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产甲烷菌的分离、培养及鉴定方法产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。
作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。
通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。
摘要产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。
作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。
通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。
一、实验原理(一) 产甲烷菌厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。
产甲烷菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，产甲烷菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
(二) 产甲烷菌的发现历史自1901—1903年巴斯德研究所的马载（Maze）第一次观察到一种产甲烷菌的微球菌（马氏甲烷球菌）以来，迄今共发现了五十多种产甲烷菌。
1974年Bryant 提出产甲烷菌这一名词，为避免这一类细菌与氧化甲烷的好氧菌相混淆。
1979年由Balch W.E.等人根据菌株间16SrRNA降解后各寡核苷酸中碱基排列顺序间相似性的大小，提出了一个新的系统分类方法，共分为3个目、4个科、7个属、13个种。
(三) 定义、性质及分布产甲烷菌（Mathanogens）是一类必须生活在厌氧生境下并伴有甲烷产生的古生菌，其形态和生理、生化特性呈现明显的多样性。
低温产甲烷复合菌系的选育及干、湿发酵的比较摘要：将3个低温厌氧环境样品Y、S、Z进行干、湿发酵低温驯化，选育适宜低温干、湿发酵的稳定、高效产甲烷复合菌系。
样品Y、S、Z在（19±0.5）℃条件下进行干发酵低温驯化，分别在第6代、第7代、第6代产气基本稳定，第8代65 d总产气量分别为42.60、40.50、41.70 L，总固体（TS）产气率分别为266.25、253.13、260.63 L/kg。
复合菌系Y最适接种量为25%，甲烷含量最高为72.9%，COD去除率最高为77.17%；样品Y、S、Z在相同条件下进行湿法酸化发酵低温驯化，分别在第7代、第7代、第8代产气基本稳定，第9代55 d总产气量分别为35.48、34.52、33.78 L，TS产气率分别为221.75、215.75、211.13 L/kg；3组复合菌系稳定世代在干发酵和湿法酸化发酵中均使得沼气发酵启动期比第1代提前5 d以上。
经差异显著性分析，相同发酵方法下不同复合菌系间总产气量差异达到显著水平。
关键词：低温驯化；沼气发酵类型；总产气量；甲烷纯度；COD温度是限制低温沼气发展的重要因素，低于20 ℃时沼气发酵效率会显著下降，我国北方年平均气温为1.3 ℃，若在低温季节进行沼气发酵需人为加热保温，增加了运行成本，而使得沼气发酵难以在北方推广。
此外，湿发酵沼液量大，处置不当易造成二次污染，若干发酵替代湿发酵不仅利用秸秆解决生物质能转化问题，而且减少其焚烧所带来的空气污染[1]。
试验采用不同生境来源的样品，利用微生物对环境适应性及温度对其的选择作用在干、湿发酵中进行低温驯化，比较干、湿发酵优越性并且选育稳定、高效、适宜低温干、湿发酵的产甲烷复合菌系，为低温沼气工程提供试验参数及菌种资源。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品来源样品选择厌氧污泥Y、水稻田污泥S、沼气发酵液Z。
1.1.2 底物及试剂牛粪酸化液：将9 kg干牛粪与9L水在塑料桶里混合均匀，自然酸化待pH降至6时，用KHCO3溶液将其pH调至7，装料时将TS调至8%。
低温沼气功能菌群的产甲烷菌分析丁建南;田晓娟;张国华;黄黄;黄江丽【摘要】运用16s rDNA PCR和实时荧光qPCR技术,对选育的低温沼气功能菌群中的产甲烷菌种群结构和数量进行了研究,并与常温沼气功能菌群进行了比较分析。
在总共33个产甲烷菌分类单元中低温沼气功能菌群占有20个,低温沼气功能菌群的产甲烷菌多样性远高于常温沼气功能菌群。
低温沼气功能菌群以对温度要求较低的中低温产甲烷菌为主,而常温沼气功能菌群则以中高温产甲烷菌占优。
虽然两类菌群的产甲烷菌在多样性和种群结构方面存在着较大差异,但在产甲烷菌数量方面并没有明显的不同,这表明选育的低温沼气功能菌群和常温沼气功能菌群一样,已经形成了稳定的产甲烷菌种群。
%Methanogens populations in low and normal temperature biogas functional microfloras were respectively investigated using 16s rDNA PCR and real-time qPCR techniques.The 16s rDNA clone library of methanogens showed a great difference in methanogens consortium diversity and structure between the two microfloras.A total of 33 OUTs of methanogens were identified,including 20 in low-temperature microflora and 13 in normal temperature microflora.Methanogens requiring low-medium temperature were found prevalent in low-temperature microflora and those active at moderate-high temperature occurred mainly in normal temperature microflora.However,the results of real-time qPCR showed that there was no significant difference in methanogen quantity between the two studied microfloras,indicating a stable methanogenic community had been built in both microfloras.【期刊名称】《江西科学》【年(卷),期】2012(030)001【总页数】4页(P36-38,43)【关键词】低温沼气功能菌群;产甲烷菌;种群分析;16s;rDNA;实时定量PCR【作者】丁建南;田晓娟;张国华;黄黄;黄江丽【作者单位】江西省科学院生物资源研究所,江西南昌330029;江西省科学院生物资源研究所,江西南昌330029;江西省科学院生物资源研究所,江西南昌330029;江西省科学院生物资源研究所,江西南昌330029;江西省科学院生物资源研究所,江西南昌330029【正文语种】中文【中图分类】S216.4低温是影响我国亚热带及其以北广大区域沼气设施使用效率的主要原因，也是限制沼气向高纬度和高海拔地区进一步推广的主要因素［1，2］。
