产蛋白酶菌株Bacillus subtilis GS-1发酵条件优化及蛋白酶水解应用初步研究

大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。

通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。

饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化周映华; 吴胜莲; 贺月林; 缪东【期刊名称】《《湖南农业科学》》【年(卷),期】2010(000)011【总页数】3页(P21-23)【关键词】枯草芽孢杆菌; 培养基; 发酵条件; 优化【作者】周映华; 吴胜莲; 贺月林; 缪东【作者单位】湖南省微生物研究所湖南长沙 410009【正文语种】中文【中图分类】S816.3枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）基我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来越多的研制成微生物制剂。

其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，具有广阔的发展前景，现已在畜牧业、饲料行业中广泛应用，显示出了巨大的社会效益和生态效益。

枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力，这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病，促进生长起到重要作用。

目前在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。

笔者对枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件进行了研究，以期提高枯草芽孢杆菌的产量并降低生产成本。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种供试菌种为枯草芽孢杆菌，由湖南省微生物研究所菌种保藏室提供。

1.1.2 培养基检测培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，葡萄糖1%，氯化钠0.5%，琼脂2%；种子培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0～7.2；基础发酵培养基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、大豆粕1%、淀粉0.3%、3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%。

pH均调为7.0～7.2。

1.1.3 仪器设备供试仪器：SHP-250生化培养箱、1600倍微生物显微镜、PHS—25型数显酸度计、福玛QYC—211摇床、电热鼓风干燥箱等。

一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。

采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。

通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。

在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。

关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。

胃蛋白酶生产工艺胃蛋白酶是一种重要的消化酶，能够在胃部分解蛋白质，帮助人体消化吸收。

胃蛋白酶的生产工艺主要包括菌种培养、发酵、提取和纯化等步骤。

以下是一个简要的胃蛋白酶生产工艺的介绍。

首先，选择合适的菌种进行培养。

常用的菌种是产胃蛋白酶的细菌，如枯草杆菌属的嗜热枯草杆菌（Bacillus thermoproteolyticus），也可以使用其他蛋白酶产生菌株。

菌种的选取要考虑其产量、生长速度和酶活性等因素。

然后，进行菌种的发酵过程。

将菌种接种到培养基中，控制好发酵条件，使菌株充分生长和繁殖。

发酵过程中要注意控制温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进胃蛋白酶的产生。

接着，进行胃蛋白酶的提取。

发酵液经过离心分离，得到含有胃蛋白酶的上清液。

胃蛋白酶的提取过程中可能需要进行蛋白酶的激活或去除杂质等步骤，以提高酶的纯度和活性。

最后，进行胃蛋白酶的纯化和精制。

采用适当的分离技术，如层析、电泳等方法，将胃蛋白酶从提取液中分离出来，并去除其他成分和杂质。

纯化过程中要控制好条件，确保胃蛋白酶的纯度和活性。

在胃蛋白酶生产工艺中，需要重点考虑的因素有以下几点：1.菌种的选取和培养条件：选择产胃蛋白酶能力强、生长快速的菌株，并控制好培养基成分和发酵条件，以提高胃蛋白酶的产量和活性。

2.发酵条件的控制：控制好温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进菌株的生长和胃蛋白酶的产生。

3.提取和纯化工艺的选择：根据实际情况选择合适的提取和纯化方法，以最大限度地提高胃蛋白酶的纯度和活性。

4.产品的质量控制：对生产的胃蛋白酶进行质量检测和控制，确保产品的活性和纯度达到要求。

综上所述，胃蛋白酶的生产工艺包括菌种培养、发酵、提取和纯化等过程。

通过合理选择菌种和优化发酵条件，以及采用适当的分离和纯化技术，可以获得高纯度、高活性的胃蛋白酶产品。

枯草芽孢杆菌液态发酵的研究李情敏;何名芳;张凤英;张超凤;陈卫平【摘要】该研究选取了一株从无花果中分离出的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为试验菌株,它可以产生抗逆性强的芽孢,非常适合应用于益生菌饲料加工生产.在单因素试验基础上,进行L9(33)正交试验,获得芽孢产量高、原料成本低廉的液态发酵培养基最佳配方为碎米水解液6％、酵母粉0.7％、KH2PO40.5％;对该菌的摇瓶发酵条件进行了初步研究,确定了液态发酵的最佳条件为pH值为5,温度37℃,接种量6％,转速200 r/mm,培养时间19h.在此最佳培养基配方及发酵条件下,发酵液OD600mm值可达7.38.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2016(035)002【总页数】5页(P43-47)【关键词】枯草芽孢杆菌;液态发酵;培养基配方;培养条件;优化【作者】李情敏;何名芳;张凤英;张超凤;陈卫平【作者单位】江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;赣州农业学校食品教研组,江西赣州341100;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045【正文语种】中文【中图分类】TQ920.6益生菌的生理功能有很多，最重要的是可以促进肠道有益微生物的繁殖，降低病原菌数量，提高机体免疫的功能［1］。

