抗菌药物敏感性分析

2
纸片扩散法（KirbyBauer法）
原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
22
操作方法：
1.挑取16～20h的菌落 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
23
3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻 轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向平均涂抹 琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平 板内缘涂抹一周。
24
4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 6条，90mm平板只能放置1～2试条 。
5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。
25
6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交 处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 。
No
No
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26
第九节 细菌的分类命名
一、分类原则:细菌的分类原则上分为传统 分类和种系分类。
分类方法： （1）人为分类法：
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嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙 星、米诺环素 ；
嗜血杆菌属：氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、头孢 他啶、美罗培南、阿奇霉素、环丙沙星、头孢克洛；
淋病奈瑟菌：头孢曲松、环丙沙星、青霉素、大观霉素、 四环素 ；
肺炎链球菌：红霉素 、苯唑西林 、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、 克林霉素、左氧氟沙星、四环素、万古霉素 ；

平板接种
用无菌棉拭子蘸取菌液
在管壁上方旋转挤压几次去掉过多水分 用拭子涂布整个M-H培养基表面，反
复几次，每次将平板旋转60° 最后沿平皿周边绕两圈以保证涂布均匀
制备好的菌液必须在15min内使用 贴纸片前可将培养皿盖半开3-5min以使
表面过多水分被吸收但不超过15min
孵育
必须用35℃孵箱（苛氧菌药敏平板应置 于5% CO2 环境）
箱内平板最好单独摆放，不超过两个叠在 一起，否则中间的平板因达不到孵箱温度 而产生预扩散的作用。
平板孵育规定时间（一般为18-24h）后读 取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以 检测苯唑西林和万古霉素的耐药性。
孵育16-18h 后检查每一块平板
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度
相比较来确定恰当的临床疗效
MIC的对数与抑菌环直径关系 ——近似线性负相关
CLSI药物选择原则
A组 常规和首选药物，其结果应常规报告 B组 首选试验选择性报告。包含一些临床
生β-内酰胺酶。 β-内酰胺酶试验更为迅速，为确认质粒介
导耐药性的好方法。
肺炎链球菌和其他链球菌
培养基 含5%脱纤维羊血的M-H琼脂 肺炎链球菌用苯唑西林测定对青霉素的敏
感性，抑菌环直径≤19mm应测其MIC而不 是直接报告对青霉素中介或耐药
肺链以外的链球菌不推荐用苯唑西林试验 对于草链，青霉素（或苯唑西林）纸片扩
加贴纸片
将接种好的平板敞开盖子倒置在室温下干 燥3-5min 使平板上的水分被琼脂完全吸 收。

药物敏感性试验报告试验目的：本试验旨在评估细菌对不同抗生素类药物的敏感性，为临床治疗提供参考。

试验方法：采用Kirby-Bauer法进行药敏试验。

从临床感染病例中获得15株细菌，分别为5株金黄色葡萄球菌、5株大肠杆菌、5株肺炎克雷伯菌。

在Mueller-Hinton琼脂培养基上均匀涂布细菌悬液，按照国家标准标准放置氧气易感性酵母菌平板中央，随机抽取敏感性试药盘，按标准方法培养24h。

试验结果：以致药典药物敏感标准为参考，细菌对不同药物的抗生素敏感情况如下表：细菌药物名称敏感耐药其他金黄色葡萄球菌青霉素√ × 6mm红霉素√ × 12mm氯霉素√ × 26mm庆大霉素√ × 15mm万古霉素√ × 20mm大肠杆菌青霉素× √ 0mm红霉素√ × 11mm氯霉素√ × 24mm庆大霉素√ × 17mm万古霉素√ × 23mm肺炎克雷伯菌青霉素× √ 0mm 红霉素√ × 10mm氯霉素√ × 20mm庆大霉素√ × 13mm万古霉素√ × 18mm分析：本试验结果显示，15株细菌对不同抗生素类药物具有不同的敏感性和耐药性。

