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1株酸浆豆腐中产蛋白酶菌种的分离与鉴定李笑梅;涂婧;王嘉琪;石彦国【摘要】以市售酸浆豆腐为样品,首先筛选样液适宜的稀释倍数,将样品稀释液接种于马铃薯葡萄糖平板和MRS平板进行纯培养,然后接种于脱脂牛奶培养基,以产透明圈为指标,再以酪蛋白为底物测定酶活,筛选分离产蛋白酶菌种,继而通过肉眼观察菌落形态、光学显微镜和电镜、显微镜观察菌体形态,进一步通过各种生理生化反应、ITS测序方法进行菌种鉴定.结果表明:25 9样品稀释至10-5浓度适宜,在脱脂牛奶培养基中,温度28℃、有氧培养72 h后产生透明圈,酶活为9.6 U/mL;肉眼观察菌落为乳白色,呈绒毛状,有同心圈并呈放射线状,显微镜下节孢子呈单个或链状,扫描电镜观察菌丝体宽4～5.5 μm,孢子大小多数为(3.3～5.7) μm×(7.0-17.1) μm;根据生理生化反应结果,查阅《真菌鉴定手册》,鉴定为白地霉(Geotrichum candidum);ITS测序显示与白地霉同源性达100％.根据生长曲线可知,0～8 h,菌株处于延迟期;8～40 h,菌株处于对数期;40～68 h,菌株处于稳定期;68 h以后,菌株处于衰亡期.%The commercially available alkekengi tofu was used as samples.First,the appropriate dilution times of the sample solution were screened.Pure culture was carried out on potato glucose plates and MRS plates.Then the pure culture strains were inoculated on skim milk medium.Taking transparent zone as index,casein was used as substrate to determine enzyme activity to screen and isolate the strain that producing protease.Then,naked eye observation,optical microscopic observation,scanning electron microscopy,physiological and biochemical reaction,ITS sequencing method were used to identify the bacteria.The results showed that the appropriate diluted concentration for 25 g samplewas 10-5.In the skim milk medium,under the condition of temperature of 28 ℃,aerobic train ing of 72 h,the strain produced a transparent circle and the enzyme activity was 9.6 U/mL.Macroscopic observation showed colony was ivory,villous,with concentric circle radiation,microscopic section spores single or in chain,sacnning electron microscopy observation showed the width of mycelium were 4～5.5 μm,and spore side were mostly(3.3～5.7) μm × (7.0～17.1) μm.According to the physiological and biochemical reaction results,refer to the Handbook of fungal identification,the strain belonged to Geotrichum candidum.The results of ITS sequencing showed homology of the strain on the potato glucose plates with Geotrichum candidum up to 100％.According to the growth curve,0～8 h was in the delay period,8～40 h was the logarithmic period,40～68 h was the stable period and after 68 h,the strain was in the decline period.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)005【总页数】5页(P101-105)【关键词】酸浆豆腐;蛋白酶;分离;鉴定【作者】李笑梅;涂婧;王嘉琪;石彦国【作者单位】哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076【正文语种】中文【中图分类】TS201.3豆腐(Tofu或Bean curd)是我国传统豆类制品,品种繁多,色泽、滋气味、质地、口感均有差异[1],酸浆豆腐具有酸乳和轻微腐败香气、无苦涩味、质地软韧适宜。
实验⼀腐乳产蛋⽩酶菌株的筛选1实验⼀腐乳产蛋⽩酶菌株的分离⼀、实验⽬的与要求了解涂布分离和平板划线法从⾷物中分离⾷源性微⽣物的原理和⽅法，并熟练掌握该操作⽅法。