益生菌制剂以无毒、无残留、无副作用、不污染环境等优点，使其成为了有效的抗生素替代物，在防治动植物疾病，促进机体发育，延缓人类衰老等方面被人们广泛使用［2］，并成为生态循环农业中的一个重要纽带。

由于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可形成抗逆性极强的芽孢，在稳定性方面具有先天优势，且枯草芽孢杆菌是我国农业部和美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）允许作为饲料添加剂的菌种［3-4］，其可以产生抑菌活性物质［5-6］，也可以作为一种理想的抗生素替代物。

土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【摘要】从海南土壤中筛选得到一株高产蛋白酶的菌株,并对其进行菌种鉴定、产蛋白酶发酵条件优化及蛋白酶分子质量测定.经筛选,得到一株高产蛋白酶的菌株,编号为CAUH83,蛋白酶活力达到126 U/mL.通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,鉴定菌株CAUH83为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens).通过单因素试验优化,确定该菌株产蛋白酶的最优发酵条件:大豆粉3.0％、蔗糖3.0％、初始pH 6.0、培养温度30 ℃、培养时间48 h.在此优化发酵条件下,该菌株产蛋白酶酶活力达到1 932.3 U/mL,较优化前提高15.3倍.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酶谱分析表明该蛋白酶分子质量约51 kDa.%A strain with high yield protease was isolated from soil sample of Hainan. The identification, fermentation conditions optimization and molecular mass of the strain were determined. After screening, a strain CAUH83 with high yield protease was obtained and the enzyme activity was 126 U/ml. Through morphological observation, physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis, strain CAUH83 was identified asSerratia marcescens. The optimal fermentation conditions were optimized by single factor experiments as follows: soybean flour 3.0％, sucrose 3.0％, initial pH 6.0, culture temperature 30 ℃ and time 48 h. Under the optimal conditions, the highest protease activity of the strain was 1 932.3 U/ml, which increased 15.3 times higher than that of before optimization. The molecular mass of the protease was about 51 kDa by SDS-PAGE and protease zymogram analysis.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】6页(P66-71)【关键词】粘质沙雷氏菌;筛选鉴定;蛋白酶;发酵条件优化【作者】耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学工学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083【正文语种】中文【中图分类】TS201.3蛋白酶(protelytic enzymes,EC 3.4)是催化肽键水解的一类酶,在食品、饲料、医药、化工等行业有着广泛的应用［1］。

蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【摘要】以酪蛋白水解圈为筛选标记，在以酪蛋白为唯一氮源的平板上，从土壤中分离筛选到3株高产蛋白酶的菌株，经形态学鉴定和16S rRNA分析，将其分别鉴定为Bacillus sp．G1、Bacillus sp．G2、Stenotrophomonas sp．V1。

将这3株菌株的发酵液通过硫酸铵分级沉淀初步纯化后，其比酶活分别为22．21、19．10和16．03 U／mg。

菌株Bacillus sp．G1和Ba-cillus sp．G2所产蛋白酶的最适反应温度和最适反应pH值均为40℃和7．0；菌株Stenotrophomonas sp．V1所产蛋白酶的最适反应温度为70℃，最适酶反应pH值为7．5。

