17.抗菌药物敏感性试验
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抗菌药物敏感试验+细菌耐药性检测
9
稀释法的特点
? 定量的药敏试验，测定MIC 、MBC 。 ? 方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，常
用于调查罕见耐药。 ? 自动微生物鉴定药敏分析系统采用微量稀释法检测
MIC 。
10
二、纸片扩散法（ disc diffusion test)
原理：
（Kirby-Bauer 法）
? 将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上。 抗菌药物向琼脂四周扩散形成递减的梯度浓度。
5
6
CLSI 标准 治疗浓度的上限 即表中的 R
治疗浓度
治疗浓度的下限 即表中的 S
耐药
中介耐药 敏感
MIC
7
第一节、抗菌药物敏感性试验方法
需氧和兼性厌氧菌
8
需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法
? 稀释法 ? 肉汤稀释法（试管稀释法） ? 琼脂稀释法（平板稀释法）
? 纸片扩散法（纸片法） ? E-试验 ? 联合药物敏感试验
的效果之和； 20％～25％
? 相加作用：它们联用时的效果 等于单用两种抗生素效果
之和； 60％～70％
? 无关作用： 两种抗生素联用的效果， 仅相当于其中一种 具有较强作用的抗生素的效果；
3
血药浓度与 MIC之间的关系
耐药
上限
中介耐药
下限
敏感
4
敏感和耐药的概念
抗菌药物的治疗浓度与MIC 的关系：
? 若MIC 小于治疗浓度， 则为“敏感”（Sensitive , S ），推荐使用。
? 若MIC 大于治疗浓度， 则为“耐药”（ Resistant , R ）；
? 若MIC 介于治疗浓度的上下限之间 ， 则为“中度耐药”（ Intermediate , I ）或中度敏感
稀释法的特点
? 定量的药敏试验，测定MIC 、MBC 。 ? 方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，常
用于调查罕见耐药。 ? 自动微生物鉴定药敏分析系统采用微量稀释法检测
MIC 。
10
二、纸片扩散法（ disc diffusion test)
原理：
（Kirby-Bauer 法）
? 将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上。 抗菌药物向琼脂四周扩散形成递减的梯度浓度。
5
6
CLSI 标准 治疗浓度的上限 即表中的 R
治疗浓度
治疗浓度的下限 即表中的 S
耐药
中介耐药 敏感
MIC
7
第一节、抗菌药物敏感性试验方法
需氧和兼性厌氧菌
8
需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法
? 稀释法 ? 肉汤稀释法（试管稀释法） ? 琼脂稀释法（平板稀释法）
? 纸片扩散法（纸片法） ? E-试验 ? 联合药物敏感试验
的效果之和； 20％～25％
? 相加作用：它们联用时的效果 等于单用两种抗生素效果
之和； 60％～70％
? 无关作用： 两种抗生素联用的效果， 仅相当于其中一种 具有较强作用的抗生素的效果；
3
血药浓度与 MIC之间的关系
耐药
上限
中介耐药
下限
敏感
4
敏感和耐药的概念
抗菌药物的治疗浓度与MIC 的关系：
? 若MIC 小于治疗浓度， 则为“敏感”（Sensitive , S ），推荐使用。
? 若MIC 大于治疗浓度， 则为“耐药”（ Resistant , R ）；
? 若MIC 介于治疗浓度的上下限之间 ， 则为“中度耐药”（ Intermediate , I ）或中度敏感
细菌对药物的敏感试验
近年来，由于抗生素、磺胺等抗菌药物广泛应用，导致了耐药菌株不断出现。
测定细菌对药物的敏感程度，对于临床治疗中选择用药，避免滥用药、及时有效地控制感染以及细菌鉴定，具有重要意义。
细菌敏感度的测定方法很多，世界卫生组织推荐的方法为Kirby-Bauer 纸片法，该方法具有操作简便、易于掌握、且重视性好的优点，本法是将含药纸片贴敷在接种细菌的琼脂平板上，利用含药纸片在琼脂上的扩散作用来测定细菌对药物的敏感性。
K-B纸片法的原理是建立在抗菌药物抑菌环直径大小与细菌的最小抑菌浓度（MIC）之间呈负相关的基础上，即抑菌环直径越大，则MIC越小。
结果判定：按抑菌环直径大小报告敏感、中度敏感或耐药。
敏感：是指被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的某种抗菌药物治疗。
中度敏感：是指通过提高种抗菌药物的剂量或在该药浓集的部位，细菌生长可被抑制，感染可被治愈。
这类药物毒性较小，剂量可以加大。
β-内酰胺类药物可出现中度敏感。
耐药：是指被测菌株所引起的感染不能用常规剂量的抗菌药物所治愈。
中介度：这一范围是“缓冲域”是由试验的误差造成的不作为报告形式。
如确需明确的敏感度，应重复实验或做稀释法，抑菌环为中介度的药物不可提高剂量。
最低抑菌浓度（MID）：抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。