其中，金黄色葡萄球菌对青霉素耐药，对庆大霉素敏感性较弱；大肠杆菌和肺炎克雷伯菌对青霉素无敏感性反应。

而对红霉素、氯霉素和万古霉素的敏感性较好，且有所差异。

在临床治疗中需根据细菌对不同药物的敏感性进行选择。

结论：本次试验结果为临床治疗提供了细菌药敏信息，有助于合理选用药物进行精准治疗。

同时，也为细菌抗药性研究提供了参考数据。

针对本试验的数据结果，我们建议在临床治疗中应注意抗生素的合理应用，避免滥用和乱用，降低细菌耐药性发展速度，为临床治疗提供更好的保障。

一概况2011年第二季度我院送检的细菌培养标本共766份，阳性203例（阳性率26.5%）阳性率较一季度略有上升；其中血培养225例，阳性34例（阳性率15.1%）；其他培养541份，阳性193例（阳性率35.7%）。

阳性率排在前几位的细菌依次是：1）肠杆菌科细菌共57例，其中：大肠埃希菌25例，肺炎克雷伯菌12例，沙雷菌7例，阴沟肠杆菌5例，奇异变形杆菌6例，产气肠杆菌2例； 2）非发酵菌55例，其中铜绿假单胞菌26例，鲍氏不动杆菌18例，洋葱伯克霍尔德菌11例；3）真菌47例（其中白色念珠菌37例，光滑8例，克柔2例；4）葡萄球菌属34例（其中金葡8例，凝固酶阴性葡萄球菌26例）。

二本季度常见细菌抗生素敏感性分析表1葡萄球菌属（共32例）抗生素敏感性分析抗生素金葡菌（n=8）凝固酶阴性葡萄球菌（n=24）敏感株数敏感率% 敏感株数敏感率%PEN 青霉素0 0 1 4.2 TSU 复方新诺明7 87.5 16 66.7 GEN 庆大霉素 4 50 11 45.8 ERY 红霉素0 0 4 16.7 CLI 克林霉素 3 37.5 10 41.7 TET 四环素 5 62.5 17 70.8 MIN 米诺环素7 87.5 21 87.5 VAN 万古霉素8 100 24 100 RFA 利福平 5 62.5 20 83.3 NOR 诺氟沙星 3 37.5 10 41.7 LVX 左氧氟沙星 5 62.5 11 45.8 FUR 呋喃妥因8 100 24 100 QDA 喹奴普汀达福普汀8 100 23 95.8本季度检出的革兰染色阳性球菌未发现万古霉素耐药株；MRSA的检出率为62.5%（5/8），MRCNS的检出率为75%（18/24）。

由表1可见，二季度金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌的药物敏感性相似，葡萄球菌属对万古霉素、呋喃妥因、喹奴普汀达福普汀、米诺环素及复方新诺明的敏感率较高，而对青霉素、庆大霉素、红霉素、克林霉素及诺氟沙星的耐药性较为普遍，说明该几种药物已不适宜用于葡萄球菌引起的感染。

8.联合药物敏感试验
1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均 匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待 平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板 上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃ 孵育 过夜，取出观察结果。
2）结果判断 联合药物敏感试验可出现四种结果： A.无关作用： 甲+乙=甲单或乙单 B.拮抗作用： 甲+乙＜甲单或乙单 C.相加作用： 甲+乙=甲单+乙单 D.协同作用： 甲+乙＞甲单+乙单
三、实验操作步骤
（一）纸片扩散法：
1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。 2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校
正浊度至0.5 麦氏。 3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻
轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方 式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60℃）使 菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上 平板的盖子，放置3~10min。
一、实验目的：
1. 掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结 果的判读及临床意义。
2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作 方法、结果判读和临床意义。
3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量 控制。
二、实验原理
1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗 微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这 种能力可以通过稀释或扩散方法来测定。
六、影响因素：
1. 培养基：厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂； 2. 抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，
渗透性，保存方式等； 3. 细菌的接种量； 4. 培养的环境，温度与时间； 5. 结果的判断及解释标准等。
4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金 葡），混匀，胶布封口，37°C培养。

抗菌药物药敏试验判断标准
抗菌药物药敏试验判断标准主要采用三级划分制度：
1. 敏感：当使用常规剂量的抗菌药物治疗细菌感染有效时，称该细菌对该抗菌药物具有高度敏感性。

说明在常规剂量下，药物在血液中的平均浓度超过该细菌MIC的5倍以上。

2. 中敏或中介：仅当使用大剂量的抗菌药物治疗细菌感染才有效，或者细菌仅在体内抗菌药物浓缩的体液（如尿液、胆汁）中被抑制时，表示这种细菌对该抗菌药物敏感性低，这种药可用于生理性浓集部位的感染。