%Three bacteria strains producing protease were screened and isolated from soil by observation of clearing zones on casein agar plates, based on phenotypic and 16S rRNA gene phylogenetic analysis, G1, G2 and V1 were preliminary classed and named as Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1.Bacill us sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were all aerobic strains.The proteases from Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were purified by the methods of ammonium sulfate precipitation, the specific activities of three proteases were up to 22.21 U/mg, 19.10 U/mg and 16.03 U/mg, respectively.The enzymes from Bacillus sp.G1 and G2 were optimally active at 40℃and in 20 mmol/L phosphate buffered saline buffer( PBS, pH 7.0) , and the alkaline protease from Stenotrophomonas sp.V1 was optimally active at 70℃and in 20 mmol/L PBS buffer ( pH 7.5) .【期刊名称】《江西农业学报》【年(卷),期】2016(028)004【总页数】7页(P32-38)【关键词】蛋白酶;筛选;鉴定;酶学特性;Bacillus sp.G1;Bacillussp.G2;Stenotrophomonas sp.V1【作者】赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【作者单位】江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045【正文语种】中文【中图分类】TQ925.2蛋白酶(Protease, EC 3.4)属于水解酶类,是最重要的三大工业用酶之一,销售额约占全球酶制剂市场的60%[1],被广泛应用于食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业,在我国国民经济的发展中起着重要的作用[2]。

一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化一、引言枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的芽孢形成细菌，广泛存在于土壤、水体、植物表面等环境中。