⼆、实验原理微⽣物是蛋⽩酶的最佳来源，与动物和植物相⽐，微⽣物作为蛋⽩酶的来源具有更多⽣理⽣化上的优越性。
微⽣物来源的蛋⽩酶都是胞外酶，易于分离纯化，更重要的是微⽣物易于培养和发酵，有⼴泛的⽣物化学多样性和遗传操作的感受性。
通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋⽩酶菌株进⾏分离。
稀释涂布平板法是⼀种将菌体按⽐例制备成若⼲个稀释度，再分别经涂棒涂布培养⽽进⾏微⽣物分离纯化的⽅法；平板划线分离法是指把混杂在⼀起的微⽣物或同⼀微⽣物群体中的不同细胞⽤接种环在平板培养基表⾯通过分区划线稀释⽽得到较多独⽴分布的单个细胞，经培养后⽣长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微⽣物的“纯种”。
有时这种单菌落并⾮都由单个细胞繁殖⽽来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微⽣物样品在固体培养基表⾯多次作“由点到线”稀释⽽达到分离⽬的的。
根据透明圈的⼤⼩来筛选⽬的菌株，透明圈越⼤的菌具有较强的产酶能⼒。
对分离到的菌株进⾏纯化，得到⾼产蛋⽩酶菌株。
三、试验材料1、材料与试剂⾖腐乳：市购⾖腐乳2、主要仪器与设备⽆菌操作箱、恒温⽔浴锅、⽣化培养箱、⾼压灭菌锅、振荡培养箱四、实验步骤与⽅法1、培养基的制备可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋⽩1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性配制⽅法：称取酪蛋⽩1.0g，先⽤少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏⽔，在沸⽔浴中加热并搅拌，⾄完全溶解，补⾜⽔量⾄100mL，加⼊其他成分，调整pH，灭菌备⽤。
2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选⼀种⽅法进⾏操作）（1）稀释法分离：采⽤⽆菌⽔，10倍梯度稀释⾖腐乳的菌悬液到10-8，吸取10-6到10-8梯度（按照这三个梯度涂布，前两个组基本都没有菌⽣长，是否后⾯的实验考虑⽤较⾼浓度的梯度涂布？）的菌悬液各1mL，注⼊初筛培养基平板中，每个梯度做2个平⾏平板，涂布均匀。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选1. 引言蛋白酶是一类能够降解蛋白质的酶，在许多工业领域具有广泛的应用价值。
因此，发现和筛选具有高蛋白酶产量的菌株成为了很多研究人员的关注点。
本文旨在介绍蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的方法和步骤。
2. 蛋白酶分离菌株的采集蛋白酶产生菌株可以从各种环境中采集得到，常见的源包括土壤、水样、植物表面等。
采集时需要注意避免污染和样品间的干扰。
常用的采集方法包括无菌棉签擦拭、土壤样品采集等。
3. 蛋白酶分离菌株的分离和筛选3.1 培养基选择和制备蛋白酶分离菌株的分离需要选择合适的培养基，常见的培养基包括含蛋白质和多肽的培养基，如酵母提取物培养基、肉汤培养基等。
培养基制备时需要注意无菌操作，避免细菌污染。
3.2 菌株的分离将采集得到的样品均匀涂布在选定的培养基上，使用无菌棉签或铲子进行均匀涂布。
将涂布后的培养基培养于适宜的温度和时间下，一般常见的培养温度为30摄氏度。
3.3 蛋白酶活性筛选使用适当的蛋白酶活性指示剂，如casein等，在培养基上进行盘状培养。
通过观察培养基上蛋白质的降解情况，筛选出具有高蛋白酶活性的菌株。
此外，也可通过测定培养液中蛋白酶的活性来进行筛选。
4. 蛋白酶产生菌株的鉴定4.1 形态观察观察菌落的形态特征，如菌落的形状、颜色、透明度等，以及菌株的菌落生长速度等。
4.2 生理生化特性检测进行菌株的生理生化特性检测，包括产酸、产气、葡萄糖利用、氧需求等。
常用的方法包括气压油技术、碳水化合物利用酶技术等。
4.3 分子生物学鉴定采用分子生物学方法对菌株进行鉴定，如16S rRNA序列分析、PCR等。
将菌株的DNA提取出来，进行引物扩增，然后通过测序和序列比对，确定菌株的分类信息。
5. 结论通过蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选，可以获得具有高蛋白酶产量的菌株。
这些菌株在生物技术、食品工业等领域具有广泛的应用前景。
未来的研究可以进一步优化培养条件，提高菌株的蛋白酶产量，并应用于相关的工业生产中。
产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
实验十一产蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一基本原理⏹自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
⏹水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
⏹碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
⏹原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。
