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刺萼龙葵PDS基因VIGS载体的构建王旭;王新果;张朝贤;黄红娟;魏守辉【摘要】病毒诱导的基因沉默(VIGS)是通过插入目的基因片段的重组病毒来抑制植物内源基因表达的遗传技术,主要用于基因的功能分析.茄科植物刺萼龙葵(Solanum rostratum)是一种外来恶性杂草,研究证实,在农杆菌GV3101介导下,刺萼龙葵的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因能被部分沉默,导致叶片和花朵出现白化表型.半定量RT-PCR检测显示,被侵染叶片和花朵的mRNA显著降解.VIGS沉默体系的建立可适用于研究刺萼龙葵的部分功能基因,有助于深入了解其生长发育调控的分子机制.【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2016(042)004【总页数】5页(P137-141)【关键词】刺萼龙葵;八氢番茄红素脱氢酶;病毒诱导基因沉默;烟草脆裂病毒【作者】王旭;王新果;张朝贤;黄红娟;魏守辉【作者单位】中国农业科学院植物保护研究所,北京 100193;中国农业科学院植物保护研究所,北京 100193;中国农业科学院植物保护研究所,北京 100193;中国农业科学院植物保护研究所,北京 100193;中国农业科学院植物保护研究所,北京100193【正文语种】中文【中图分类】S451基因沉默是生物体中特定基因由于种种原因不表达的现象,分为转录水平的基因沉默(transcriptional gene silencing, TGS)和转录后水平的基因沉默(post transcriptional gene silencing, PTGS),TGS发生在DNA水平,与目的基因启动子区域的甲基化有关;PTGS发生在RNA水平,由目的基因mRNA特异性降解引起。
PTGS最早在植物中发现,被称为共抑制(co-suppression)[1-2],后来在真菌和动物中也发现该现象,分别被称为基因消除(quelling)[3]和RNA干扰(RNA interference,RNAi)[4]。
广藿香PcGA2ox1基因克隆、VIGS载体构建和表达分析作者：严雅玲曾晴严寒静何梦玲张宏意来源：《山东农业科学》2024年第05期關键词：广藿香；赤霉素2-氧化酶（GA2ox）；基因克隆：病毒诱导基因沉默（VIGS）；表达分析广藿香[Pogostemon cablin（Blanco）Benth.]为唇形科刺蕊草属植物，以干燥地上部分人药，原产于东南亚菲律宾、马来西亚等热带地区，宋朝时期传人我国并在南方广泛种植，道地产区主要分布在两广、岭南等，故而有广藿香之称。
广藿香少有开花，很难结果，因而主要采用扦插方式繁殖，但扦插繁殖慢且易引起种质退化，难以培育出优质品种。
因此，通过促进侧枝发育增加地上部分的比重，从而提高广藿香产量，对选育品质优良的广藿香意义重大。
赤霉素（gibberellins，GAs）是一种重要的植物内源激素，调控植物生命周期的各个阶段，在根茎叶伸长、侧枝发育、花期调控、种子休眠等方面发挥作用。
植物体内的GAs分为有活性和无活性两类，其中GA1和GA4为有活性类。
GA20x（gibberellin 2-oxidases）作为赤霉素代谢途径中的一个关键酶，可以将活性赤霉素（GAI和GA4）降解为无活性状态，限制有生物活性GAs的含量，从而调节植物发育，如在拟南芥中阻止种子萌发、延迟无性繁殖、改变花期、限制主茎和侧芽的伸长等。
一般而言，植物体内GA2ox过表达会使活性GAs含量降低，从而使植株表现为矮化，而将其沉默，则会促进茎的伸长和植株生长。
目前已有众多植物GA2ox基因被成功克隆并进行了相关研究，如GA2ox基因在油菜籽、早熟禾、油茶等植物中过表达呈现出矮化表征，生物量减少、开花延迟、叶片颜色呈深绿色等：相反，在烟草中沉默GA2ox可以显著促进烟草生长和提高纤维产量。