以针形接种器沾取菌液加至药盒各孔，35℃培养过夜，含抗菌素浓度最低而无细菌生长的（清亮孔），即为MIC。
最低杀菌浓度（MBC）：抗菌药物杀灭细菌所需要的最低浓度。
经48小时35℃培养后，含抗菌素浓度最低而无细菌生长的（清亮孔），即为MBC。
由于纸片法影响因素多，很难控制精度，现大多数医院采用MIC测定盒。
MIC由经典二倍肉汤稀释演化而来，具有终点判断精确，重复性好，操作简便等优点。
此方法采用病美国DYNATECH接种器，更具科学性。
使用国产“华士达微生物自动分析仪”所做的定量药敏（MIC）试验，报告自动由打印机印出，附印出抗菌素对受试菌的MIC外，还可提供各种药物的用量，给药途径（口服、肌注、静滴）及血和尿中可能达到的药物浓度一览表，供临床医师参考。
第4章抗菌药物敏感试验
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
抗菌药物药敏试验判断标准
抗菌药物药敏试验判断标准
抗菌药物药敏试验判断标准主要采用三级划分制度：
1. 敏感：当使用常规剂量的抗菌药物治疗细菌感染有效时，称该细菌对该抗菌药物具有高度敏感性。
说明在常规剂量下，药物在血液中的平均浓度超过该细菌MIC的5倍以上。
2. 中敏或中介：仅当使用大剂量的抗菌药物治疗细菌感染才有效，或者细菌仅在体内抗菌药物浓缩的体液（如尿液、胆汁）中被抑制时，表示这种细菌对该抗菌药物敏感性低，这种药可用于生理性浓集部位的感染。
3. 耐药：表示某种抗菌药物对该细菌的MIC等于或高于常规剂量下可获得的抗生素的血液或组织浓度，因此细菌不能被抑制。
微生物学检验(第3版)药物敏感试验
抗生素的种类 一.目的：
四、氨基糖苷类抗生素 按其来源分为：①由链霉菌属发酵滤液提 取获得，有链霉素、卡那霉素、妥布霉素、 核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；②由小单 胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福 提霉素；③半合成氨基糖苷类，有阿米卡 星、奈替米星、地贝卡星等。
抗生素的种类 一.目的：
五、喹诺酮类抗生素 第一代为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶 酸和恶喹酸。 第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次 为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙 星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟 沙星。 第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、 妥舒沙星、左氟沙星等。
纸片的名称，然后用棉试子蘸取菌液，在试管内
壁轻挤去多余菌液后均匀涂布于整个平板表面3次， 每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂一周。放 置约5分钟后用镊子分别挟取所选择的药敏纸片贴 上。室温放置10分钟左右，恒温箱培养24h。
验操实作
• (4)、MH平板涂布均匀，放置5分钟再贴纸 片，纸片放置应该迅速准确，不得在平板 上拖动纸片，纸片间的距离和位置要均匀。 离平板边缘不小于15mm，两纸片间距离不 小于24mm。
实验原理 1.原理：
实验操作（接种与培养）
• (1)、取待测菌平板，观察菌落形态，涂片镜检， 革兰阴性杆菌做氧化酶试验，革兰阳性球菌做触 决定选择何组、何种药敏纸片。
酶实验。并根据实验结果对该菌株作出初步判断，
药敏试验选择纸片
• 触酶阳性的G＋球菌：青、苯唑、克林、庆大、环
丙沙星、万古、红霉素、头孢唑林 庆大、环丙沙星、万古
(一）苛养菌药敏试验抗生素的选用
A组一级试验并常规报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。 B组一级试验有选择报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松 。 C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如肺炎链球菌用头孢呋辛 。
抗菌药物敏感试验
操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解
2.抗菌药物母液的稀释
3.在微量聚乙烯微板孔中加各种不同浓度的抗生素 100μl，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。
4.挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度105 CFU/ml。
除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克 林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂 的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。