二实验目的⏹学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法⏹学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术⏹掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法三实验器材1 菌株从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株2 溶液和试剂蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等3 仪器和用品三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸四操作步骤1 培养基和试剂的配制（1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶（2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
产蛋白酶乳酸菌种的筛选及应用研究的开题报告开题报告题目：产蛋白酶乳酸菌种的筛选及应用研究研究背景乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，其具有抗菌、抗氧化、降低乳酸含量等功能，因此被广泛应用于食品和医药领域。
而蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶类，可在食品加工领域中起到重要作用。
因此将产蛋白酶的乳酸菌种应用于食品加工领域具有广泛的应用前景。
研究目的本研究旨在通过筛选产蛋白酶的乳酸菌种，并对其进行应用研究，以期为乳制品制造业提供生产实践参考。
研究内容1. 通过传统微生物学鉴定方法筛选产蛋白酶的乳酸菌种。
2. 对所筛选得到的乳酸菌进行发酵产蛋白酶试验，通过SDS-PAGE和酶活性测定等方法对其进行鉴定和分析。
3. 将所筛选得到的产蛋白酶乳酸菌种应用于酸奶、乳酪等乳制品的制备过程中，对产品质量和特性进行评估。
4. 通过对产蛋白酶乳酸菌种的培养基改良、菌株突变等方法进行优化，提高其产酶能力和应用性能。
研究意义本研究将为乳制品加工领域提供产蛋白酶乳酸菌种的筛选和应用研究成果，有望开发出具有较高产酶能力和应用性能的菌种，并为乳制品制造业提供合理的生产和管控参考。
研究方法1. 采用传统微生物学鉴定方法筛选乳酸菌。
2. 采用固体发酵法进行产蛋白酶试验，通过SDS-PAGE和酶活性测定等方法对其进行鉴定和分析。
3. 对所制备的乳制品进行质量和特性评估，包括感官评估、化学分析、微生物分析等方法。
4. 采用培养基改良、菌株突变等方法进行优化。
预期结果预计筛选得到具有较高产酶能力和应用性能的产蛋白酶乳酸菌菌种，并应用于乳制品制备过程中，提高产品质量和特性。
同时，通过菌株的优化，将进一步提高产酶菌株的生产能力和应用性能。
研究进度目前已完成乳酸菌的筛选和鉴定工作，正在进行发酵试验和评估工作。
之后将进行培养基改良和菌株优化工作，并对优化后的菌株进行应用实验和评估。
预计整个研究工作将在一年内完成。
总结本研究旨在通过筛选产蛋白酶的乳酸菌种，并对其进行应用研究，提高乳制品加工质量和特性。
蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，在许多领域具有广泛的应用价值。
下面是蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的一般步骤：
1. 样品采集：
-从自然环境（如土壤、水源等）或已知含有蛋白质的样品（如食品、发酵物等）中采集样品。
2. 分离菌株：
-将样品经过适当的稀释和处理后，通过平板法、液体培养法等方式进行分离培养。
-可以采用选择性培养基，如蛋白质含量较高的培养基，以筛选出潜在的蛋白酶产生菌。
3. 蛋白酶活性筛选：
-根据蛋白酶的活性特点，可使用含有特定蛋白质底物的琼脂糖平板或液体培养基，筛选出蛋白酶活性高的菌株。
-观察菌落周围的透明圈（即蛋白酶产生的溶解区），判断菌株对蛋白质的降解能力。
4. 纯化与鉴定：
-从具有蛋白酶活性的菌株中选择一个或多个进行进一步的培养和纯化。
-使用生化方法，如SDS-PAGE电泳、酶活性测定等，鉴定蛋白酶的分子量、酶活性和特性。
5. 分子鉴定：
-对蛋白酶活性高的菌株进行16S rRNA或其他适用的基因序列分析，以确定其属于的菌属和物种。
6. 筛选优良菌株：
-结合蛋白酶活性、稳定性、产酶量等指标，筛选出蛋白酶产量高、酶性好的优良菌株。
值得注意的是，在进行分离鉴定及筛选过程中，需要严格遵守微生物实验室操作规范，采取必要的无菌操作和消毒措施，确保实验安全。
此外，还可以利用分子生物学技术对蛋白酶基因进行研究，以进一步了解蛋白酶的产生机制和调控方式。
文献综述生物科学产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定摘要[摘要]本文主要按照实验设计步骤从海水中筛选出可以产蛋白酶的放线菌，并对获得的放线菌进行初步研究，如形态观察以及酶活力的测定。
从舟山沿海中分离得到几株产蛋白酶的放线菌，并通过酪蛋白平板培养基，水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究，酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。
对其中2株产酶活性较高的菌株进行了以酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行酶活性的测定。
[关键词]：蛋白酶；分离纯化；透明圈；酶活力1蛋白酶的简介水解蛋白质肽键的一类酶的总称。
按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。
内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的肽。
外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶[1]。