3. 耐药：表示某种抗菌药物对该细菌的MIC等于或高于常规剂量下可获得的抗生素的血液或组织浓度，因此细菌不能被抑制。

检验科抗生素敏感性常见检测与分析方法抗生素在医学领域中起着至关重要的作用，它可以有效地抑制和杀灭细菌，从而治疗各种感染性疾病。

然而，随着抗生素的广泛应用，细菌对抗生素的耐药性也在不断增加，因此对抗生素敏感性的检测变得至关重要。

本文将介绍检验科抗生素敏感性的常见检测与分析方法。

一、药敏试验药敏试验是最常用的抗生素敏感性检测方法之一，通过对病原菌在不同抗生素浓度下的生长情况进行观察，来判断该菌株对抗生素的敏感性。

常见的药敏试验包括纸片扩散法、微量稀释法和E测试等。

纸片扩散法是一种简单、快速的药敏试验方法，通过将含有不同抗生素的纸片覆盖在含有病原菌的琼脂平板上，观察形成的抑菌圈直径大小来判断病原菌对抗生素的敏感性。

微量稀释法则是通过在微孔板中逐渐稀释抗生素和病原菌悬液，观察最低抑菌浓度来判断病原菌对抗生素的敏感性。

而E测试则是一种半定量的药敏试验方法，通过在琼脂培养基上贴有梯度浓度的试纸，根据试纸上最低抑菌浓度来确定病原菌对抗生素的敏感性。

二、分子生物学方法除了传统的药敏试验方法外，分子生物学方法也被广泛应用于抗生素敏感性的检测与分析。

其中，聚合酶链式反应（PCR）和测序技术是常见的分子生物学方法。

PCR技术可以快速检测病原菌中存在的抗生素耐药基因，从而帮助诊断医生选择更合适的抗生素治疗。

通过PCR扩增相关基因片段，可以快速、准确地判断病原菌对某种抗生素的敏感性。

而测序技术则可以对PCR扩增的基因片段进行测序分析，从而确定病原菌的抗生素敏感性和耐药性基因型。

三、流式细胞术流式细胞术是一种高通量、高灵敏度的细胞检测技术，也被应用于抗生素敏感性的检测与分析。

通过在流式细胞仪上检测病原菌的细胞膜完整性、细胞形态和代谢活性等指标，可以快速、准确地判断病原菌对抗生素的敏感性。

总结起来，药敏试验、分子生物学方法和流式细胞术是检验科抗生素敏感性常见的检测与分析方法。

这些方法不仅可以帮助医生选择更合适的抗生素治疗方案，还可以指导临床合理使用抗生素，减少耐药菌株的产生，为抗生素治疗提供重要参考依据。

医院感染菌与抗菌药物敏感度分析摘要:目的：调查感染病原菌分布率，分析感染病原菌耐药性。

方法：收集2018-2021年全年送检的6959 份标本，采用 API鉴定系统进行菌株鉴定，药敏试验采用琼脂扩散法敏感试验( K2B 法)，分析其耐药性。

结果：共分离出 2299株病原菌，检出率 27. 95% ，医院感染患者主要病原菌为大肠埃希菌(15.43 %)、肺炎克雷伯菌(17. 55 %)、铜绿假单胞菌(15.69 %) 、金葡菌(8.39%)等，主要革兰氏阴性杆菌对亚胺培南、厄他培南、哌拉西林他唑巴坦、头孢哌酮舒巴坦均有较高的敏感性；主要革兰氏阳性球菌对利奈唑胺、万古霉素、替加环素高度敏感。

结论：感染患者中分离的病原菌耐药率较高且呈多重耐药性，以革兰氏阴性杆菌为主，对常规抗菌药物耐药。

因此，控制医院感染耐药菌产生，合理使用抗菌药物具有十分重要的意义。

关键词:医院感染; 耐药菌分布; 耐药性分析随着广谱抗菌药物的广泛应用，细菌耐药性日趋严重，通过动态监测医院的病原菌分布及其对抗菌药物的耐药动向和变迁，掌握医院感染病原菌分布情况及耐药特点，对于指导临床抗菌药物的合理应用，最终达到有效控制耐药菌蔓延和降低医院感染发生率的目的具有重要意义。