枯草芽孢杆菌具有良好的免疫调节、抗菌、促生长等生物学特性，被广泛应用于农业、食品、医药等领域。

针对不同用途的需求，分离鉴定枯草芽孢杆菌并优化其发酵条件，能够提高其生物活性和产量，为其在实际应用中发挥更好的效果。

二、枯草芽孢杆菌的分离鉴定1.样品采集与处理首先，从自然环境、农田土壤或其他植物表面等样品中采集含有枯草芽孢杆菌的样品。

将样品带回实验室后，进行分离和处理，避免混杂其他细菌或真菌。

2.菌株分离将处理后的样品进行稀释，接种于富含培养基中，利用传统分离方法（如平板分离法、稀释平板法等）进行分离。

通过观察不同菌落形态和颜色，筛选出枯草芽孢杆菌单菌株。

3.生理生化鉴定对分离到的枯草芽孢杆菌进行生理生化鉴定，包括形态学观察、生长特性、氧化还原反应、产酶活性等。

利用生化试剂盒进行相关检测，确定菌株的生物学特性。

4.分子鉴定通过16SrRNA序列分析或蛋白质质谱鉴定等分子生物学方法，确认所分离到的枯草芽孢杆菌的属种分类，并与数据库中的已知菌株进行比对验证。

5.枯草芽孢杆菌存取将鉴定完成的枯草芽孢杆菌单菌株保存在甘油保存流质中，存放在-80°C低温冰箱中备用。

1.发酵基质的选择选择适宜的发酵基质对枯草芽孢杆菌的生长和代谢具有重要影响。

常用的基质包括葡萄糖、大豆粉、玉米粉等，可以根据具体需求进行配比调整。

2.发酵菌种培养条件通过扩种培养，将枯草芽孢杆菌预培养至指数生长期，然后接种至发酵罐中，保持较高的菌液浓度，有利于产酶和生长。

3.发酵条件的控制在发酵过程中，通过控制温度、pH值、通气速率、发酵时间等因素，调节菌体生长、产酶效率和产物生成速率。

通常，较适宜的发酵条件为温度37°C-42°C，pH值6.0-8.0，通气速率1.0-2.0L/min。

一、概述枯草芽孢杆菌蛋白酶（Bacillus subtilis protease）是一种具有优良性能的植物蛋白分解酶，其在农业领域有着广泛的应用前景。

通过利用枯草芽孢杆菌蛋白酶，可以将大豆、玉米等植物蛋白高效地转化为氨基酸，从而制备出复合氨基酸制剂。

本文旨在综述枯草芽孢杆菌蛋白酶制备复合氨基酸制剂的研究现状和进展。

二、枯草芽孢杆菌蛋白酶的特性枯草芽孢杆菌蛋白酶是一种内源性蛋白酶，属于金黄色葡萄球菌纤溶蛋白酶家族，具有较高的蛋白分解活性和稳定性。

该酶在中性至碱性条件下活性较高，耐高温，具有较强的耐蛋白酶抑制剂和抗胃蛋白酶降解的能力。

该酶对多种植物蛋白如大豆蛋白、玉米蛋白等均有较好的降解能力，能高效产生氨基酸。

三、枯草芽孢杆菌蛋白酶制备复合氨基酸制剂的工艺1. 原料选择：选用含丰富植物蛋白的大豆、玉米等作为原料。

2. 枯草芽孢杆菌蛋白酶制备：通过菌种培养、酶液提取、精制等工艺步骤制备出高纯度的枯草芽孢杆菌蛋白酶。

3. 酶解反应：将原料与枯草芽孢杆菌蛋白酶进行合理比例的混合，经过适当的酶解条件下进行反应，高效地将植物蛋白转化为氨基酸。

4. 氨基酸制剂提取和精制：通过离心、过滤、结晶等工艺步骤，提取出氨基酸制剂，并进行精制处理，确保产品质量。

四、枯草芽孢杆菌蛋白酶制备复合氨基酸制剂的优势1. 高效：枯草芽孢杆菌蛋白酶具有较高的蛋白分解活性，能够高效转化植物蛋白为氨基酸，提高氨基酸的产量。

2. 环保：该工艺过程无需添加化学溶剂或其他化学试剂，减少了对环境的污染。

3. 产品优质：通过枯草芽孢杆菌蛋白酶制备的氨基酸制剂具有良好的生物利用率，符合绿色食品添加剂的要求。

五、枯草芽孢杆菌蛋白酶制备复合氨基酸制剂的应用前景1. 农业领域：氨基酸是植物生长的必需营养物质，可作为植物生长调节剂、肥料添加剂等应用于农业生产中，能够增加植物的抗逆性和产量。