按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。
根据蛋白酶对所作用的反应底物的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。
种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。
如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。
2蛋白酶的广泛应用蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。
微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。
例如，乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是一大类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，目前已知有200多种LAB[2]。
相当多的LAB是益生菌，其作为益生菌有如下依据：其属于肠道正常菌群，对人和动物的健康是有益的[3]。
在农业、兽医、医学以及食品工业[4、5]中是很重要的。
如果对产蛋白酶的乳酸菌种进行了筛选，并将所产的蛋白酶进行了分离纯化，就可以为酸奶的生产研制和微生态制剂的研发提供更优良的菌种。
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件-信息化建设中心-广东轻工一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。
采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)。
通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。
在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。
关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIEGui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate ofprotein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimalcondition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition *基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2021B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ202107），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ202103）。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选背景蛋白酶是一种具有很广泛的应用价值的酶类。
由于其在消化道营养吸收、生物反应器中的转化作用等方面均有重要的作用，因此蛋白酶的产生与筛选已成为当今生物技术领域中的研究热点之一。
尤其是在食品加工、污水处理、纤维素生物降解等领域，蛋白酶都有着非常广泛的应用前景。
因此，本实验拟通过对产蛋白酶的菌株进行筛选，找到高产蛋白酶的优良菌株。
材料与方法菌株的采集菌株采集方法：在集中饮水供应点，选择自然生长的水上植物为采样点，如睡莲、菖蒲、兰草等，具体点位由实验组决定。
采用无菌削皮刀在水上植物上擦拭，将擦拭物用无菌三角板置于室温营养物培养基上慢慢离心直至血清澄清。
取尽可能大的好的菌落转入入液氮甘油管中，经深冷保存。
后选取筛选菌落接种于琼脂板上。
菌株的鉴定先用生化方法进行初步鉴定，包括观察菌落形态、氧化酶试验和嗜酸性染色，确定分离菌株的生物学特性。
然后利用API系统和Biolog系统对鉴定的菌株进行进一步的鉴定，最终确定其菌种身份。
菌株的扩增将选出的菌株接种到含有碳源和氮源的液体培养基中进行预培养。
在预培养的基础上，将菌株接种到不同浓度的含有特定碳源和氮源的液体培养基中进行再培养，测定培养基中蛋白酶活性及菌株生长情况。
选择生长良好、活性高的优良菌株进行扩大培养。
菌株蛋白酶活性的检测制备含有特定底物的琼脂板进行蛋白酶活性的检测，通过观察菌落周围的荧光带，判断菌株产生的蛋白酶活性。
结果与分析通过菌株采集、鉴定、扩增和蛋白酶活性的检测，找到了多个高产蛋白酶的优良菌株。
本实验通过对菌株的筛选，找到了高产蛋白酶的优良菌株，为蛋白酶的产生与研究提供了重要的参考。
微生物菌种选育论文腐乳中高产蛋白酶毛霉菌株的紫外线诱变选育学院：生物工程学院专业班级：生物技术2012级1班4组小组成员：张伟男钟志强白春蓉陈廷廷江跃琴指导老师：黄丹实验时间：2014年12月16日-2015年1月8日腐乳中高产蛋白酶毛霉菌株的紫外线诱变选育张伟男钟志强白春蓉陈廷廷江月琴(四川理工学院生物工程学院，生物技术一班4组)摘要：目的：选育酶活力高、耐热性好的毛霉蛋白酶菌株，用于腐乳发酵实验或生产。
方法：从腐乳中分离毛霉蛋白酶菌株，对其发菌株进行紫外线诱变，并经控温培养，选育优良变株。
结果：获得一株酶活力高、耐热性强的优良突变株，该菌株在30℃条件下生长茂盛，蛋白酶活力为252.42u／g，但较出发菌株低12.38%。
结论：将此优良变株用于腐乳发酵实验或生产，在缩短发酵时间，提升腐乳质量，延长生产季节等方面具有一定的应用价值。