1 资料与方法1. 1 资料来源收集 2018-2021年患者标本6959份，检出有病原菌的1945份，检出率为27.95%，检测到阳性菌株 2299株。

1. 2 方法1. 2. 2 菌株鉴定参照《全国临床检验操作规程》(第2版) ，将收集的临床菌株进行常规分离。

所有标本按常规接种羊血平板、麦康凯平板、SS平板，基础琼脂购自杭州天和微生物试剂厂按各自要求配制，分别置普通温箱、37 ℃环境孵育，获得单个纯菌落。

采用VITEK2---Compact全自动微生物鉴定和药敏分析仪（法国生物梅里埃公司研制）分析其耐药特性。

1. 2. 3 质控菌株大肠埃希菌 ( ECO) A TCC 25922、肺炎克雷伯菌 A TCC 700603、铜绿假单胞菌A TCC 27853、产 AmpC 酶标准阴沟肠杆菌 029(染色体介导去阻遏持续高产型) 、 ECO DH5A2919 (产质粒型 ACT21) 。

最 低 抑 菌 浓 度 （ minimal inhibitory concentration,MIC）： 细 菌 生 长 被 完 全 抑 制 的 最低药物浓度为该药对测试菌的MIC。
最 低 杀 菌 浓 度 （ minimal bactericidal concentration,MBC）： 某 抗 菌 药 物 能 杀 灭 99.9%以上测试菌时的最低药物浓度。
7. 质量控制 采用标准菌株：金黄色葡萄球ATCC25923，
大肠埃希菌ATCC25922，和铜绿假单胞菌
ATCC27853
2）直接纸片药敏法 由确证感染部位采集到的一些重要临
床标本直接涂布接种MH琼脂或5%羊血 MH琼脂，然后放置药敏纸片。不仅可 提早24h得出初步药敏结果供临床用药参 考，还有助于发现混合感染中的不同菌
（2）方法
菌液、平板接种等同纸片琼脂扩散 法,待琼脂平板完全干燥，用E试验加样 器或镊子将试条放在已接种细菌的平板 表面，试条全长应与琼脂平板紧密接触， 试条MIC刻度面朝上，浓度最大处靠平 板边缘。
采用NCCLS2002 AST执行标准推荐 孵育条件。
（3）结果判读：读取椭圆环与E试验试 条的交界点IC值。
(2) 方法 试管编号： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
抗生素： 1ml 2ml
(512µg/ml)
不加抗生素
MH肉汤 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
对倍稀释： 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml1ml(弃去 ) 抗生素含量 256 128 64 32 16 8 4 2 1---
B.拮抗作用： 甲+乙＜甲单或乙单
细菌对甲药耐 药，对乙药敏 感，甲药对乙 药发生切割状 拮抗现象。

明确提出在二级以上医院设立感染科与感染临床药师（第12、
13条），及临床微生物室（第14条）
6
Company name
概况和制定过程
第一章 总则
第六章 附则 第五章 法律责任
共六章 53条
第二章 组织机 构和职责
• 组织医院管理、临床、药学 、微生物检验、感染等方面 专家起草《抗菌药物临床应 用管理办法》
19
Company name
培养条件（一）
需氧菌： 35℃ ±2 ℃ ，16-18小时 嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌：20-24小时 葡萄球菌：33-35 ℃ ，OXA、MET、NAF、VAN24小时 肠球菌：VAN 24小时 溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时
20
Company name
操作：
无菌棉签蘸取菌液，在管壁内将多余菌液旋 转挤去后，在琼脂表面均匀涂布接种3次， 每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1 周。 室温干燥或35℃干燥5-15分钟 用纸片分配器或无菌镊子将药物纸片紧贴于 琼脂表面 纸片间距 20mm 纸片离平板内缘 15mm
15
Company name
抗生素药敏试验质控
• 4月11日起征求全国意见
• 制定《抗菌药物临床应用分
第三章 抗菌药物 级管理目录》
临床应用管理
• 4月15日期征求全国意见
第四章 监督管理
7
Company name
第三章 抗菌药物临床应用管理
• 三级医院 不得超过50种，二级医院 不得超过35种 • 同一通用名称药品的品种，注射剂型和口服剂型各不得超过2种，处方组成
葡萄球菌属 Mueller-Hinton（MH）琼脂