目前GA2ox基因在烟草、拟南芥、番茄等植物中已有研究，但未见广藿香GA2ox基因的相关研究报道，为此，本研究基于本课题组前期获得的广藿香转录组数据，对其GA2oxl基因进行克隆和生物信息学分析，以探寻GA2ox基因在广藿香中的作用，为后续研究矮化广藿香、促进侧枝发育和增加产量等提供有力依据。
第一实验：以烟草脆裂病毒为载体通过基因沉默分析植物基因功能（VIGS）一、目的掌握一种分析植物基因功能的方法二、原理在病毒载体中插入某一外源基因，然后侵染宿主可引起宿主体内相应基因或序列相似基因的沉默。
病毒侵染宿主后导致的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）这一流程如图1-1。
其中修饰后的烟草脆裂病毒（TRV）的载体克服了其他病毒载体所固有的缺点。
它便于非病毒序列的插入和随后对植物的侵染、介导VIGS缺乏病毒侵染后产生的症状或产生非常轻的症状、侵染的面积比较大、导致的VIGS维持的时间比较长。
特别是它能在植物生长点产生基因沉默，锁定宿主的RNAs，然后可通过比较基因沉默后植物的表型等方法来分析基因的功能。
TRV可以侵染12属的60多种植物，如烟草、番茄、马铃薯等。
以上这些特点使TRV载体在发现植物基因和分析基因功能方面得到广泛的应用。
图1-1 病毒引起的植物基因沉默图1-2 TRV载体A：野生型TRV RNA1的结构及位于植物双元转化系统质粒p TRV1中的cDNA克隆；B：野生型TRV RNA2结构及位于植物双元转化载体系统质粒pTRV2中的TRV RNA2的cDNA克隆。
其中Lb、Rb：T-DNA 的左、右边界DNA序列；RdRp：依赖RNA的RNA聚合酶；35S：CaMV的35S启动子；MCS：多克隆位点；T：转录终止点；16K、29.4K、32.8K分别为病毒编码的蛋白序列；CP：病毒编码的外壳蛋白序列；Int：插入病毒基因的内含子；MPbd的运动蛋白TRV是正链RNA病毒，包括两个基因组分，其中RNA1编码病毒在植物中的复制和运动所需的蛋白，RNA2编码病毒组装和介体传播所需的蛋白。
在构建载体时把RNA1和RNA2的cDNA分别克隆在植物转化所用的农杆菌的双元载体系统中的两个质粒上，具体结构如图1-2所示。
迎春花的作文关于迎春花的作文350字（精选36篇）迎春花的作文篇1春天有碧绿的树苗，娕嫩的小草，但更让我陶醉的还是那些香香的花儿。
春天的花有荼花，有迎春花，有杜鹃花……这么多花，每朵花有每朵花的姿势（态），不过在这些花中我最喜欢迎春花。
迎春花的花朵只有大姆指那么大，但是让人觉得春意浓浓的，使人心情舒爽。
迎春花生长在一些象柳枝一样的枝条上，这些花儿好象是从树枝里跳出来的。
有的花朵藏在叶子下，好象是很害羞，不愿意让人看见它，有的花儿望着地下的草地丛，好象是在叫醒冬天的昆虫，来好好地看看春天，有的花儿高兴地昂着头，好象想让人们看看它自信的脸蛋。
我情不自禁地伸出双手，拉一拉那长长的枝条，枝条软软的，我再（轻轻的抚摸）揉一揉那尖尖的绿绿的叶子，我顿时感到有一点粗糟，我现在又想摸摸那小七玲珑的花瓣，我摸了摸，很娇嫩，嗯，很柔软。
我很小心，这时小花抖了抖，好象在说：“你好！”迎春花真美！迎春花的作文篇2课余时，我约上我的好朋友小兰，打算一起去欣赏迎春花。
我们来到走廊边的花坛前。
突然，眼前一亮，哇！好大一片黄橙橙的花海！只见花坛里的迎春花已经悄悄地绽放了，它们正排着整齐的队伍，迎接着春天的到来。
瞧！迎春花的每根枝条上都“串”着大约二十朵花朵。
每朵花差不多像一枚一元的硬币那么大。
它们一般都由六片花瓣主成，颜色接近于金黄色，每一片花瓣都是上宽下窄的，很像瓜子的形状。
中间的花蕊一排一排的，非常短，颜色有点发白。
枝条上的叶子碧绿碧绿的，把迎春花衬托的更加美丽了。
看着看着，一阵微风吹过，我和小兰不禁都打了个冷颤。
而那些迎春花儿却一朵朵精神抖擞的随风飘荡着，有的好像在说：“风姑娘，你吹吧，把我的香味带给同学们吧！”又有的好像在说：“来吧，风姑娘！我才不怕你呢！”……看到这儿，我觉得迎春花儿那坚强、不惧严寒的精神，不正是我们大家需要学习的吗？迎春花的作文篇3在公园，在路边，在小区，在校园……在我们大家的生活中，如果当你看见一朵朵迎春花争奇斗艳的时候，你就知道，春天来了！迎春花，顾名思义，就是迎接春天的鲜花。