关键词：腐乳；毛霉蛋白酶菌株；紫外线诱变育种；酶活力；突变株UV Breeding by Induced Mutation of Mucor High Protease Strain from Sufu ZHANG Wei-nan HONG Zhi-qiang BAI Chun-rongCHEN Ting-ting JIANG Yue-qin(College of Bioengineering，Sichuan University 0f Science and Enginering)Abstract：Objective：Breeding of Mucor protease strain with high enzyme activity and good high—temperature for fermen- tation experiments or production of sufu．Method：Mucor protease strains were picked out from sufu。
实验一腐乳产蛋白酶菌株的分离一、实验目的与要求了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。
二、实验原理微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具有更多生理生化上的优越性。
微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。
通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。
稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的“纯种”。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。
对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。
三、试验材料1、材料与试剂豆腐乳：市购豆腐乳2、主要仪器与设备无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱四、实验步骤与方法1、培养基的制备可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性配制方法：称取酪蛋白1.0g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH，灭菌备用。
2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选一种方法进行操作）（1）稀释法分离：采用无菌水，10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10-8，吸取10-6到10-8梯度（按照这三个梯度涂布，前两个组基本都没有菌生长，是否后面的实验考虑用较高浓度的梯度涂布？）的菌悬液各1mL，注入初筛培养基平板中，每个梯度做2个平行平板，涂布均匀。
将涂布后的平板置于28℃的恒温培养箱中培养48h。
（2）划线分离：对豆腐乳菌悬液（取1mL豆腐乳汁加入10mL无菌水制成）划线分离，制作两个划线分离平板，将平板置于28℃的恒温培养箱中培养48h。
五、思考题1平板培养时为什么要把培养皿要倒置？2划线分离时，为什么每次都需将接种环上剩余物烧掉？实验二蛋白酶菌株的纯化一、实验目的与要求通过对分离后的菌株进行斜面接种培养，掌握微生物斜面接种技术方法，并对产蛋白酶菌株实现一定的纯化目标。
二、实验原理微生物能够在合适的培养基上生长。
斜面接种法就是用灼烧、灭菌后的接种环，从菌种管中挑取少许菌苔，以无菌操作转移至新鲜斜面培养基上，自斜面底部开始向上做“Z”状致密平行划线的操作过程。
三、实验材料1、材料与试剂平板分离所得的菌株2、主要仪器与设备无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅，接种环，酒精灯。
四、实验步骤与方法1、培养基的制备牛肉膏蛋白胨斜面培养基：牛肉膏0.3g蛋白胨1g氯化钠0.5g琼脂2g加水至100mlpH7.0-7.22、菌种纯化挑选透明圈小而沉淀圈大的1—3株菌株，接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基,分别编号, 在温度28℃下培养48h。
五、思考题接种环从平板移至待接种斜面过程中，需要注意哪些事项？实验三蛋白酶菌株的初筛一、实验目的与要求了解初筛的原理和方法，通过初筛除去斜面培养后不符合要求的大部分菌株，保留符合要求的生产性状的菌株和优良菌株。
二、实验原理筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、简便。
一般是在固体培养基平板上通过观察菌株的生理效应范围（透明圈、变色圈、生长圈和抑制圈）进行初筛测定的。
透明圈法：在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。
将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。
在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。
三、实验材料1、材料与试剂斜面培养所得的菌株2、主要仪器与设备无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅，接种环，酒精灯四、实验步骤与方法1、培养基的制备牛肉膏豆粕浸汁培养基：牛肉膏0.5%、豆粕汁（称取100g豆粕粉煮沸经4层纱布过滤）、NaCl 0.5%、琼脂2.0%、pH值7.22、初筛：将斜面菌种接种于牛肉膏豆粕浸汁固体培养基中，在温度28℃下培养48h。