抗菌药物敏感性试验及细节耐药检测抗菌药物敏感性试验与细节耐药性监测来源：检验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感试验(一)纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer试验，是操作最简易、使用最广泛的抗菌药物敏感性试验。

1．试验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。

纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。

2．培养基和抗菌药物纸片(1)培养基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培养基是CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，pH值为7.2～7.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。

琼脂厚度为4mm。

配制琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前应将平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。

(2)抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，吸水量为20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方法使每片含量达到规定所示。

含药纸片密封储存2～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保存，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻储存，且不超过l周。

使用前将储存容器移至室温平衡l～2h，避免开启储存容器时产生冷凝水。

3．细菌接种细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方法。

用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度。

校正浓度后的菌液应在15min内接种完毕。

接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周；②平板置室温下干燥3～5min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感试验结果应孵育24h。

细菌的外膜上特殊的药物泵出系统 使菌 体内的药物浓度不足导致耐药 。铜绿假单胞菌外 膜上有一种蛋白OprK，泵出多种抗生素 ，是产生 耐药的重要机制 。
19
细菌耐药性的生物化学机制
. 药物作用靶位的改变 通过靶位的改变使抗 生素不易结合，是耐药发生的重要机制。
1.核糖体靶位酶亲和力的改变导致对四环素、红 霉素、喹诺酮、氨基糖苷类、甲氧嘧啶、磺胺 类抗生素耐药 。
2.核糖体位点的改变引起对大环内酯类和林可霉 素类抗生素耐药 。
3. DNA螺旋酶的改变是对喹喏酮类抗生素耐药 的重要机制 。
20
细菌耐药性的生物化学机制
. 药物作用靶位的改变 4.核酸合成途径中序列靶位酶的改变 对磺胺- 甲氧嘧啶
耐药，二氢叶酸还原酶改变致甲氧嘧啶耐药。 5. PBP发生改变 , β - 内酰胺类抗生素不能结合或亲和
. K-B法试验程序
挑取菌落 转种肉汤
比浊
涂布平板上 放置药敏纸片 量取抑菌圈大1小
2
1、常见菌 2、苛氧菌 3、厌氧菌 4、酵母菌 5、真菌
. E试验法
13
. 联合药物敏感试验意义 . 联合抑菌试验 . 最低杀菌浓度测定
14
15
常用敏感性试验的方法
• 监控治疗效果试验：
• 1、血清抗菌药物浓度测定(serum antimicrobial level)
27
四、铜绿假单胞菌
• 铜绿假单胞菌对多数抗生素不敏感，呈现明显的 固有耐药性。长期以来假单胞菌的固有耐药性认 为是由于该菌具有外膜的低通透性(主要是外膜
微孔蛋白突变，阻止抗生素由外膜进入胞质)， 最近的研究表明，假单胞菌耐药的产生机制与细 菌具有能量依赖性的主动外排系统有关，也可能 同时存在其他耐药机制。由于在长期抗生素治疗 过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初代 敏感的菌株在治疗3~4周后，测试重复分离株的抗 生素敏感性是必要的。目前，对假单胞菌感染多 采用联合治疗，如选用一种 β 内酰胺类抗生素与 一种氨基糖苷类或一种喹诺酮类抗菌药物联合。

方法：
菌液制备：生理盐水校正测试菌和质控菌至 0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释到 107CFU/ml；
加菌液：用微量加样器取0.1ml稀释菌液由低 到高加于各排试管中，其最终的接种量为 5×105 CFU/ml。测试菌排、测试菌生长对照 管加测试菌液；质控菌排、质控菌生长对照 管加质控菌液。
实验内容
常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测 方法介绍。
纸片扩散法。 肉汤稀释法。
一、常用抗菌药物敏感性试验与耐药 检测方法介绍
纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 联合药物敏感试验 特殊耐药菌及耐药酶的表型检测
耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测 β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测等
二、纸片扩散法（K-B法）
原理：
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上， 纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周 围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度 范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抗菌药物
青霉素 苯唑西林 万古霉素 庆大霉素 红霉素 克林霉素 磺胺药
纸片含药量
10U 1μg 30μg 10μg 15μg 2μg 1.25/23.75μg
耐药 ≤28 ≤10 — ≤12 ≤13 ≤14 ≤10
抑菌圈直径(mm)
中介
敏感
—
≥29
11～12
≥13
—
≥15
13～14
≥15
14～22
≥23
涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多 余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转 平板60º，最后沿平板内缘涂抹1周；

