枯草芽孢杆菌试验

枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案一、材料准备（1）实验仪器培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪（2）实验试剂NA培养基：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105（3）培养基配方牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。

二、实验步骤（1）制备菌液称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①；用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧;（2）进行涂板向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记；每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次；将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。

（3）菌落计数以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数：当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数；若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。

若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数；若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。

鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的方法引言大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是两种常见的细菌。

它们在形态、生理特征和生长条件上存在一些差异，因此可以通过一系列实验方法来鉴别它们。

本文将介绍鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的常用方法。

1. 形态特征鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在形态上存在一些差异，可以通过以下方法进行鉴别：•观察细胞形状：大肠杆菌呈长圆柱形或椭圆形，而枯草芽孢杆菌呈短圆柱形或长椭圆形。

•观察细胞大小：大肠杆菌通常较小，长度约为2-4微米，直径约为0.5-1微米；而枯草芽孢杆菌较大，长度约为3-5微米，直径约为0.8-1.5微米。

•观察胞外结构：大肠杆菌通常具有鞭毛，而枯草芽孢杆菌不具有鞭毛。

2. 生理特征鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在生理特征上也存在一些差异，可以通过以下方法进行鉴别：•发酵能力：大肠杆菌能够发酵乳糖和葡萄糖，产生酸和气泡，而枯草芽孢杆菌不能发酵乳糖和葡萄糖。

•氧需求：大肠杆菌为厌氧菌，可以在无氧条件下生长；而枯草芽孢杆菌为好氧菌，需要氧气才能生长。

•温度适应性：大肠杆菌通常在37摄氏度下生长最好，而枯草芽孢杆菌在30-40摄氏度范围内都能生长。

3. 生长条件鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌对于不同的生长条件也有一定的差异，可以通过以下方法进行鉴别：•培养基选择：大肠杆菌通常在富含葡萄糖和氨基酸的培养基上生长，例如LB培养基；而枯草芽孢杆菌通常在富含有机物和无机盐的培养基上生长，例如NA培养基。

•pH适应性：大肠杆菌对中性或弱碱性环境更适应，pH范围为6-8；而枯草芽孢杆菌对中性或弱酸性环境更适应，pH范围为5-7。

4. 鉴别实验方法为了更准确地鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，可以通过以下实验方法进行进一步鉴别：4.1 青霉素抗性试验青霉素抗性是大肠杆菌的一个特征，可以通过以下步骤进行测试：1.取一块含有青霉素的抗生素纸片。

2.在含有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的琼脂平板上分别接种一条直径约为3-5毫米的细菌线。

鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的方法介绍大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是两种常见的细菌，虽然它们在形态上有一些相似之处，但在生物学特性上有很大差异。

正确鉴别这两种细菌对于保障公共卫生和食品安全具有重要意义。

本文将详细介绍鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的方法。

外观观察大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在进一步检测之前可以通过外观观察进行初步鉴别。

大肠杆菌外观观察1.形态：大肠杆菌为革兰氏阴性杆菌，呈棒状。

2.颜色：培养在富含营养物的琼脂平板上产生的大肠杆菌菌落呈乳白色或浑浊白色。

3.糖发酵：大肠杆菌能够发酵葡萄糖，产生酸，导致琼脂平板颜色变黄。

枯草芽孢杆菌外观观察1.形态：枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，形态较大肠杆菌更为多样，包括短杆状、长杆状和梭形等。

2.颜色：培养在琼脂平板上的枯草芽孢杆菌菌落呈白色或灰白色。

3.胶质囊：枯草芽孢杆菌形成胶质囊，使菌落观察时呈乳白色，菌落平整立体。

生理和生物化学特性除了外观观察之外，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在生理和生物化学特性上也有明显差异，这些特性可以用于进一步鉴别。

大肠杆菌特性1.氧需求：大肠杆菌是厌氧菌，无需氧气生长。

2.好气性发酵：大肠杆菌可以利用葡萄糖进行好气性发酵，产生酸和气体，如二氧化碳。

3.非芽孢形成：大肠杆菌不会形成孢子。

枯草芽孢杆菌特性1.氧需求：枯草芽孢杆菌是好气性菌，需氧气生长。

2.好气性发酵：枯草芽孢杆菌可以进行好气性发酵，但不像大肠杆菌那样产生气体。

3.孢子形成：枯草芽孢杆菌能够在逆境下形成芽孢，以保护自己。

生化试验生化试验是一种常用的方法，用于鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

大肠杆菌的常见生化试验1.非芽孢形成：通过培养在常规琼脂平板上，观察是否形成孢子，大肠杆菌不会形成孢子。

2.外膜酶试验：大肠杆菌产生β-半乳糖苷酶，可通过添加半乳糖苷甲醚酸盐，观察是否产生金黄色沉淀物来进行鉴别。

3.琼脂溶血试验：大肠杆菌可以分泌溶血素，在琼脂平板上添加红细胞进行观察，大肠杆菌使红细胞溶解，形成溶血环。

利福平标记枯草芽孢杆菌实验1、实验材料1.1试剂利福平溶液：用95%乙醇配制10mg/mL的利福平溶液，配好后经0.22um无菌滤膜除菌。

1.2培养基NA（牛肉膏蛋白胨培养基）培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1.0L，琼脂18.0g，pH7.0-7.2200μg/mL利福平NA培养基：NA培养基经高温灭菌，冷却至50-55℃时加入利福平（1LNA培养基加入20mL10mg/mL利福平溶液）。