9.取抑菌环直径，根据 CLSI（clinical and laboratory standards institute ）标准，报 告细菌对该抗生素 敏感(susceptible,S)、 耐药(resistant,R)、 中介(intermediate,I)。
纸片扩散法（KirbyBauer法）
原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
第四章 抗菌药物的敏感性试验
药敏试验的意义
1、可预测抗菌治疗的效果 2、指导临床抗菌药物的使用 3、发现或提示细菌耐药机制，帮助临床医生合理使 用抗菌药物 4、监测细菌的耐用性，分析耐药菌的变化，预防和 控制耐药菌感染的发生和流行
抗菌药物的敏感性试验
常用方法：
抗菌药物敏感性试验及2010CLSI
哪些需要做MIC
肺炎链球菌 苯唑西林纸片法直径≤19mm,需 要明确受试菌对青霉素的敏感性，必须做青 霉素的E-试验
革兰阳性球菌 万古霉素不敏感时（中介或 耐药），必须做万古霉素的E-试验确认受试 菌对万古霉素的敏感性（包括替考拉宁、利 奈唑胺等）
草绿色链球菌 对青霉素、氨苄西林 纸片法药敏结果不可靠，必须做上述 两药的E-test
镜下才能观察到的细小菌落应忽略
正确阅读抑菌圈内的“霾”现象
变形杆菌(迁移生长)以及磺胺类药物的纸片法药敏 注 意要读完全抑制的抑菌圈，对“霾”生长不予理会
克林霉素对葡萄球菌的抑菌圈内如有薄雾状菌苔应报告 细菌对克林霉素耐药,不管其是否显示 “D”抑菌圈
需在透射光（Transmitted light）下阅读万古霉素、 利奈唑胺和苯唑西林的抑菌圈，遇不敏感的结果需用稀 释法测定MIC法确证
E-Test
细菌报告应注意的问题
有无细菌：苛养菌、难培养细菌 正常菌群/病原菌:病史、病人体征、感染部位 药敏结果报告：耐药菌株的提示或修改
正确阅读纸片法结果
完全抑制的抑菌圈直径，包括纸片的直 径
不反光的黑色背景、反射光下阅读结果 抑菌圈的界限应该是以肉眼观察没有明
显的可见细菌生长区域 在抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大
2010CLSI主要更新内容
主要格式的更新 关于药敏质控的更新（新增Doripenem等质控范围） 关于药敏试验操作的更新 脆弱拟杆菌的累积药敏报告 术语表的更新（新的抗生素亚组-抗MRSA活性的头孢菌素）
肠杆菌科新旧折点(MIC
ug/l）
Agent
头孢唑 啉 头孢噻 肟 头孢唑 肟 头孢曲 松 头孢他 啶 氨曲南
100% 80%
抗菌药物敏感试验实验
阿米卡星（AMK）、环丙沙星（CIP） 4.庆大霉素稀释液：1支/桌（256U/ml） 5. 其它：MH肉汤、无菌刻度管、无菌棉签、镊子、
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M-H肉汤(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
抗生素(ml) 菌液(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
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M-H肉汤(ml)
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抗生素(ml) 菌液(ml)
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2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
细菌药物敏感试验实验报告
药物敏感试验又称药敏。
目的是指导临床针对性使用抗生素，减少细菌耐药的产生。
使感染能够及时控制，做到有的放矢。
测定细菌在体外抗菌药物敏感性（以下称药敏试验）的试验方法很多。
绝大多数临床实验室以琼脂扩散法作为常规方法测定常见的快速生长的病原菌。
本文介绍的是标准纸片扩散法。
本文提出的一系列建议有助于药敏试验的标准化。
具体地叙述了现行推荐方法的操作步骤，及其适应性和局限性。
本文还重温了国际协作研究会（ics）的有关建议和食品药物管理局（fda）的有关规定，并采纳了其中的有关章节。
只根据是否出现抑菌环而不考虑其大小来判断细菌对抗菌药物敏感性的试验方法，结果是不准确的。
纸片扩散法试验必须遵循标准的方法学原理，并根据抑菌环与最低抑菌浓度的相关性，并结合临床上已知敏感或耐药菌株的状况进行标准化，结果才能可靠。
要得到可靠结果，必须严格地按照本文的方法进行操作。
美国临床实验室标准化委员会（nccls）下设的纸片扩散法药敏试验分委员会推荐的标准方法，以bauer等介绍的方法为基础，是目前叙述最完整的试验方法。
其中的解释标准是综合临床和实验室的数据发展而来，并得到证实。
要测定和报告给哪些药物，须与感染科医生、医院的药品委员会及感染控制委员会协商，然后由实验室制定最合适的方案。