2. 饲料工业：氨基酸是饲料添加剂的重要成分，通过枯草芽孢杆菌蛋白酶制备的氨基酸制剂可应用于畜禽饲料中，提高饲料的蛋白质含量，促进动物生长。

γ-谷氨酰转肽酶高产菌株的筛选、鉴定及其产酶条件优化帅玉英;张涛;江波;沐万孟【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2010(036)003【摘要】从发酵食品虾酱中筛选到1株高产γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的菌株,根据其形态特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌,并命名为Bacillus subtilis SK11.004.摇瓶实验确定该菌株的优化发酵培养基及发酵条件为:蔗糖25 g/L,胰蛋白胨5 g/L,玉米浆15 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5g/L,K_2HPO_4·3H_2O 1 g/L,起始pH为7.2,250 mL三角瓶装液量30 mL,培养温度37℃,发酵培养时间16 h,此优化条件下,GGT酶活力可达4.07 U/mL.Bacillus subtilis SK11.004菌株生长周期短,产酶量高,应用前景良好.【总页数】5页(P20-24)【作者】帅玉英;张涛;江波;沐万孟【作者单位】江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏,无锡,214122【正文语种】中文【相关文献】1.角蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及其产酶条件优化 [J], 蒋智;陆兵;谌斌;卢勤2.半纤维素酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶条件的研究 [J], 张庆芳;马菁玲;孔秀琴;贾小宁;陈吉祥;赵霞3.一株琼胶酶高产菌株的筛选鉴定及产酶条件的优化 [J], 徐丽;刘江涛;蔡俊鹏4.海藻酸钠裂解酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶条件的优化 [J], 王巧贞;潘信利;杨玲;李菲;李喆;黄媛林;李翠梅;黄庶识5.果胶酶高产菌株EIM－6的筛选鉴定及其液体发酵产酶条件优化 [J], 杨欣伟;林伟铃;田宝玉;柯崇榕;黄薇;黄建忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究张秀江;孙小玉;谷立峰;胡虹;王秋菊;刘莹莹;杨灵杰【摘要】通过对菌株Bacillus subtilis YKM05发酵产酶条件的优化研究,使其产角蛋白酶活力显著提升.最适产酶诱导物为羽毛粉,最适碳源为玉米粉,最适氮源为豆粕粉,Ca2+、Fe3+对产酶有促进效果,Mn2+、Zn2+、Cu2+对产酶有抑制效果.最佳的培养基组成为:羽毛粉2.0％、玉米粉2.0％、豆粕粉2.0％、磷酸二氢钠0.3％、磷酸氢二钠0.5％、氯化钙0.6％.菌株优化产酶条件为:发酵温度36℃、培养基初始pH值为9、种子接种量为3％、1000 mL三角瓶最佳装液量为300 mL、发酵时间72 h.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2018(036)012【总页数】6页(P1935-1940)【关键词】角蛋白酶;菌株;发酵;产酶;酶活力【作者】张秀江;孙小玉;谷立峰;胡虹;王秋菊;刘莹莹;杨灵杰【作者单位】河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州 450008;郑州市现代农业科技服务中心,郑州 450000;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州 450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州 450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省瑞特利生物技术有限公司,郑州 450008【正文语种】中文【中图分类】Q939.9;TQ925+.2角蛋白（Keratin）是一种普遍存在于自然界中且有很强抗性的硬性蛋白，如动物毛发、蹄、角和羽毛等.随着我国畜牧业迅速发展，养殖业不断趋于规模化，羽毛作为家禽饲养和屠宰工业的副产物，产量越来越大，而羽毛中蛋白质和氨基酸含量丰富，是潜在的优良蛋白质资源.角蛋白由于胱氨酸残基所提供的分子间二硫键的高度交联、氢键作用以及分子间的相互疏水作用而使角蛋白化学结构稳定，难以被胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等水解［1］.角蛋白酶（Keratinase）是一种可特异催化降解角蛋白的酶，由微生物产生，在饲料、皮革、纺织、医药等领域具有十分重要的应用价值.以前对角蛋白酶的研究基本上是关于产角蛋白酶菌的分离、筛选以及角蛋白酶的分离纯化和理化性质的研究.近些年随着分子生物学的不断进步，国内外一些学者已经克隆出多个不同来源的角蛋白酶基因，并且进行角蛋白酶的基因工程方面研究，实现了这些基因的异源表达［2］.本研究对构建的产角蛋白酶枯草芽孢杆菌工程菌株摇瓶发酵培养的发酵技术参数和产酶条件进行优化，为角蛋白酶产品开发和推广应用提供依据.1 材料和方法1.1 试验材料1.1.1 菌株地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心.