稀释法
• 稀释法药敏试验（dilution method）是在体外定量检
测抗菌药物对细菌之抗菌活性的方法，它测定的是抗
菌药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory
concentration ,MIC），故稀释法药敏试验常简称为 “MIC测定”。
一、 常量肉汤稀释法
• 试验材料 • 抗菌药物溶液的制备、储存和稀释
感染部位通常所能达到的浓度可抑制该感染菌
的生长。
耐药
• 所谓耐药(resistant，R)是指使用常规推荐剂量的抗菌 药物进行治疗时，该抗菌药在患者感染部位通常所能
达到的浓度不能抑制该感染菌的生长；或者该药对该
感染菌的临床疗效尚未在以往的治疗研究中被证实是 可靠的；或者抑菌圈直径落在特定细菌发挥耐药机制 （如β -内酰胺酶）的合适范围。
抗菌药物敏感性试验的目的
• 测定细菌对抗菌药物的敏感性 • 地区性耐药监测 • 评价新药的抗菌药效 • 分析医院感染流行株的药敏谱
抗菌药物敏感性试验的指征
当某些致病菌或条件致病菌的药敏特点不能从其 种属特征上了解时，或其药敏结果易变时，这些菌的
临床分离株必须进行药敏试验。如：肠杆菌科的细菌、
革兰阴性葡萄糖非发酵菌、葡萄球菌属和肠球菌属的 细菌等.
抗菌药物的联合药敏试验
• 纸片法联合药敏试验
纸片法联合药敏试验所用的培养基、药敏纸片、菌液 和培养条件等均和纸片法药敏试验相同。将所要试验 的两种药敏纸片邻近贴在涂菌的琼脂平板上，使两纸 片的中心距离恰好等于两药敏纸片单独试验时抑菌圈
的半径之和，按规定条件孵育之后观察抑菌圈的形状
改变，并据此判断两药联合药敏试验的结果
抗菌药物 的敏感性试验
第一节 抗菌药物敏感性试验 的目的及试验指征

细菌对抗菌药物敏感性的检验1、扩散法：琼脂加上细菌所需要的各种养料，将培养基融化后，倒入无菌培养皿中，冷却，凝成一个平面或叫平板(平皿)。

这时将含有少数细菌的菌液涂到平板上，培养后细菌就会分别在平皿上繁殖，如果在平皿的培养基内事先加入抗生素纸片，由于药物在培养基中扩散，起了抑(杀)菌作用，形成了不长菌落的抑制圈。

抑制圈的大小，反映某一抗生素对该菌抑菌的程度。

K-B法：最常用的药敏试验是WHO推荐的Kirby-Bauer纸片扩散法(K-B法)。

该法将药敏试验抑菌环大小分为四个等级，即：敏感、中度敏感、中介度、耐药。

由于中介度介于敏感和耐药之间，所以不予报告，故化验单上只报告敏感、中度敏感或耐药。

【临床意义】1．敏感：表示被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的该抗菌药物治愈，禁忌症除外。

2．中度敏感：表示被测菌株可以通过提高剂量被抑制或在药物被生理性浓集的部位被抑制，如β-内酰胺类药物。

3．中介度：这一范围只是抑菌环直径介于敏感和耐药之间的“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控所导致的较大的结果解释错误。

