分百分数〕土壤样品细菌数量〔个∕克干土〕＝每克湿土样细菌数量×样品水分系数四实验报告及思考题记录计数结果并计算土壤样品含菌数。

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数：1．分离菌株的思路(1)自然界中目的菌株的筛选①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq 细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度.pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。

缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物②方法：能合成脲酶的细菌才能分解尿素。

配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。

2．统计菌落数目的方法(1)稀释涂布平板法（间接）①当样品的稀释庋足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

②通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的活菌数。

(2)利用显微镜直接计数3．分解尿素的细菌的鉴定细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。

4．实验流程土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→挑选能生长的菌落→鉴定知识拓展：1、Taq细菌是耐高温的微生物。

2、培养基对微生物具有选择作用。

配置培养基时根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求，加入某些物质或出去某些营养物质，一直其他微生物的生长，也可以根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性，在培养基中加入某种化学物质，从而筛选出待定的微生物。

这种培养基叫做选择培养基。

3、测定微生物数量的方法：①直接计数法：常用显微镜直接技术法，一般适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。

②间接计数法：常用稀释平板计数法，平板培养基上长出一个菌落就代表原待测样品中一个微生物个体。

土壤微生物的分离鉴定及数量测定（一）培养基的制备Ⅰ测定微生物总量培养基：1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）牛肉膏Beefextract5.0g蛋白胨Peptone10.0gNaCI5.0g蒸馏水H201000m1琼脂15～20gPH7.2~7.4制备步骤：⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解.⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌.⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL.⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。

一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。

⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。

注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。

如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。

，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。

⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min.2.放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基）可溶性淀粉20gKNO3 1gK2HPO40.5gMgSO4• 7H2O 0.5gNaCl 0.5g原0.05gFeSO4• 7H2O 0.01gpH 7.2-7.4制备步骤：（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。

（2）称量准确称量各种成分。

（3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。

实验四、土壤中放线菌的分离一、实验目的1、从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。

2、了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。

二、实验内容筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。

迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。

土壤中放线菌最丰富，品种齐全。

通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。

随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。

从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。

土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。

但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。

对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。

用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。

土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。

注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。

首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。

常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。

其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。

抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。

三、实验原理、方法和手段原理一：稀释涂布平板法；如图1。

原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量；原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影响放线菌的生长。

图1 稀释涂平板法示意图四、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。

1 / 6实验四细菌总数的测定——纯种分离一、目的1.掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。

2.掌握无菌操作技术。

二、材料和器皿1.扭力天平、取土样工具、涂布棒(接种棒)。

2.无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。

3.无菌水。

4.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

三、实验操作步骤1、取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。

先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。

盛土的容器应是无菌的。

将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。

土样取回后应尽快投入实验，同时取10- 15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。

2、倒平板2 / 6熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。

3、编号取5支无菌空试管（15×150mm）依次编号为10- 3、10- 4、10- 5、10- 6、10-7。

4、分装无菌水按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。

5.制备土壤稀释液称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。

用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度。

同样方法，依次稀释到10-7。

稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。

环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。

3 / 6代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。

6、培养及计数培养条件：倒置于36±1℃xx箱内培养48±2h 计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。

土壤分离微生物实验报告
实验目的：
1.了解土壤微生物的多样性和数量。

2.研究不同培养基对土壤微生物的影响。

实验原理：
微生物分离可以通过选取合适的培养基和条件，使得某些微生物得到优质的生长环境，从而使其能够生长繁殖。

在本实验中，选用不同的培养基和条件，从土壤中分离出不同的微生物。

实验步骤：
1.准备所需材料和培养基。

2.在实验室制备土壤样品。

3.将土壤样品加入稀释液中稀释，使用平板计数器进行计数。

4.采用分离培养法分离微生物，根据选择的培养基和条件处理
土壤样品，如气氛，温度，pH值等，使其生长繁殖并形成纯
培养物。

5.将分离出的纯培养物鉴定，确定其种属和数量。

实验结果：
本实验中选取多种常用的培养基进行菌落计数和分离培养。

结果表明，菌落计数在不同的培养基中差异较大，而在同一培养基中，不同的土壤样品菌落计数也会有较大的差异。

通过分离培养法，我们在不同的培养基中分离出了多种不同的微生物，并通过特定的鉴定方法确定其种属和数量。

结论：
通过土壤微生物分离实验，我们能够了解土壤微生物的多样性和数量，并且能够研究不同培养基对土壤微生物的影响。

微生物的分离培养为分析细菌的生物学特性、应用微生物工程提供了有力的手段。