经物理和化学诱变获得产角蛋白酶的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisYD01），采用定点突变技术从地衣芽孢杆菌中提取其产角蛋白酶的基因并克隆到枯草芽孢杆菌表达载体进行产角蛋白酶的高效表达，依次通过平板筛选、摇瓶发酵和检测酶活，确认得到一株产角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis YKM05）工程菌株.1.1.2 培养基斜面（平板）培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，牛肉膏0.5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.5，用于菌株保存与活化. 发酵种子培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，牛肉膏0.5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.5，用于发酵种子的制备.基础发酵培养基：诱导物2.0%，碳源2.0%，氮源2.0%，磷酸二氢钠0.3%，磷酸氢二钠0.5%，氯化钙0.6%，pH 7.0～7.5.上述培养基均需在121℃、1×105Pa条件下高压蒸汽灭菌30 min.1.2 试验方法1.2.1 菌株YKM05的活化与发酵种子的培养用接种环刮取菌株YKM05斜面或平板培养的菌落转接至装有200 mL发酵种子培养基的500 mL三角瓶中，36℃、100 r/min摇床上培养48 h，备用.1.2.2 菌株YKM05产酶培养基的优化单因素筛选基础发酵培养基产酶诱导物、碳源、氮源、无机盐的种类，配制不同的发酵培养基，确定适合于菌株产角蛋白酶的诱导物、碳源、氮源、无机盐的种类.将配制好的发酵培养基装入1000 mL的三角瓶中，每瓶装量300 mL，121℃、1×105Pa条件下高压蒸汽灭菌30 min.按3%的接种量接入菌株YKM05液体发酵培养的种子，在36℃、100 r/min摇床上培养72 h，取发酵液2500 r/min离心20 min，测定上清液中角蛋白酶的酶活力.1.2.3 菌株YKM05产酶培养条件的优化以优化后的培养基进行菌株YKM05发酵培养试验，以单因素改变发酵过程中的发酵温度、pH值、接种量、装液量、发酵时间等因子，根据发酵过程中产角蛋白酶的活力确定菌株最适宜的发酵培养参数.1.2.4 角蛋白酶酶活力的测定以羽毛粉为发酵底物，发酵液经离心除菌，取其上清液1 mL，加2 mL TrisHClBuffer和10.0 mg羽毛粉（80目），置于40℃水浴保温振荡反应6 h，然后加入2 mL 10%TCA终止反应.30 min后，8000 r/min，4℃离心15 min，上清液于280 nm处测定OD值.以试验组与对照组在280 nm处测定的吸光度OD值表示，吸光度值每增加1所需要的酶量即为1个酶活单位［3］.2 结果与分析2.1 菌株YKM05发酵培养基的优化2.1.1 诱导物对菌株YKM05产酶的影响基础发酵培养基分别加入2%羽毛粉、2%羽毛、2%羊毛、2%角质层作为菌株产酶诱导物，以不加为空白对照，每组设4个重复，分别进行72 h液体发酵培养后，测定发酵液中角蛋白酶的活力.结果表明，发酵培养基中添加2%羽毛粉、2%羽毛、2%羊毛、2%角质层对菌株产酶都有一定的影响，发酵液酶活力不同表明诱导物对菌株产角蛋白酶的影响程度不同（图1）.不添加诱导物菌株产酶活力很低，说明菌株所产的角蛋白酶是一种诱导酶，羽毛粉是最佳诱导物.2.1.2 碳源种类对菌株YKM05产酶的影响基础发酵培养基分别加入2%葡萄糖、2%麦芽糖、2%蔗糖、2%低聚木糖、2%玉米淀粉、2%玉米粉等碳源，每组设4个重复，分别进行72 h液体发酵培养后，测定发酵液角蛋白酶酶活力，结果如图2所示.可以看出，不同种类的碳源对菌株产角蛋白酶有一定的影响.以葡萄糖为对照，麦芽糖、蔗糖、低聚木糖对菌株产酶有一定抑制作用，低聚木糖的菌株产酶只有葡萄糖的50%左右，低聚木糖虽是良好的益生元，但其碳源无法被菌株发酵过程中直接利用.玉米淀粉和玉米粉对菌株产酶有一定的促进作用，玉米粉的促进作用更明显，可能与玉米粉除提供碳源外，还可以提供菌株生长和代谢所需要的其他营养有关.2.1.3 氮源种类对菌株YKM05产酶的影响基础发酵培养基分别加入2%硫酸铵、2%硝酸铵、2%蛋白胨、2%牛肉膏、2%酵母浸粉、2%豆粕粉等氮源，每组设4个重复，72 h液体发酵培养后，测定发酵液角蛋白酶活力.由图3可以看出，与硫酸铵相比，硝酸铵、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、豆粕粉都对菌株产酶有促进作用，以蛋白胨、牛肉膏、豆粕粉作用更为明显，可能与蛋白胨、牛肉膏除提供氮源外，还能为菌株提供未知生长因子.豆粕粉除提供氮源外，还能为菌株生长提供脂肪、碳水化合物、维生素等营养物质有关.图1 不同诱导物对菌株产酶的影响Fig.1 The effect of different inducers on keratinase production图2 不同碳源对菌株产酶的影响Fig.2 The effect of different carbon sourceon keratinase production图3 不同氮源对菌株产酶的影响Fig.3 The effect of different nitrogen source on keratinase production2.1.4 金属离子对菌株YKM05产酶的影响基础发酵培养基分别添加1%的Ca2＋、Fe3＋、Mn2＋、Zn2＋、Cu2＋等不同种类的金属离子，以不加为空白对照，每种金属离子设3个重复，72 h液体发酵培养后，测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图4所示. 