![一种珊瑚菜PDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/606a650242323968011ca300a6c30c225901f081.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011227917.7(22)申请日 2020.11.05(71)申请人 江苏省中国科学院植物研究所地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇国家农业科技园江苏省中国科学院植物研究所基地(72)发明人 李莉 周义峰 梁呈元 房海灵 亓希武 于盱 柏杨 刘冬梅 (74)专利代理机构 南京申云知识产权代理事务所(普通合伙) 32274代理人 邱兴天(51)Int.Cl.C12N 15/82(2006.01)A01H 6/06(2018.01)A01H 5/12(2018.01)(54)发明名称一种珊瑚菜PDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种珊瑚菜PDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用，属于生物技术领域。
本发明通过构建含有珊瑚菜PDS基因特异性片段的pTRV II病毒沉默表达载体质粒，协同pTRV I质粒，通过农杆菌介导法侵染珊瑚菜组培苗，使珊瑚菜PDS基因发生沉默，有效降低了PDS表达水平，导致叶片白斑白化表型。
本发明在珊瑚菜中建立了快速、有效的VIGS病毒沉默体系，操作简单，实验周期短，有效解决验证珊瑚菜基因功能的问题。
权利要求书1页 说明书3页序列表2页 附图2页CN 112375780 A 2021.02.19C N 112375780A1.一种珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系，其特征在于，所述沉默体系具有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
2.权利要求1所述的珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取珊瑚菜叶片RNA，反转录获得珊瑚菜cDNA；2)依据珊瑚菜转录组数据库基因注释信息得到PDS mRNA序列信息，设计用于沉默珊瑚菜PDS基因的特异性核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示；3)设计用于沉默珊瑚菜PDS基因的特异性核苷酸片段的引物，并以珊瑚菜cDNA为模板进行PCR扩增；4)将PCR扩增产物连接到pTRV II上，构建得到珊瑚菜PDS基因的VIGS沉默体系，即pTRV II -PDS。
刺萼龙葵提取物杀虫活性初步研究邢庆新;陶晡;张金林【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2013(36)6【摘要】利用不同有机溶剂提取刺萼龙葵(Solanum rostratum Dunal)的生物活性物质,分别用浸渍法和浸渍饲喂法测定了提取物对麦蚜和小菜蛾的杀虫活性,并采用高速逆流色谱技术(HSCCC)对树脂纯化后的物质进行了分离.结果表明:pH=2的盐酸溶液提取效率最高,为0.061,其次为95％乙醇(0.051)、乙酸乙酯(0.048)、丙酮(0.038)和石油醚(0.032);前两种溶剂的提取物对麦蚜和小菜蛾杀虫效果较好,对麦蚜72 h校正死亡率分别为83.45％和82.05％,对小菜蛾72 h校正死亡率分别为64.85％和62.9％;HSCCC分离得到7个组分,组分7和组分5具有较高的杀虫活性,24 h校正死亡率分别为74.5％和69.2％.本研究结果为深入研究刺萼龙葵的杀虫活性奠定了基础.【总页数】4页(P89-92)【作者】邢庆新;陶晡;张金林【作者单位】河北农业大学植物保护学院,河北保定071001;河北农业大学植物保护学院,河北保定071001;河北农业大学植物保护学院,河北保定071001【正文语种】中文【中图分类】S482【相关文献】1.21种茎叶处理除草剂对刺萼龙葵的生物活性研究 [J], 张少逸;魏守辉;李香菊;史致国;黄红娟;曹新明;王金信;张朝贤2.