表1和表1a列出了治疗各类细菌感染有效的药物，其体外药敏试验结果也有助于感染的控制及流行病学研究。
做药敏试验，应从分离平板上挑选各种疑为致病菌的单个菌落，同时做菌种鉴定。
不同菌种不可在同一平板上做混合细菌药敏试验。
一般避免用临床标本（如无菌体液和尿液）直接做药敏，除非临床上急需且革兰氏染色只见到单一菌种，但随后应再以标准方法重做。
对感染性质不同，标本中混有浑浊细菌或正常菌群的情况，其中的细菌也许与感染治疗关系不大，常不必做药敏，不然反会招致错误的引导。
《抗菌药物敏感试验折点研究技术指导原则》
《抗菌药物敏感试验折点研究技术指导原则》抗菌药物敏感试验是评价细菌对抗菌药物的敏感性和耐药性的重要方法，其结果对临床治疗选择具有重要指导意义。
折点（breakpoint）是指界定细菌对抗菌药物的敏感与耐药的最小浓度值，直接影响临床对细菌感染的治疗方案制定。
因此，抗菌药物敏感试验折点的研究具有重要的临床意义。
为了规范抗菌药物敏感试验折点研究，以下提出《抗菌药物敏感试验折点研究技术指导原则》。
一、选择适当的菌株二、选择敏感试验方法常见的敏感试验方法有稀释法、纸片扩散法、酶联免疫吸附法等。
选择适当的敏感试验方法需根据不同抗菌药物的特点和临床要求来确定。
同时，应在试验前进行方法验证，保证试验结果准确可靠。
三、标准药物选择与制备选择标准药物应包括广谱和狭谱抗菌药物，且应具有良好的抗菌活性和临床应用价值。
药物的制备需按照相关规范进行，保证药物的纯度和活性。
四、选择适当的菌落数量菌落数量是影响抗菌药物敏感试验结果的重要因素之一、一般来说，应选择菌落数量在10^5-10^8CFU/mL之间，以保证试验结果的准确性和可靠性。
五、确定抗菌药物敏感断点的方法确定抗菌药物敏感断点的方法主要有：传统的双峰分布方法和新近发展的断点预测系统等。
传统的双峰分布方法是指根据药物在临床中使用的有效浓度范围，通过细菌菌落生长抑制直径与药物浓度的关系曲线，确定该药物的断点。
断点预测系统则是在大规模抗菌药物敏感试验结果的基础上，利用统计学方法建立数学模型，预测药物的敏感断点。
六、质控的重要性质控在抗菌药物敏感试验折点研究中具有重要意义，对保证试验结果的准确性和比较性起到关键作用。
质控应包括阳性和阴性对照品的选用与制备、质控菌株选择与保存、试验成功率和误差分析等。
七、结果的表达和解读抗菌药物敏感试验折点研究的最终结果应通过图示、表格等形式予以表达，并及时进行解读。
对于抗菌药物敏感断点的确定，应进行全面评估，包括相关临床试验数据、药代动力学和药效学数据等。
nccls细菌药物敏感试验判定标准
nccls细菌药物敏感试验判定标准
NCCLS（National Committee for Clinical Laboratory Standards）细菌药物敏感试验判定标准是NCCLS提出的一套细菌药物敏
感试验判定标准，用于评估细菌对抗菌药物的敏感性。
该标准主要涉及细菌的敏感性等级、细菌的敏感性报告和药物敏感性测定方法等。
NCCLS细菌药物敏感试验判定标准的敏感性等级包括：非常
敏感（S）、敏感（I）、耐药（R）和非常耐药（V）。
其中，非常敏感（S）表示细菌在抗菌药物的抑制浓度低于最小抑制
浓度（MIC）的4倍以下时，可以被抑制；敏感（I）表示细
菌在抗菌药物的抑制浓度低于最小抑制浓度（MIC）的2倍以
下时，可以被抑制；耐药（R）表示细菌在抗菌药物的抑制浓
度低于最小抑制浓度（MIC）的2倍以上时，可以被抑制；非
常耐药（V）表示细菌在抗菌药物的抑制浓度低于最小抑制浓
度（MIC）的4倍以上时，可以被抑制。
NCCLS细菌药物敏感试验判定标准的细菌敏感性报告主要由
药物敏感性测定方法（如药物抑制浓度法、可溶性药物抑制浓度法等）得出的最小抑制浓度（MIC）和敏感性等级（S、I、
R和V）组成。
细菌对抗菌药物的敏感试验(实验)
5．质量控制
采用标准菌株与测试菌在同一条件下做药敏试验。 标准菌株的抑菌圈应落在预期范围内。如果超出该范围， 则不应发出报告，及时检查原因，予以纠正。
ATCC25923 金黄色葡萄球菌 ATCC25922 大肠埃希菌 ATCC27853 铜绿假单胞菌 ATCC29212 或 33186 粪肠球菌
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
无菌棉签 涂布
MH琼脂表面
室温 5min
贴含药纸片 35℃ 观察 16～18h 结果
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
＞15mm ＞24mm
3．结果解释 测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
4.影响纸片法药敏结果的因素 ①培养基质量 成分、pH、深度、硬度和表面 湿度等。 ②药敏纸片的质量 含药量和保存方式。 ③接种菌量 ④操作质量 接种后贴药片的时间；培养温度 和时间；抑菌圈测量工具的精度
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
抗菌药物敏感性试验
成都医1.掌握纸片扩散法（K-B法）原理、操作 方法、结果的判读及其临床意义。