对分离到的菌株进行简单的鉴定，通过革兰氏染色法和显微镜镜检描述细胞形态，并对菌落进行记录。
挑选透明圈大而沉淀圈小的菌株，并测量透明圈的直径，作为筛选菌株。
五、思考题1、透明圈法筛选产蛋白酶菌株的依据是什么？2、如果初筛的透明圈不明显或者透明圈太小，可能的原因是什么？实验四蛋白酶菌株的复筛一、实验目的与要求学习和掌握微生物菌株复筛的原理和液体发酵技术二、实验原理不同类型的蛋白酶都能在含有蛋白质基质的平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体中的相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是蛋白酶的高产菌株。
复筛是指将初筛得到的较优菌株再进行多次摇瓶实验验证其效价和传代稳定性，并从中得到一两个或少数几个最优的菌株。
复筛不仅要将初筛得到的菌种进行再次发酵验证，还需要进行传代验证，就是传很多代，每代或隔代进行发酵验证，看其稳定性。
三、实验材料1、材料与试剂初筛培养基上所得的菌株2、主要仪器与设备无菌操作箱、恒温水浴锅、振荡培养箱、高压灭菌锅，接种环，酒精灯四、实验步骤与方法1、培养基的制备液体种子培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1.%、NaCl0.5%、葡萄糖1%、pH值7.22、复筛将筛选出来的产蛋白酶活力最高的1—2株菌种接种于100mL种子培养基在温度28℃下培养12h。
实验五蛋白酶菌株的摇瓶发酵一、实验目的与要求掌握酶的发酵生产方式之一微生物发酵产酶。
学习和掌握微生物的摇瓶发酵技术。
二、实验原理微生物发酵法是实际生产中制取酶制剂的主要方法。
在进行大规模液体深层发酵生产酶制剂之前，必须首先在实验室对保藏的菌株进行活化和扩大培养，制得生产种子，摇瓶发酵是发酵菌种小试以及扩培的一种方式。
扩大培养多采用摇瓶培养，即在锥形瓶中加入一定量的液体培养基，在摇床上以一定转速摇动进行恒温培养。
三、实验材料1、材料与试剂复筛培养基上所得的菌株2、主要仪器与设备无菌操作箱、恒温水浴锅、振荡培养箱、高压灭菌锅，接种环，酒精灯四、实验步骤与方法1、培养基的制备液体发酵培养基：蔗糖1%、大豆浓缩蛋白4%、NaCl0.5%、pH值为自然2、摇瓶发酵把种子培养液按4%的接种量即4mL接种于复筛发酵培养基（250ml的三角瓶每瓶装100mL培养基）中摇瓶发酵24h，测其蛋白酶活力。
实验六蛋白酶活力的测定蛋白酶能水解蛋白质为氨基酸。
其制剂广泛应用于发酵食品、皮革脱毛、丝绸脱胶、医药生产中。
蛋白酶按其作用pH值不同分为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶等。
其活力测定方法基本相同，区别仅在于作用的pH不同。
一、实验目的与要求掌握蛋白酶活力测定的原理和方法，了解发酵液的评价指标。
二、实验原理蛋白酶活力检测(紫外分光光度测定法) 蛋白质或多肽在275nm波段处具有最大吸收值，利用蛋白酶同酪蛋白底物反应前后在三氯乙酸中可溶物的紫外吸收增值，可表示蛋白酶活力高低。
三、实验材料1、材料与试剂摇瓶发酵所得的菌株2、实验仪器与设备紫外分光光度计、水浴锅试剂：1、0.05mol／l硼酸缓冲液(pH8.0)(释释发酵液用)：0.05mol／L硼砂(Na2B4O7·10H2O)溶液：硼砂1.907g，蒸馏水100mL。
0.2硼酸(H3BO3)溶液：硼酸1.237g，蒸馏水100mL。
3mL 0.05mol／L硼砂溶液与7mL 0.2mol／L硼酸溶液混匀，即为硼酸缓冲液。
2、0.4mol／L三氯乙酸溶液（称取三氯醋酸6.54g，定容至100ml）、3、0.6％酪蛋白溶液：称取酪蛋白0.6g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，用0.05mol／L硼酸缓冲液定容至100ml。
4、标准酪氨酸溶液（100µg/ml）：准确称取0.1克DL-酪氨酸，加入少量0.2mol/L 盐酸溶液（取1.7ml浓盐酸用水稀释至100ml），加热溶解，用水定容至1000ml。
每毫升含DL-酪氨酸100微克。
四、实验步骤1、酪氨酸标准曲线的绘制按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液测定步骤：在275nm下测定各管的吸光度，以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、蛋白酶活力测定粗酶液制备：用2 层纱布过滤摇瓶发酵液，4500 rpm 离心15 min，取上清液（粗酶液）测蛋白酶活力。
a．取5mL用pH 8.0硼酸缓冲液制备的0.6％酪蛋白溶液于试管中，40℃预热2min后加以pH8硼酸缓冲液稀释的酶液(即取l mL蛋白酶摇瓶发酵液，加19mL 缓冲液) l mL，40℃准确反应10min后，立即加5mL0.4mol／L三氯乙酸以终止反应，沉淀残余底物，40℃保温20min，使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm的光密度。
b．另以先加三氯乙酸使酶失活、后加酪蛋白的试管，按上述同样步骤测定光密度，作为空白对照。
3、酶活力定义：以lmin内由酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm的光密度与1μg 酪氨酸相当时，其所需要的酶量为1个单位。
酶活力(U／mL)＝O.D(酶)×n／10×O.D(酪)式中：10＝反应时间10min；O.D(酪)=lμg／mL的光密度；n=酶液稀释倍数。
五、思考题实验中的酶活力检测是否出现负结果?如有，请分析原因?。