五种土壤处理除草剂对刺萼龙葵的生物活性研究 [J], 张少逸;张朝贤;王金信;黄红娟;张建华;曹坳程;魏守辉3.五种土壤处理除草剂对刺萼龙葵的生物活性研究 [J], 张少逸;张朝贤;王金信;黄红娟;张建华;曹坳程;魏守辉;4.外来入侵有害植物刺萼龙葵(Solanum rostratum Dunal.)幼苗的形态学特征初步研究 [J], 张延菊;曲波;刘更林;白艳伟;董文轩5.刺萼龙葵与少花龙葵植物内生菌比较研究 [J], 张喜苇;张伊凡;张玉瑶;徐雯;黄婷;张晶因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
VIGS载体在果树中的应用研究进展
张新华;季娜娜;闵德栋;邵淑君;李富军
【期刊名称】《果树学报》
【年(卷),期】2017(34)4
【摘要】病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物中天然存在的一种抵御外源核酸入侵的防御反应,属于转录后基因沉默现象,现在已被开发成通过改造含有目的基因片段的病毒载体来抑制植物内源基因表达的遗传技术。
与传统的植物转基因技术相比,VIGS技术具有简便、高效、高通量的优势,近年来在果树基因功能的研究中发挥了重要作用。
由于VIGS技术需要借助病毒载体来实现,所以选择适宜的病毒载体是在性状各异的果树中成功构建VIGS体系的关键。
本文介绍了在果树中应用的VIGS载体及其在基因功能研究中的应用实例,并分析了病毒载体在诱导果树基因沉默时存在的一些问题及解决方法。
【总页数】8页(P507-514)
【关键词】果树;病毒诱导的基因沉默;病毒载体
【作者】张新华;季娜娜;闵德栋;邵淑君;李富军
【作者单位】山东理工大学农业工程与食品科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】S66
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3.VIGS技术的研究进展及其在葫芦科作物中的应用 [J], 刘美;刘莉铭;吴会杰;古勤生
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5.VIGS技术在禾本科植物中的应用研究进展 [J], 李淼淼;南富波;刘伟;李卫华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
关于在朝阳铲除刺萼龙葵的建议
曲智;庄武;曲波;董淑萍;高明和;兰希平
【期刊名称】《农业环境与发展》
【年(卷),期】2009(26)4
【摘要】总结了刺萼龙葵的生物学特性,结合当地调查,初步摸清了刺萼龙葵在朝阳市发生的总体情况,并根据当地实际情况提出防控建议和防治措施.
【总页数】2页(P53-54)
【作者】曲智;庄武;曲波;董淑萍;高明和;兰希平
【作者单位】辽宁省农业环境保护监测站,辽宁,沈阳,110034;辽宁省农业环境保护监测站,辽宁,沈阳,110034;沈阳农业大学,辽宁,沈阳,110161;辽宁省农业环境保护监测站,辽宁,沈阳,110034;辽宁省农业环境保护监测站,辽宁,沈阳,110034;辽宁省农业环境保护监测站,辽宁,沈阳,110034
【正文语种】中文
【中图分类】X7
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浅析朝阳地区刺萼龙葵的防控策略张璐【摘要】文章总结了刺萼龙葵的生物学特性、危害、防控办法,初步摸清了刺萼龙葵在朝阳地区发生的总体情况,提醒相关部门高度重视,并根据当地实际情况出台具体防治措施,保护区域生态系统和人类健康安全。
【期刊名称】《现代农业》【年(卷),期】2011(000)010【总页数】2页(P22-23)【关键词】刺萼龙葵;防控策略;朝阳地区【作者】张璐【作者单位】辽宁省朝阳市农业环境监测保护站【正文语种】中文【中图分类】S451刺萼龙葵原产于北美洲，又叫黄花刺茄，其繁殖和适应能力强，为茄科茄属一年生草本植物，叶片、茎、果实均长满坚刺，是一种高度危险的检疫性有害生物的典型代表。