2.掌握纸片扩散法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法）
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌ATCC25923、 大肠埃希菌ATCC25922
（幼龄菌，1.5×108/ml） 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）平板，1个/人 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、红霉素(ERY)、庆大
霉素（GEN） 4. 其它：无菌生理盐水、无菌棉签、镊子、 接种环、
刻度尺（自带）、0.5 麦氏比浊管（相当于 1.5×108CFU/ml）
2023年《抗菌药物敏感性试验的技术要求》试题及答案
2023年《抗菌药物敏感性试验的技术要求》
试题及答案
1、β酰胺酶阳性说明对（E）耐药
A、青霉素
B、氨基青霉素
C、羧基青霉素
D、脲基青霉素
E、以上都是
2、检测金黄色葡萄球菌β内酰胺酶产生的方法，不正确的是（D）
A、检测方法为青霉素纸片扩散法
B、培养基为MHA
C、药物浓度为青霉素纸片（10单位）
D、孵育条件为室温环境
E、孵育时间16-18h
3、β内酰胺酶检测的质控菌株为（B）
A、流感嗜血杆菌
B、金黄色葡萄球菌
C、粪肠球菌
D、淋病奈瑟菌
E、卡他莫拉菌
4、药敏试验结果解释SDD指的是（B）
A、敏感
B、剂量依赖型敏感
C、中介
D、耐药
E、非敏感
5、药敏试验测试药物的分组U组为（D）
A、常规测试并报告
B、常规测试选择性报告
C、补充测试选择性报告
D、泌尿道感染
E、脑脊液感染。
细菌对抗菌药物的敏感试验
族
青霉素
不 产 青 霉 素 10U
≤28
—
≥29 ≥0.25
酶葡萄球菌
肠 球 菌 属 细 10U
≤14
—
菌
— ≥16
链 球 菌 属 细 10U
≤19
—
≥28 ≥4
菌
淋病奈瑟菌 10U 甲 氧 苯 青 霉 1µg 素
≤26 ≤9
27—46 10—13
≥47 ≥14
≥2 ≥16
苯唑青霉素 1µg
≤10 11—12 ≥13 ≥4
2、血药浓度（血清中抗菌药 物的浓度）
在使用各类抗菌药物时，常常会遇到 的一个重要问题，就是血药浓度。例如： 口服抗菌药物总是经肠道逐渐吸收入血 的。因此，血液中的药物浓度是从无到 有随时间的延长逐渐增高的。即使静脉 注射抗菌药物，因存在着首过效应（第 一关卡效应）和肾脏的排泄作用，血药 浓度也是随着注射的次数而逐渐增高的。
（1）β-内酰胺酶(β-Lactamase)。它是细 菌对β-内酰胺类抗菌药耐药的主要原因， 由于β-内酰胺酶的产生，使其β-内酰胺
环的酰胺键断裂而失去抗菌活性。该类
酶可以为染色体介导，也可为质粒介导。 Bush 根据底物及酶抑制剂的作用类型将 β-内酰胺酶分为4种，即A组β-内酰胺酶 (主要水解青霉素类)，B组金属酶(其活 性部分是结合锌离子的硫醇)，C组β-内 酰胺酶(主要水解头孢菌素类)，D-组β-内 酰胺酶(苯唑西林水解酶)。
10、市场销售中最重要的字就是“问”。03:33:0803:33:0803:337/28/2021 3:33:08 AM
11、现今，每个人都在谈论着创意，坦白讲，我害怕我们会假创意之名犯下一切过失。21.7.2803:33:0803:33Jul-2128-Jul-21
药敏试验
种、耐药菌株以及病原菌的鉴定。但由
于此法难以控制接种菌量，且标本中可
能存在多种细菌，因此还需要在病原菌 分纯后再用K—B法对其进行验证和补充。
2 稀释法
1） 肉汤稀释法
包括试管稀释法和微量稀释法。下面重点 讲述试管稀释法（常量稀释法）。
（1）. 原理：以水解酪蛋白（MH）液体培养基 将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待测细 菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓 度(MIC)或最低杀菌浓度（MBC）。
3. 提供所选择药物的依据；
4. 监测耐药性，分析耐药菌的变迁， 掌握耐药菌感染病的流行病学，控制 和预防耐药菌感染的发生和流行。
（二）药敏试验方法
1 纸片扩散法 1）K-B纸片琼脂扩散法
（1）原理：将含有定量抗菌药物的纸片 贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中 所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便 不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯 度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度。并与该药对测试菌的最低抑菌浓 度（MIC）呈负相关关系，即抑菌圈愈大， MIC愈小。
菌液(ml)： 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
（1.5×107 /ml)
混匀
35℃ 16~20h
观察结果
注意 :设立对照管(肉汤对照管,待测菌生长对照管 和质控菌生长对照管.