可以看出，Ca2＋、Fe3＋、Mn2＋、Zn2＋、Cu2＋等不同种类的金属离子对菌株产酶有明显的影响，Ca2＋、Fe3＋对菌株产酶有显著的促进效果，Mn2＋、Zn2＋、Cu2＋对菌株产酶则有明显的抑制作用.2.2 菌株YKM05发酵产酶培养条件的优化2.2.1 温度对菌株YKM05产酶的影响以优化后的发酵培养基分别在20、24、28、32、36、40、44℃发酵培养，每个温度设3个重复，72 h后测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图5所示.菌株在36℃发酵时产酶活力最高达到650 U/mL，随着温度的升高或降低，菌株产酶活力都随之降低，说明菌株发酵过程最适温度为36℃.2.2.2 pH值对菌株YKM05产酶的影响以优化后的发酵培养基分别设定初始pH值为6、7、8、9、10、11，每个pH值设3个重复，发酵培养72 h后测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图6所示.可以看出，当初始pH值为9时，菌株产酶活力最高达到646.6 U/mL，pH值高于或低于9，菌株产酶活力都下降，说明菌株发酵产酶最适的pH值为9.图4 金属离子对菌株产酶的影响Fig.4 The effect of different metal ions on keratinase production图5 温度对菌株产酶的影响Fig.5 The effect of temperature on keratinase production图6 pH值对菌株产酶的影响Fig.6 The effect of pH of medium on keratinase production2.2.3 接种量对菌株YKM05产酶的影响以优化后的发酵培养基分别按1%、2%、3%、4%、5%、6%接入液体发酵种子，每个接种量设3个重复，发酵培养72 h后测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图7所示.菌株发酵种子接种量为3%时，菌株发酵产酶最高，接种量较小时，菌株数量较小，不能快速大量繁殖，导致角蛋白酶分泌较少；当接种量超过一定范围后，必然造成培养基对菌株营养供应不足，影响菌株代谢，同样导致菌株角蛋白酶分泌减少，3%是菌株的最佳接种量.2.2.4 装液量对菌株YKM05产酶的影响 1000 mL三角瓶分别装量300、400、500、600、700、800 mL优化后的发酵培养基，每个装液量设3个重复，发酵培养72 h后测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图8所示.可以看出，装液量自300 mL起，随着装液量的增加，菌株的产酶活力逐渐下降，说明菌株为好氧菌，发酵过程中需要有充足的氧气供应.装液量低于300 mL未设试验处理，考虑到1000 mL三角瓶装液量过少可能会引起培养基水分过度蒸发而改变培养基各组分的浓度，导致试验结果误差，再者装液量过少发酵液体积过小造成发酵规模过小，实际生产应用意义不大.1000 mL三角瓶最佳装液量为300 mL.图7 接种量对菌株产酶的影响Fig.7 The effect of number of vaccinations on keratinase production表8 装液量对菌株产酶的影响Fig.8 The effect of liquid volume on keratinase production2.2.5 发酵时间对菌株YKM05产酶的影响以优化后的发酵培养基进行液体发酵培养96 h，设置3个平行的重复，自12 h开始，每12 h分别测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图9所示.发酵12 h时，角蛋白酶活力较低，随着发酵过程的进行，角蛋白酶活力稳步提高，72 h达到最大值670 U/mL，之后随着时间的延长，角蛋白酶活力呈逐渐下降的趋势.图9 发酵时间对菌株产酶的影响Fig.9 The effect of fermentation time on keratinase production3 讨论动物羽毛的利用，传统的办法有物理和化学的方法降解羽毛角蛋白，但存在着降解过程反应参数不易控制、高耗能、高污染、一些动物氨基酸损失或遭到破坏，以及生产的羽毛蛋白饲料动物消化吸收率低等问题［4-5］.采用角蛋白酶处理羽毛蛋白质，不仅能够克服上述弊端，还可将羽毛角蛋白降解为氨基酸、多肽、小肽等，便于动物消化吸收.降解羽毛角蛋白酶的微生物工程菌株目前研究最系统、最深入的当属地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis PWD-1），PWD-1能在以羽毛为唯一的有机底物的培养条件下生长，以羽毛作为碳源、氮源和能量的来源，能降解通过高温蒸煮的羽毛［6］.该菌所产角蛋白酶基因kerA也已得到克隆并在多种宿主中成功表达［7-8］.Shih将多拷贝的kerA基因整合到地衣芽孢杆菌B.licheniformis染色体上，得到了稳定表达角蛋白酶的转化子，并使角蛋白酶的产量提高了4～6倍［9］.梁斌等把编码地衣芽孢杆菌L-25的角蛋白酶基因kerB克隆到载体pUB18-P43质粒上，转入到B.subtilis菌株DB104中，得到成功表达的FD-8菌株，该菌株分泌角蛋白酶，可以在羽毛培养基上生长并完全水解羽毛［10］.陈坚等采用定点突变技术将地衣芽孢杆菌B.licheniformis BBE11-1的角蛋白酶基因（ker）进行定点突变并克隆连接到枯草芽孢杆菌表达载体，得到一株可以产较好热稳定性角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis，该菌株表达的角蛋白酶比野生型菌株提高了近9倍［11］.