1813年由法国植物学家Michael Felix Dunal定名以来，国外学者相继对其生物学特性、所造成的危害及防治对策等进行了研究。
1982沈阳农业大学关广清教授在朝阳县首次发现刺萼龙葵[1]，农业部将其列为限制输入的检疫杂草。
1992年刺萼龙葵被辽宁植物志收录[2]。
经过近30年的适应生长，刺萼龙葵已适应朝阳当地环境，并开始大面积大趋势的蔓延，已给朝阳市的经济环境造成了严重影响。
一、刺萼龙葵的特征直根系，茎直立，植株高10～100厘米，除花瓣外，整个植株皆被长短不等带黄色的锥状刺，刺长0.3～1厘米，植株表面带有星状毛[3]。
4月或5月上旬当气温达到10℃时刺萼龙葵种子即开始发芽，5月下旬至 6月中旬开花，7月初果实形成，8月中、下旬果实逐渐成熟，浆果由绿变为黄褐色，直径0.5～1.2厘米，完全被具尖刺及星状毛的硬萼包被，萼裂片直立靠拢成鸟喙状，果皮薄，萼自顶端开裂后种子散出。
种子2～3毫米，黄褐色至黑色，表面蜂窝状[4]。
9月末至10月初降霜后刺萼龙葵植株萎蔫枯死，整个生长期约150天。
二、刺萼龙葵的危害刺萼龙葵的种子具有致密而坚厚的种皮，可使胚得到更好的保护，能够抵抗不良环境，虽然其种子发芽率低，但在恶劣的条件下能够长期保持活力。
刺萼龙葵PDS基因VIGS载体的构建作者：王旭王新果张朝贤黄红娟魏守辉来源：《植物保护》2016年第04期摘要病毒诱导的基因沉默（VIGS）是通过插入目的基因片段的重组病毒来抑制植物内源基因表达的遗传技术，主要用于基因的功能分析。
茄科植物刺萼龙葵（Solanum rostratum）是一种外来恶性杂草，研究证实，在农杆菌GV3101介导下，刺萼龙葵的八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因能被部分沉默，导致叶片和花朵出现白化表型。
半定量RT-PCR检测显示，被侵染叶片和花朵的mRNA显著降解。
VIGS沉默体系的建立可适用于研究刺萼龙葵的部分功能基因，有助于深入了解其生长发育调控的分子机制。
关键词刺萼龙葵；八氢番茄红素脱氢酶；病毒诱导基因沉默；烟草脆裂病毒中图分类号： S 451文献标识码： A基因沉默是生物体中特定基因由于种种原因不表达的现象，分为转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing， TGS）和转录后水平的基因沉默（post transcriptional gene silencing， PTGS），TGS发生在DNA水平，与目的基因启动子区域的甲基化有关；PTGS发生在RNA水平，由目的基因mRNA特异性降解引起。
PTGS最早在植物中发现，被称为共抑制（cosuppression）[12]，后来在真菌和动物中也发现该现象，分别被称为基因消除（quelling）[3]和RNA干扰（RNA interference，RNAi）[4]。
虽然RNA沉默在不同生物体中称谓不同，但是他们却有相似的作用机制。
病毒诱导的基因沉默（virusinduced gene silencing，VIGS）是指携带植物目的基因的病毒在侵染植物体后诱导植物内源靶基因沉默的现象，至今已经建立了以RNA病毒、DNA病毒、卫星病毒和DNA卫星分子为载体的VIGS体系。
这些病毒载体能在多种寄主植物包括拟南芥、番茄[5]、烟草[6]、辣椒[7]、马铃薯[8]上有效抑制功能基因的表达，其中应用VIGS技术在番茄中已经验证或鉴定了上百种基因，涉及生长发育、代谢调控、生物防御及非生物胁迫应答等诸多方面。
刺萼龙葵是一种具有潜在重大危害的外来物种，为茄科茄属的一年生草本植物，与番茄亲缘关系较近。
目前国内的研究主要集中在其生物生态学特性[9]、风险评估[10]、药剂防控[11]、化学成分、生物活性[12]及不同地区表型变异[13]等方面，尚未深入研究刺萼龙葵的生理生态特征背后的分子机制，而这首先需要寻找并鉴定其相关的功能基因，但目前并没有成功建立该植物的遗传转化体系。