最 低 抑 菌 浓 度 （ minimal inhibitory concentration,MIC）： 细 菌 生 长 被 完 全 抑 制 的 最低药物浓度为该药对测试菌的MIC。
最 低 杀 菌 浓 度 （ minimal bacteri 菌 药 物 能 杀 灭 99.9%以上测试菌时的最低药物浓度。
于此法难以控制接种菌量，且标本中可
能存在多种细菌，因此还需要在病原菌 分纯后再用K—B法对其进行验证和补充。
2 稀释法
1） 肉汤稀释法
包括试管稀释法和微量稀释法。下面重点 讲述试管稀释法（常量稀释法）。
（1）. 原理：以水解酪蛋白（MH）液体培养基 将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待测细 菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓 度(MIC)或最低杀菌浓度（MBC）。
3. 提供所选择药物的依据；
4. 监测耐药性，分析耐药菌的变迁， 掌握耐药菌感染病的流行病学，控制 和预防耐药菌感染的发生和流行。
（二）药敏试验方法
1 纸片扩散法 1）K-B纸片琼脂扩散法
（1）原理：将含有定量抗菌药物的纸片 贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中 所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便 不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯 度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度。并与该药对测试菌的最低抑菌浓 度（MIC）呈负相关关系，即抑菌圈愈大， MIC愈小。
菌液(ml)： 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
（1.5×107 /ml)
混匀
35℃ 16~20h
观察结果
注意 :设立对照管(肉汤对照管,待测菌生长对照管 和质控菌生长对照管.
最 低 抑 菌 浓 度 （ minimal inhibitory concentration,MIC）： 细 菌 生 长 被 完 全 抑 制 的 最低药物浓度为该药对测试菌的MIC。
最 低 杀 菌 浓 度 （ minimal bacteri 菌 药 物 能 杀 灭 99.9%以上测试菌时的最低药物浓度。
药敏试验操作方法
制作步骤：
1、纸片的准备 2、药液的配制 3、抗菌药敏纸片制作
质控：标准菌株的抑菌 圈直径应落在预期范围 内，如果超出该范围， 应视为失控而予以纠正。
简易药敏片的制法
纸片的准备：
1、取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆 形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中， 瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后， 放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。
3、为经验用药提供所选药物的参考依据，可预测抗菌 治疗的效果。“敏感”治疗可能有效；“耐药” 肯定 失败
4、新抗菌药的研究
以下情况不需进行药敏测定：
标本污染细菌，非致病菌引起 已知某些抗菌药对某菌有良好的抗菌作用且很少
有耐药菌产生 已知细菌全部耐药的药物 对营养要求高而不易生长的细菌
二、常用的药敏测定方法
3、E测定法（E test）：
与扩散法相似，但药物包被于长塑料条上，能够精确测定 MIC值。适于一些特殊病原菌的药敏测试，但价格较为昂贵。品（单品药、药厂的成品药、中药）、恒温培养箱、药敏片、 培养基、平皿（直径90mm）、烧杯、蒸馏水、滤纸、打孔器（文 具店有售）、
1、纸片琼脂扩散法（3/3）
3、培养观 察
将平 皿培养基 置于37℃ 温箱中倒 置培养24 小时后， 观察效果
2、牛津杯法
第一步同“纸片法”细菌涂抹平板。 以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、
高10 nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、 瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接 触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可 放4-6支小管。待分钟后，分别向各小管中滴加一定数 量的各种药液，勿使其外溢。
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操作
待检菌液
无菌棉签 涂布
MH琼脂表面
