海马细胞培养与鉴定

胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定【关键词】胎鼠海马神经元；体外原代培养；鉴定doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.568 文章编号：1004-7484（2013）-06-3323-02在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。

海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。

对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。

我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。

1 材料与方法1.1 实验动物来源清洁级孕17-19天sd大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：scxk（沪）2012-0002。

1.2 主要仪器与试剂 co2培养箱（thermo公司），倒置相差显微镜为（olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为zeiss lsm710，小鼠抗大鼠classⅲβ-tubulin单抗（beyotime公司），nse免疫组化染色试剂盒、dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），b27添加剂、neuralbasal、hoechst 33342sigma公司），dmem（高糖型）培养基、胎牛血清（gibco公司）。

1.3 培养方法与鉴定取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含dmem 的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm 大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%co2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%fbs的dmem液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。

实验记录一、实验名称：海马细胞培养二、实验目的：在细胞水平评估给药后是否能够提高突触可塑性三、实验时间：年月日四、实验地点：五、实验人：六、实验试剂：1.完全DMEM培养基：2.1×PBS：厂家：HyClone；3.0.25%胰酶消化液：4.硼酸盐缓冲液（poly-L-lysine)：5.Neurobasal全培+双抗：6.HBSS缓冲液：七、实验仪器：1.湘仪TD5A-WS台式低速离心机，转子号为853590，水平转子，容量为32×15 ml。

2.培养箱：Thermo SCIENTIFIC培养箱，HERACELL 150i CO2 Incubator。

3.倒置显微镜4.解剖镜八、实验过程：1.准备24孔板，每孔放入一个处理好的玻片，共24孔。

分别加poly-L-lysineBuffer 500μl/孔，放入37℃培养箱中包被2小时以上。

2.4小时后，准备3个10-cm无菌培养皿，分别加20ml的HBSS-buffer，放在冰袋上预冷。

3.用75% 乙醇喷洗剪刀一把、尖头镊子两把、称量勺一把、手术刀片一个；将新生E19小鼠的头和身体分离，把头放在其中一个预冷的平皿中。

4.取大脑：左手用一把尖头镊子压住小鼠头部的眼睛处，右手用手术刀片将头顶处划开，再用另一把尖头镊子扒开头部的皮和脑壳，（注意不要弄坏大脑）右手拿称量勺尾端轻轻插入需出的大脑的底部，轻挑出大脑，放入到另一个干净的平皿中。

5.用上述取大脑的方法将剩余的小鼠大脑取出。

6.取海马体：在解剖镜下，左手用尖头镊子压住小脑处，右手翻开大脑的半球，去除血网，分离血网下的海马体（带状深色，半透明，靠近大脑半球的边缘），将海马体移入最后一个干净的平皿中。

7.用上述取海马体的方法将剩余的海马体取出。

8.全部海马体取出出后，用1ml 枪把海马体轻吸到1个无菌的1.5 ml EP管中，等海马体沉淀后，吸出上清，用PBS清洗10次，1ml/次。

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究苗宗宁;吴卫江;钱寒光;赵基栋【摘要】研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法，为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。

取新生SD大鼠的海马区脑组织，采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞，在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养；Accutase酶消化后传代培养，取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化，神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。

分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞，在无血清培养液中形成大量的神经球，部分神经球出现融合及贴壁分化现象，细胞呈典型NSCs 形态。

经巢蛋白染色鉴定，大部分为阳性细胞。

神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后，可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。

从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力，在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。

%To establish the method of culture neural stem cells in the hippocampus of neonatal rats in vitro in order to find a suit-able cell source for the treatment of nervous system diseases.NSCs were isolated use accutase and mechanical separation method from hippocampus area of neonatal SD rat.The cells were cultured in completely medium and medium components include DMEM/F12 ser-um-free medium,B27,basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor.Anti nestin immunofluorescence staining were used to identify the third generation cell after accutase enzyme digestion andsubculture.Culture medium containing 10%fetal bovine serum were usedto induce NSCs,NF-200 and GFAP immunofluorescence staining were used to identify the differentiation of NSCs to neu-rons and glial cell.In the hippocampus of neonatal rats,a large number of nerve cells were formed in the serum free medium,and some of the neural spheres appeared fused and adherent differentiation.The cells showed typical NSCs morphology.The expressions of nestin staining showed that most cells were positive.Nerve cell spheres could differentiate into neurons and glial fibers acidic protein expression positive cells after cultured with medium containing fetal bovine serum.The NSCs isolated from the hippocampus of neonatal rats has the ability of self-renewal and proliferation,which has the potential to differentiate into neurons and glial cells in the serum containing fetal bovine serum.【期刊名称】《生物医学工程研究》【年(卷),期】2016(035)004【总页数】6页(P303-308)【关键词】海马;神经干细胞;分离培养;细胞分化;新生大鼠【作者】苗宗宁;吴卫江;钱寒光;赵基栋【作者单位】江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041;江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041;江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041;江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041【正文语种】中文【中图分类】R3181 引言神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一类起源于神经外胚层，具有自我更新能力并在一定条件下分化为神经元和胶质细胞的多潜能干细胞［1-3］。