生物信息学和转基因技术的缺乏严重影响了刺萼龙葵分子生物学研究的开展。
VIGS技术耗时少，不需要进行遗传转化和组织培养，加速了基因的功能分析。
烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus， TRV）已被成功运用于番茄、烟草、马铃薯、茄子等茄科植物建立VIGS体系。
刺萼龙葵也属于茄科，这意味着TRV也能有效运用于该种植物建立VIGS技术体系。
在不同的植物中建立VIGS体系，一般选用八氢番茄红素脱氢酶（phytoenedesaturase， PDS）基因作为报告基因。
PDS是类胡萝卜素合成途径的限速酶基因，主要在植物叶片、花朵和果实中表达，当类胡萝卜素合成受阻时，植物会出现光漂白症状，表型肉眼容易观测。
本研究构建了携带PDS片段的烟草脆裂病毒重组载体，通过农杆菌成功侵染刺萼龙葵，旨在建立刺萼龙葵高效VIGS体系，为刺萼龙葵功能基因组学研究提供技术支撑。
1 材料和方法1.1 材料刺萼龙葵种子于2013年11月采自北京市密云县。
TRV载体pTRV1、pTRV2及农杆菌GV3101由中国农业大学食品科学与营养工程学院提供。
1.2 PDS基因片段的克隆选取刺萼龙葵幼嫩叶片提取总RNA，提取方法根据RNA提取试剂盒（天根）操作说明书进行。
cDNA的合成按照cDNA第一链合成试剂盒（天根）操作说明书进行。
根据刺萼龙葵PDS基因序列（登录号KT366011），选取部分编码区片段为目标片段，设计上游引物F1（5′CGGGATCCCGGATAGGGTGACAGATGA3′，下画线为BamHⅠ酶切位点）和下游引物R1 （5′CGGAATTCACACACTGAGCAGCGAACT3′，下画线为EcoRⅠ酶切位点）。
以cDNA 为模板，进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；最后72℃延伸5 min。
1.3 病毒载体pTRV2PDS构建烟草脆裂病毒是RNA病毒，由TRV1、TRV2两条链组成。
改造后的病毒包括pTRV1和pTRV2两个独立的质粒结构，分别装载TRV1和TRV2的遗传信息。
pTRV1质粒上的运动蛋白促进病毒在植物体内的转运；pTRV2携带目的基因。
病毒载体构建好后导入农杆菌用于刺萼龙葵VIGS体系的建立。
TRV载体的结构如图1所示。
切胶回收PCR产物，将目的基因片段与pTRV2病毒质粒载体同时用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，回收酶切产物后，用T4连接酶在16℃过夜连接，转化DH5α，在含有卡那霉素（kanamycin，50 μg/mL）的抗性条件下筛选转化子，提取转化子质粒。
病毒载体pTRV2PDS 通过冻融法转入农杆菌GV3101，在卡那霉素、庆大霉素（gentamicin）、利福平（rifampicin）（均为50 μg/mL）抗性条件下筛选转化子。
1.4 沉默体系的建立分别培养含有pTRV2PDS和pTRV1质粒的农杆菌GV3101，各取菌液1 mL加入20 mL的LB培养基（含庆大霉素、利福平和卡那霉素各50 μg/mL）中继续扩大培养8 h，并加入0.5 mol/L的MES 200 μL，0.1 mol/L的乙酰丁香酮8 μL，28℃过夜培养。
离心收集菌体后，加入侵染液（含10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，200 μmol/L乙酰丁香酮）悬浮菌体，调整菌液吸光度在2.0左右。
将分别含有pTRV1、pTRV2PDS的GV3101以1∶1的比例混合均匀，28℃振荡培养3 h。
阴性对照为含pTRV1、pTRV2（不含PDS）的GV3101混合菌液。
以在温室内培养至2～4叶期的刺萼龙葵幼苗为待侵染材料，用一次性注射器对幼苗叶片及茎部进行注射侵染[14]。
侵染后的植株置于20℃、湿度30%和光周期L∥D=16 h∥8 h的人工气候室内培养，观察刺萼龙葵的表型变化。