室温 5min
贴含药纸片 35℃ 观察 16～18h 结果
操作注意事项：
• 菌液应在15分钟内接种完毕 • 注意纸片距离
＞15mm ＞24mm
3．结果解释
• 测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
• 敏感(susceptibile ，S) 推荐剂量的抗菌药物 在体内达到的血药浓度能抑制或杀死待测菌。
•常量肉汤稀释法 •微量肉汤稀释法 •琼脂稀释法
（一）肉汤稀释法
试管肉汤稀释法和微量肉汤稀释法。 1.试管肉汤稀释法
• 方法
– 抗 生 素 的 配 制 （ μ g/ml ） ： 512 、 256 、 128……
– 培养基：MH肉汤 – 待检菌液：107CFU/ml
方法
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
以扩大病原治疗的覆盖面； ② 治疗多种细菌所引起的混合感染； ③ 对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用； ④ 减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生； ⑤ 减少治疗指数低的抗菌药物的用量从而减轻其毒副
作用。
• 联合药敏试验的常用方法
– 纸片扩散法 – 棋盘法
• 特点：
– 操作简便同扩散法， – 同稀释法一样可以直接定量出测试药物对测试
M-H肉汤(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
抗生素(ml) 菌液(ml)
1
1
1
1
1
1
1
1
1弃 －
去
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
35℃孵育16~18h，观察结果
结果观察 以完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC
左起第四管为药物最低浓度而肉眼无细菌生长，即待测菌的MIC为16mg/L
与核糖体50S亚基结合，抑制肽 氯霉素、甲砜霉素等 酰基转移酶，使肽链延伸受阻， 从而抑制蛋白质合成。
抗菌药物种类
作用机理
主要药物
喹喏酮类 抑制DNA复制中的回旋酶， 第一代：窄谱，对G+菌无作用，
阻碍DNA的解链。
目前少用
第二代：G+菌和G-菌均有作用 （环丙沙星、氧氟沙星）
第三代：超广谱（司帕沙星、 妥舒沙星、左氟沙星）
• 质量控制 基本和肉汤稀释法相同，每个琼脂平
板应同时接种标准菌株。
• 优点：可同时作多株细菌的MIC测定，结果的可靠
性优于肉汤稀释法，且易发现污染或耐药交叉株， 是开发新药的体外药敏试验常用的经典参照标准
• 缺点：费时费力
（三）E试验
• 原理：是一种结合了稀释法扩散法的原理和特点测
定细菌对抗菌药物的敏感度的定量技术。
抑 磺胺类
制
核
酸
合 成
利福霉素 类
硝基呋喃
类
与对氨基苯甲酸（PBPA） 磺氨甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺 竞争二氢叶酸合成酶，阻断 甲氧吡嗪等 叶酸的合成，使细菌DNA 合成受阻。
抑制细菌mRNA合成，最后 利福霉素、利福平等 导致DNA和蛋白合成停止。
进入菌体后，经还原产生的 呋喃坦啶、呋喃唑酮 衍生物可使DNA链断裂
影响因素
培养基的组成、pH、渗透压、电解质 接种菌量 抗菌药物 质、量 培养时间
质量控制
采用标准菌株同批测试，MIC应当在相应的质
控范围内。如超出该范围则应检查原因，及时
纠正。
（二）微量肉汤稀释法
• 微量肉汤稀释法的含药微孔板（条）有多种
现成的商品试剂供应，并常与自动化仪器配 套使用。
与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关， 即抑菌圈越大，MIC越小。
2．方法
• 抗菌药物纸片 自制或商品供应。-20℃保存备用 • 培养基 水解酪蛋白(Mueller-Hinton,MH)琼脂
琼脂厚度4mm
• 待检菌液 1.5×108 CFU／ml
菌液制备方法：
– 直接菌落悬液法 – 液体生长法
（二）稀释法（dilution method）
用培养基将抗菌药物作不同浓度稀释，再接种待检细
菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死细菌的最低抗生素 浓度。
最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,
MIC)
最低杀菌浓度(minimal bactericidal
concentration, MBC)
细菌对抗菌药物敏感试验
成都医学院 临床微生物学教研室
药敏试验的目的： 预测治疗效果（否定＞肯定），为临床医生
选择药物提供依据 监测耐药性的变迁及流行趋势 对新研制的抗菌药物的抗菌谱及抗菌活性进
行评价 鉴定细菌