收稿日期:2011-12-08;修订日期:2012-01-16作者简介:丁建南(1955-),男,研究员,研究方向为微生物生态学。
基金项目:江西省科技支撑计划项目“低温沼气发酵综合技术的研究”;江西省科学院基金项目“低温沼气发酵专属菌群中产甲烷菌种群分析”(2007⁃YGY⁃04)。
第30卷 第1期2012年2月江 西 科 学JIANGXI SCIENCEVol.30No.1Feb.2012 文章编号:1001-3679(2012)01-0036-04低温沼气功能菌群的产甲烷菌分析丁建南,田晓娟,张国华,黄 黄,黄江丽(江西省科学院生物资源研究所,江西 南昌330029)摘要:运用16s rDNA PCR 和实时荧光qPCR 技术,对选育的低温沼气功能菌群中的产甲烷菌种群结构和数量进行了研究,并与常温沼气功能菌群进行了比较分析。
在总共33个产甲烷菌分类单元中低温沼气功能菌群占有20个,低温沼气功能菌群的产甲烷菌多样性远高于常温沼气功能菌群。
低温沼气功能菌群以对温度要求较低的中低温产甲烷菌为主,而常温沼气功能菌群则以中高温产甲烷菌占优。
虽然两类菌群的产甲烷菌在多样性和种群结构方面存在着较大差异,但在产甲烷菌数量方面并没有明显的不同,这表明选育的低温沼气功能菌群和常温沼气功能菌群一样,已经形成了稳定的产甲烷菌种群。
关键词:低温沼气功能菌群;产甲烷菌;种群分析;16s rDNA ;实时定量PCR 中图分类号:S216.4 文献标识码:AMethanogens Consortium Analysis in Low⁃temperatureBiogas Functional MicrofloraDING Jian⁃nan,TIAN Xiao⁃juan,ZHANG Guo⁃hua,HUANG Huang,HUANG Jiang⁃li (Biological Resources Institute,Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330029PRC)Abstract :Methanogens populations in low and normal temperature biogas functional microfloras were respectively investigated using 16s rDNA PCR and real⁃time qPCR techniques.The 16s rDNA clone library of methanogens showed a great difference in methanogens consortium diversity and structurebetween the two microfloras.A total of 33OUTs of methanogens were identified,including 20in low⁃temperature microflora and 13in normal temperature microflora.Methanogens requiring low⁃medium temperature were found prevalent in low⁃temperature microflora and those active at moderate⁃high temperature occurred mainly in normal temperature microflora.However,the results of real⁃time qPCR showed that there was no significant difference in methanogen quantity between the two stud⁃ied microfloras,indicating a stable methanogenic community had been built in both microfloras.Key words :Low⁃temperature biogas functional microflora,Methanogens,Population analysis,16s rD⁃NA,Real⁃time PCR0 前言低温是影响我国亚热带及其以北广大区域沼气设施使用效率的主要原因,也是限制沼气向高纬度和高海拔地区进一步推广的主要因素[1,2]。
沼气池中产甲烷菌的分离鉴定及其分布的研究的开题报告一、选题背景及意义沼气池是一种重要的生物发酵设施，可利用有机废弃物和废水产生可再生能源沼气。
沼气主要由甲烷和二氧化碳组成，其中甲烷是一种重要的清洁能源，具有广泛的应用前景，如发电、热水供应和工业燃料等。
因此，沼气池的高效稳定运行及其甲烷产量的提高至关重要。
沼气池中产甲烷菌是影响沼气池甲烷产量和污泥稳定性的关键微生物。
然而，沼气池中产甲烷菌的分布和种类众多且复杂，其生态特性的研究还存在很多问题。
因此，对沼气池中产甲烷菌进行分离鉴定及其分布的研究，可以进一步了解沼气池中产甲烷微生物的多样性和功能，为沼气池的高效稳定运行提供科学依据。
二、研究内容本研究将对不同类型沼气池中产甲烷菌进行分离培养、形态学观察和生理生化特性分析，以了解不同菌种的生化代谢途径、生长条件以及甲烷产量等特性；同时采用16S rRNA基因扩增测序技术对产甲烷菌进行分类鉴定和分子系统进化分析，比较不同类型沼气池产甲烷菌的多样性和种类组成差异，探讨其生态特性及其在沼气池中的功能作用。
三、研究方法和技术路线（1）样品采集和沼气池性质分析：采集不同类型沼气池中的发酵液和污泥样品，分别进行PH值、温度、压力、ORP等水文理化参数测定，以及COD、BOD、甲烷含量等质量性能分析。
（2）产甲烷菌分离鉴定：采用温和酸碱处理、梯度离心等方法分离产甲烷菌，分别进行形态学、生理生化特性和分子生物学鉴定，如形态颜色观察、氧气耗尽实验、代谢产物检测、16S rRNA基因扩增等，确定其系统学分类和进化关系。
（3）多样性和功能分析：采用高通量测序和生物信息学分析技术，对产甲烷菌进行群落组成和多样性分析，以及功能基因组、代谢途径和调控机制等研究，以揭示不同沼气池中产甲烷菌的群落结构和生态功能。
四、预期研究结果和创新点本研究通过对不同类型沼气池中产甲烷菌的分离鉴定和分子生物学研究，可以测定产甲烷菌的多样性和群落组成，揭示其在沼气池中的生态功能和代谢途径，为沼气池的高效稳定运行提供科学依据和理论支持；同时，本研究还可以为产甲烷微生物的分类学和进化研究提供新的实验数据和分子证据，对沼气池微生物学的研究具有一定的参考价值和实际意义。