杨连等利用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens K11）从中克隆并获得羽毛降解基因kerK，成功在枯草芽孢杆菌SCK6中进行了表达，再将构建的组成型表达载体转化到原始K11菌株中，获得了重组K1127菌株，该菌株对羽毛的降解效率进一步提高［12］.角蛋白酶的发酵工艺、产酶条件优化方面，研究者主要集中在培养基组成和培养条件对酶活性的影响方面［13］.Ramnani等使用PB实验设计筛选了8个影响地衣芽孢杆菌RG1产角蛋白酶的因素，并通过中心组合实验得到了产酶的最佳培养基组成、培养时间和培养温度，结果该菌产酶活性提高了3.5倍［14］.Anbu对Scopulariopsis brevicaulis产角蛋白酶培养基及条件进行了优化，得到了适合产角蛋白酶的培养基组成、温度和pH等参数［15］.Wang等对地衣芽孢杆菌PWD-1和重组枯草芽孢杆菌FDB-29的最佳发酵过程进行了探讨，两者角蛋白酶均可由蛋白物质诱导，产酶最适温度均为37℃，最佳溶氧水平分别为10%和20%.在50℃培养PWD-1菌株8 h后，转移到37℃发酵培养可使酶产量提高10倍.在发酵条件分别优化后，PWD-1比FDB-29菌株的最终产酶水平高40%［16］.姚淑敏等筛选得到一株对羽毛有较强降解能力的菌株芽孢杆菌，最适的发酵条件为：温度42℃，pH为7.5，转速125 r/min，最高酶活力达25.20 U/mL，外加其他碳源或氮源对角蛋白酶的产生有一定的影响［17］.张玲等以羽毛粉为底物，采用链霉菌（Streptomyces sp.）B221液体发酵生产角蛋白酶，结果表明，该菌产角蛋白酶，在40℃、pH值为9.0、接种量为5%时酶活力最强［18］.董荣斌等研究以羽毛粉为底物，链霉菌（Streptomyces sp.）B221固体发酵条件，结果表明，该菌在培养基含水量为35 mL BM/10 g羽毛、40℃、pH值9.0、接种量为20%时发酵效果最好，最佳发酵周期为6 d［19］.李小会等对角蛋白高效降解菌地衣芽孢杆菌菌株1411-1固体发酵条件进行了优化，结果表明，最适固体发酵条件为：培养基含水量75%，pH值10.0，温度40℃，菌液接种量0.15 mL/g，发酵周期88 h，氮源对固体发酵有显著的抑制作用，碳源的影响不显著［20］.菌株Bacillus subtilis YKM05是本项目研究获得的产角蛋白酶的工程菌株，产角蛋白酶活力较高且酶活特性良好，通过对产酶条件的优化研究，旨在促使菌株发酵水平进一步提高，降低角蛋白酶生产和使用成本，为角蛋白类物质的开发利用提供新的科学方法.4 结论通过对菌株Bacillus subtilis YKM05发酵产酶条件的优化研究，使其产角蛋白酶活力显著提升.最适产酶诱导物为羽毛粉，最适碳源为玉米粉，最适氮源为豆粕粉，Ca2＋、Fe3＋对菌株产酶有促进效果，Mn2＋、Zn2＋、Cu2＋对菌株产酶有抑制作用.最佳的培养基组成为：羽毛粉2.0%、玉米粉2.0%、豆粕粉2.0%、磷酸二氢钠0.3%、磷酸氢二钠0.5%、氯化钙0.6%.菌株优化产酶条件为：发酵温度36℃、培养基初始pH值为9、种子接种量为3%、1000 mL三角瓶最佳装液量为300 mL、发酵时间72 h.【相关文献】［1］WILLIAMS C M，RICHTER C S，MZCKENZIE J M，et al.Identification and characterization of a 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一株Bacillus sublitis JH-1发酵产木聚糖酶培养基的响应面优化王春明;钟超;王凤学;黄凡;贾红华;韦萍;赵印【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】Xylanase producing strain Bacillus sublitis JH-1 was screened from straw compost by Congo red transparent circle method. According to the single-factor experiments, response surface methodology was applied to optimize the liquid state fermentation conditions of Bacillus sublitis JH-1 for xylanase production, with the optimal conditions being listed as follows:temperature as 33℃, pH value as 6.0, maltose as 2.6%(m/V), YE as 1.2%(m/V), KH2PO4 as 1.2%(m/V). Increased 1.8 times in average as compared with preliminary culture and consistent with the maxmum predicted value.%利用刚果红透明圈法从秸秆堆肥中筛选出一株产木聚糖酶菌株Bacillus sublitis JH-1，以单因素试验为基础，采用响应面试验设计对Bacillus sublitis JH-1液态发酵产木聚糖酶的培养基进行了优化，得到产木聚糖酶发酵最适条件为：培养温度33℃， pH值6.0，麦芽糖浓度为2.6%，酵母粉浓度为1.2%，KH2PO4浓度为1.2%，发酵产酶量比优化前提高了1.8倍。