一、常用抗菌药物及其作用机理
抗菌药物种类
β-内酰胺类
干 扰 细 胞 壁 合 成
分子生物学试验 PCR直接检测mecA基因 酶试验 β -内酰胺酶、超广谱β -内酰胺酶（ESBL）
（一）纸片琼脂扩散法(Kirby-Bauer test)
• 美国临床和实验室标准化学会（Clinical and
Laboratory Standards Institute ,CLSI）推 荐的标准实验方法。 CLSI过去称作美国国家临 床实验室标准委员会(National Committee of Clinical Laboratory Standard, NCCLS)
纸片法联合药敏试验的结果与类型
1.协同作用 A+B＞A＋B
2.相加作用 A+B＝A＋B
3.无关作用 A+B＝A或B
4.拮抗作用 A+B＜A或B
②药敏纸片的质量 含药量和保存方式。 ③接种菌量 ④操作质量 接种后贴药片的时间；培养温度
和时间；抑菌圈测量工具的精度
5．质量控制
采用标准菌株与测试菌在同一条件下做药敏试验。 标准菌株的抑菌圈应落在预期范围内。如果超出该范围， 则不应发出报告，及时检查原因，予以纠正。
ATCC25923 金黄色葡萄球菌 ATCC25922 大肠埃希菌 ATCC27853 铜绿假单胞菌 ATCC29212 或 33186 粪肠球菌
菌的MIC – 结果准确、重复性好。
• 缺点：成本较贵
1.纸片法联合药敏试验
• 纸片法联合药敏试验所用的培养基、药敏纸片、
菌液和培养条件等均和纸片法药敏试验相同。
• 将所要试验的两种药敏纸片邻近贴在涂菌的琼脂
平板上，使两纸片的中心距离恰好等于两药敏纸 片单独试验时抑菌圈的半径之和，按规定条件孵 育之后观察抑菌圈的形状改变，并据此判断两药 联合药敏试验的结果
• 耐药(resistant，R)：常规剂量的抗菌药物在体 内达到的血药浓度不能抑制或杀死待测菌。
• 中介（intermediate，I）抗菌药物在生理浓集 的部位具有临床效果；也代表缓冲区域，以防止 由微小的技术因素导致的结果偏差。
4.影响纸片法药敏结果的因素
①培养基质量 成分、pH、深度、硬度和表面 湿度等。
E试条是一种宽5mm、 长50mm的商品化塑料试 条，一面固定有干化、 稳定的、浓度呈连续指 数增长分布的抗菌药物， 另一面有药物的浓度刻 度读数（μg/ml）
• 方法：同纸片琼脂扩散法
（四）联合药敏试验
临床上在以下情况下需联合使用抗菌药物： ① 用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治疗，
作用于细胞壁，与粘 万古霉素、替卡拉宁等 肽的侧链形成复合物， 抑制肽聚糖链延伸或 肽链交联。
抗菌药物 种类
氨基糖 苷类
四环素 抑类 制 蛋 白 大环内 质 酯类 合 成 林可酰
胺类
氯霉素 类
作用机理
主要药物
与30S小亚基不可逆地结合，抑 庆大霉素、妥布霉素、
制蛋白质的合成。
奈替米星、阿米卡星、
大观霉素等
• 目前各国临床微生物学实验室广泛采用。
1．原理
• 将含有定量抗菌药物的纸片贴在测
试菌的琼脂平板上，纸片中所含的 药物溶解后不断地向纸片周围扩散， 形成递减的浓度梯度。在纸片周围 可抑菌浓度范围内测定菌的生长被 抑制，从而形成无菌生长的透明圈 抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感性，并
糖肽 类
作用机理
主要药物
竞争性与PBPs结合， 1.青霉素类（天然青霉素、耐酶青霉素、
抑制肽聚糖合成所需 广谱青霉素等）
的转肽酶、羧肽酶或 2.头孢菌素类（第1代～第4代）
二肽酶等，从而抑制
3.单环β－内酰胺类（氨曲南、卡芦莫南） 4.头霉素类 （头孢西丁、头孢替坦、头孢
细胞壁的合成。
美唑）
5.氧头孢烯类（拉氧头孢） 6.碳青霉烯类（亚胺培南、美罗培南 等） 7.青霉烯类（呋罗培南 、利替培南酯等） 8.β-内酰胺酶抑制剂（克拉维酸、舒巴坦）
硝基咪唑 类
通过其分子中的硝基在无氧 环境中还原成氨基或通过自 由基的形成，与细胞成分相 互作用，从而导致微生物的 死亡。
甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等
二、AST的常用方法
手工试验
1.纸片扩散法（S，I，R） 2.稀释法（MIC） 3.E test（MIC）
自动仪器 1. Vitek 2. Microscan 3. Sensititre
（三）琼脂稀释法
• 原理：将不同浓度的抗菌药物混匀于琼脂培养基中，
接种细菌，孵育后观察细菌的生长情况来确定MIC。
• 方法：制备含药琼脂（药液：琼脂=1：9 ）→ 点
种细菌（1-2μ l）→ 35℃孵育16-20h →观察结果
• 结果观察：点种菌液处未见细菌生长即是被药物所
抑制。菌落生长被完全抑制的最低药物药物浓度为 该药对待测菌的MIC（μ g/ml）。
作用于核糖体30S亚基A位，影 响蛋白质合成初始阶段和释放， 相互之间存在着密切的交叉耐药 性。