液体培养基为对应固体培养基不添加琼脂，其余成分一致。

2、抗生素标记试验首先制备利福平浓度为100μg/mLNA平板，检测枯草芽孢杆菌天然抗药性。

根据天然抗药性检测结果，进行抗生素标记实验（杜立新等，2004），取纯化好的枯草芽孢杆菌单菌落接种到含有5ug/mL利福平NA液体培养基中，150r/min，28℃培养，待出现浑浊后稀释菌液，取三个不同浓度的稀释液100μL加到含有相同浓度抗生素的NA细菌平板，涂匀，继代培养一次，待长出单菌落后转入下一高浓度的利福平NA培养基，依次经过利福平5、10、20、40、80、120、160、200ug/mLNA液体培养基诱导，直至筛选出能耐受的最高利福平浓度200ug/mL。

筛选耐药枯草芽孢杆菌能否应用于研究，还必须验证其耐药的稳定性及拮抗性能。

耐药稳定性试验参考吴春胜等（1994）方法。

（1）将筛选的枯草芽孢杆菌在利福平含量依次升高的NA培养基上连续传代6次，观察其是否始终有菌落出现。

（2）将筛选枯草芽孢杆菌接种至不含利福平NA培养基中，连续传代3-5次，然后将其涂布于含200μg/mL利福平的NA培养基上，观察其是否有菌落出现。

（3）将抗药菌株置于4℃的低温中保藏2-3周，然后接种于含200μg/mL利福平的NA液体培养基上进行培养，观察是否出现浑浊，并在含200μg/mL利福平的NA培养基上划线培养，观察其是否有菌落出现。

4种抗生素对枯草芽孢杆菌的体外联合抑菌试验王育娜;耿慧敏;李春歌【摘要】In order to study the combined antibacteria effect of four antibiotics on E. subtilis in vitro ,drug susceptibility tablets on the beef extract peptone agar plate were used to evaluate the drug bacteriostasis by measuring antibacterial circle diameter. Each single antibiotic drug was used as a control. The results showed that B. subtilis was middle-degree susceptible to combined use of penicillin sodium and levofloxacin hydrochloyide injection with 12. 8 mm of antibacterial circle diameter. A higher-degree susceptibility was showed to ceftriaxone sodium for injection combined with penicillin sodium or levofloxacin hydrochloyide injection, whose average antibacterial circle diameter was between 18 mm and 19 mm. The average susceptibility degree to other combinations was higher, with diameter lager than 20 mm. Not all the average antibacterial circle diameters were bigger than the four single used antibiotics.%为研究4种抗生素类药物两两混合使用对枯草芽孢杆菌的体外抑菌作用,以4种抗生素类药物单独使用作为对照,通过测量牛肉膏蛋白胨琼脂平皿上药敏片的抑菌圈直径来确定药物的抑菌作用.结果表明,青霉素钠与盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液联用对枯草芽孢杆菌的抑菌圈平均直径为12.8 mm,枯草芽孢杆菌对其表现出中度敏感,注射用头孢曲松钠分别与注射用青霉素钠、盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液联用的抑菌圈平均直径在18～19mm,枯草芽孢杆菌对它们表现出高度敏感,而其他组合对枯草芽孢杆菌的抑菌圈平均直径均大于20 mm,枯草芽孢杆菌对它们表现为极度敏感,但并不是所有的联合抑菌圈平均直径都大于单独使用的抑菌圈平均直径.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2012(041)008【总页数】3页(P177-179)【关键词】抗生素;联用;枯草芽孢杆菌;抑菌【作者】王育娜;耿慧敏;李春歌【作者单位】洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022【正文语种】中文【中图分类】S816.7枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是具有典型芽孢杆菌特征的革兰氏阳性菌，为嗜温、好氧、产芽孢的杆状细胞，分布广泛，易培养，抗逆性能强，且不会产生对人和动植物有害或污染环境的产物。

枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定一、目的：掌握芽孢杆菌属常见种的分离，鉴定方法和技术。

将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。

二、原理：芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。

，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。

三、材料和器皿：显微镜、培养皿（12个）、试管（12个）、三角瓶（5个）、烧杯、移液管（）、涂布棒（6个）、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、v.p.实验培养基、肉汤琼脂培养基孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇四、操作步骤菌种的分离和纯化（1）土壤的采集：取土壤表层5~10厘米下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋中带回实验室分离。

（2）平板的制备：融化三角瓶中的牛肉膏蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒入6个平板上。

（3）稀释分离法：秤取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15分钟，而后静止5分钟。

吸取上层液0.5ml加入到含有4.5ml的无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后分别吸取10-2和10-3土壤悬浊液个0.1ml滴加到上述牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每种稀释2皿，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1~2天。

（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部分菌落，然后在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是否是芽孢杆菌纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，置37℃培养1~2天备用。

菌种的鉴定1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）（1）单个菌种的形态（2）菌种形态的观察2.革兰氏染色3.芽孢染色4.菌体大小测验5.枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定一、淀粉水解一、原理许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将淀粉培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。