1.5 半定量PCR反应分别从TRVPDS和TRV侵染的刺萼龙葵叶片和花朵中提取总RNA并反转录，以βactin （登录号为KT366001）为内参基因，采用RT-PCR法对RNA进行半定量分析，所用引物为βactinF1（5GGAATGGTTAAGGCAGGATTTG3′）和βactinR1（5′TTCATCACCCACATAGGCATC3′）。
在插入的目的基因外围设计引物PDSF1（5′CTTATCATCAACATTCCGTGCTT3′）和PDSR1（5′TCCTTAACACTTATCCCGTCT3′）。
根据半定量的需要，分别对PDS和βactin基因进行24、27、30、35个循环的扩增。
2 结果和分析2.1 PDS基因片段的克隆与分析将克隆得到的498 bp的刺萼龙葵PDS基因片段，与番茄的PDS片段对比，两者同源性在95%以上，可用以构建病毒载体。
采用RT-PCR扩增出的PDS基因序列琼脂糖凝胶电泳检测表明，在500 bp处出现了清晰的扩增带（图2）。
2.2 刺萼龙葵基因沉默载体的构建与转化将PCR产物与pTRV2分别用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切片段经过连接得到pTRV2PDS，转化感受态DH5α，挑取单克隆摇菌，提取质粒进行PCR检测和双酶切检测，结果显示，以pTRV2PDS为模板的扩增产物在约500 bp处存在目的条带，而以空质粒为模板则没有扩增出目的条带；对重组质粒双酶切，得到大小约500 bp目的条带（图3），说明pTRV2PDS基因沉默载体构建成功。
将重组质粒载体pTRV2PDS转化农杆菌GV3101，挑取阳性克隆用于侵染刺萼龙葵。
2.3 侵染接种与光漂白表型观察以在温室中培养至2～4叶期的刺萼龙葵幼苗为试验材料，用不带针头的注射器通过压迫的方式将含有病毒载体的农杆菌注入刺萼龙葵植株内，可先轻微摩擦制造伤口，再将菌液注射到刺萼龙葵叶片背部和幼根处。
以不含PDS的pTRV2空载体侵染作为阴性对照。
叶片经注射侵染后可观察到明显的圆形痕迹，叶面充满液体。
侵染15 d后，发现接种重组pTRV2PDS病毒载体的植株叶片有光漂白现象，侵染20 d后，光漂白现象逐渐扩展至其他叶片，30 d以后，部分花瓣也显现了白化症状（图4）。
2.4 PDS基因的RT-PCR半定量分析采用RT-PCR半定量方法检测PDS基因的沉默效果（图5），内参基因βactin在对照和沉默样品中的扩增趋势一致，说明对照和沉默的刺萼龙葵样品的RNA定量准确。
与刺萼龙葵对照叶片和花朵相比，被侵染的叶片与花朵中PDS基因表达量显著降低。
在分子水平上说明刺萼龙葵VIGS体系构建成功。
3 讨论VIGS技术的成功，需要选择合适的载体、大小适当的插入片段、高效的侵染方法以及适宜的培养条件。
首先，在应用该技术时，所选择的病毒载体应对试验植物有较好的侵染性、不被发病症状干扰，最好能在寄主植物中产生系统的沉默效果。
插入的目的基因片段大小会影响沉默效率，片段过大会限制病毒载体在植株体内的移动[14]，插入的片段至少要与目的基因有23 bp完全相同[6]，通常插入片段的长度控制在200～1 300 bp范围内最好[15]。
VIGS载体的导入方法，除了农杆菌介导法，还有机械接种和金属离子轰击，但是农杆菌介导法因其简便、高效、工作量少、成本相对低廉等优点应用更加普遍。
基因沉默是病毒繁殖与植物生长双向互作的结果，两者都受到环境条件的影响，其中温度是最重要的影响因子。
傅达奇等证实被侵染的番茄幼苗在低温逆境条件下生长，沉默表型会持续至花和果实的发育[16]，Szittya等发现温度在24℃以下将抑制植物对兰花环斑病毒的基因沉默[17]，而TRV病毒对本氏烟的沉默适温在25℃[15]。
通过半定量PCR、实时荧光定量PCR以及Northern Blot等分子生物学方法可以检测目的基因的沉默效率。
无论采用何种方法，引物序列必须设计在插入片段以外的目的基因区域，即仅将内源性表达的mRNA作为检测对象，以避免载体携带片段扩增时对检测结果造成的干扰[1819]。
其中，实时荧光定量PCR可快速检测且灵敏度高，但有报道提出即使将引物设计在插入片段以外，实时荧光定量PCR的检测结果也不理想，这种方法的检测片段一般在100 bp左右，而沉默过程可能恰好降解产生此种片段[20]。