抑菌环落入中介度范围，意义不明确，如果没有其他可替代的药物，应重复做药敏试验，或以稀释法测定MIC。

4．耐药：被测菌不能被常用剂量所达到组织内或血液中的抗生素所抑制。

5．最低抑菌浓度：抑制被测菌的最低药物浓度。

6．最低杀菌浓度：抗菌药物杀灭细菌所需的最低浓度。

联合药敏试验：【临床意义】常用于严重感染时对两种或两种以上抗生素的选择。

常用K-B法和方阵棋盘稀释法。

结果以部分抑菌浓度FIC的指数报告。

1．FIC指数＜0．5，为协同作用。

即两种抗菌药物联合后的药效大于同样浓度的两种药物抗菌作用的总和。

2.FIC指数0．5～1，为相加作用，即两种药物联合后其活性等于两种药物抗菌作用的总和。

3．FIC指数1～2，为无关作用，即联合药物的活性与单独的抗菌作用相同。

4．FIC指数＞2，为拮抗作用，即两种药物联合后的抗菌活性小于单独一种药物的抗菌作用。

4.当引发感染致病菌种属特征提醒其对某 种抗菌药品高度敏感而从来未见有耐药情 况汇报时，通常不需要进行药敏试验。如
β溶血菌对万古霉素。
抗菌药物敏感性试验
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5.自标本中分离出各种细菌，不能确定为致病菌各 种细菌，分离菌可能是来自环境或人体正常菌群污 染时，通常无须进行药敏试验。
6.分离自正常寄生部位条件致病菌和非致病菌，不 能说明其与污染关系，不需要进行药敏试验。
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体外药敏Байду номын сангаас验选药标准
药敏试验中抗菌药品选择要遵照合理科学标准， 含有以下几个方面标准：1.依据抗菌药品抗菌谱， 每种抗菌药品都有一定抗菌谱，药品类型不一样， 其抗菌范围也不一样。2.依据细菌种属：抗菌药 品对不一样种属细菌作用效果不一样，所以应有 针对性地选择抗菌药品进行敏感性试验，标准上 可依据CLSI推荐抗菌药品选择方法选择药品进 行试验，如肠杆菌科，葡萄球菌，假单胞菌。 （见表1）
2.从同一患者体中同部位连续分离到相同菌株， 为检测它们是否已经发展为耐药，应重新进行 药敏试验。尤其是在第四代头孢菌素治疗肠杆 菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷氏菌属，全部抗菌 药品治疗铜绿假单胞属，喹诺酮类治疗葡萄球 菌属3-4天后，起初对某种抗菌药品敏感菌株易 发展位耐药。
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3.进行细菌耐药性调查和抗菌药品疗效时 需要进行药敏试验。
在药品生理部位含有临床效力（如尿 液中喹诺酮类和β-内酰胺类）。另外 中介还能作为缓冲区，以预防微小， 未受控制技术原因造成较大错误结果 ，尤其是针对那些药品毒性范围靠近 疗效范围药品。
抗菌药物敏感性试验
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药敏试验普通标准
1.药敏试验只在被认为是引发感染细菌纯培养物 上进行，当从合格临床标本中分离出任何感染 可疑病原菌，又不能从该菌种属特征可靠地推 测其反抗菌药品敏感性时，则需要进行药敏试 验。

转60℃）使菌液均匀分布，后沿平板内缘涂抹一周。 4)用镊子将E-test试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻度的一
面向外。 5)孵育，置平板于35℃孵育16-24h。
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6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即 为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 。
椭圆形细菌生 长抑制区
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抑菌浓度指数（FICI）
FICI ＝
A药联合时的MIC A药单测的MIC
＋
B药联合时的MIC B药单测的Hale Waihona Puke ICFICI ﹤1为协同作用；
FICI =1为累加作用；
FICI﹥1 为拮抗或无关作用，无关时药物组合的MIC 等于浓度高的药物的MIC。
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2、抗菌药物的杀菌活性 （1）最低杀菌浓度（MBC）
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（5）孵育：放于35℃孵箱中，通常于16-18h后，测量抑菌环直径。
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（6）测量抑菌环直径
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（7）与解释标准核对得出结论 敏感(susceptible, S)：所分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时在感 染部位可达到的药物浓度所抑制。 耐药 (resistant, R)：所分离菌株不被测试药物常规剂量可达到的药 物浓度所抑制。
时的抗菌效果，其结果可以表现为协同、拮抗、累加和无关。
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2）部分抑菌浓度指数（FICI）测定： 测定A、B两种药的MIC值，根据MIC值将两药配成不同浓度的
含药肉汤，将各浓度的A药和B药肉汤两两等量混合，组成棋盘模式 不同药物组合的含药肉汤。观察孵育后各行列中不长菌的最低药物 浓度管，即为药物组合的MIC值。
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（2）时间杀菌试验（time-kill assay）
1）概念：是指能够使试验菌减少99.9%以上的最低药物浓度。 2）操作方法：分别取高于MIC值的各管中的菌药混合肉汤划线接种于