海马细胞培养流程1．Coat板子：12孔板每孔加poly-sine缓冲液至少覆盖皿底，37℃coat至少4小时（可以过夜coat），吸去poly-sine缓冲液，PBS洗2-3遍（可以用PBS泡一段时间）。

使用前，在超净台里将PBS吸干，开盖晾干。

2．老鼠处死：19天SD孕鼠安乐处死。

3．胚胎分离：解剖老鼠腹部，取出胚胎，放到含有HBSS buffer的10cm培养皿中（冰块预冷）。

4．取头：用镊子弄断老鼠的头，将头放到含有HBSS buffer的6cm培养皿中（冰块预冷）。

5．取大脑：镊子捏住眼睛，剪刀剪开柔软的脑壳，另外一把镊子（有弯角）取出大脑，放入新的含有HBSS buffer的6cm培养皿中（冰块预冷）。

6．分离海马组织，将大脑半球翻过来，去除血网，用细镊子分离海马（带状深色，靠近大脑下半球边缘），剖离海马放入新的含有HBSS buffer的6cm培养皿中（冰块预冷）。

7．洗海马：用枪头吸取海马，放入灭菌的1.5ml EP管内（超净台内操作）吸去多余的HBSS，加入1ml PBS，待所有海马组织沉入管底后吸走PBS，再加入新的PBS，重复10次（注意不要吸走海马）。

8．消化：加0.5ml 0.25%trypsin，37℃消化30-50min。

9．吹散成单细胞：加2ml DMEM全培养基（500ml DMEM,5ml双抗，50ml FBS，5ml丙酮酸钠），吹吸悬浮细胞（不超过4次）。

10.细胞计数：从1ml中取20ul，加入20ul DMEM中，血球计数板上计数，计数后，稀释细胞，使得1ml DMEM全培养基中含有2x104个细胞，轻轻混匀。

11.Seed 12 孔板：每个孔加入1ml DMED全培养基细胞悬液（过夜培养，37℃，5%CO2）。

12.换选择培养基：培养12h后吸去DMEM，加入Neurobasal选择培养基。

Neurobasal配方：Neurobasal 50mlB-27 10mlGlutamaX 5ml双抗3ml。

海马神经元细胞免疫荧光检验神经元鉴定：一、烯醇化酶鉴定：培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。

二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示：培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。

一、烯醇化酶鉴定：培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS 漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。

seahorse实验原理Seahorse（海马仪器）是一种流式细胞代谢分析系统，用于评估细胞的呼吸和酸碱平衡。

它可以通过测量氧气消耗和酸碱转化的动力学来确定细胞的能量代谢状态和功能。

Seahorse仪器的工作原理包括以下几个步骤：细胞预处理、装载、测量和分析。

首先，细胞预处理。

细胞在培养基中孵育，通过调整培养条件来激活或抑制细胞代谢途径。

例如，将细胞孵育在低糖或高糖培养基中，以模拟缺氧或高糖环境。

在处理前，细胞需要进行准备，包括洗涤和预处理。

其次，装载。

经过预处理的细胞被装载到Seahorse培养底片的微孔中，通常每个孔有数千个细胞。

装载时要确保细胞均匀分布，以使测量结果准确。

接下来，测量。

Seahorse系统通过将循环的介质通过底片的微小泵浦系统，将细胞与测量区分离。

细胞所在的区域中有传感器，可以测量介质中的氧气和酸碱变化。

在测量期间，根据预设的实验方案，底板内的介质会逐渐变化。

例如，可以通过控制气体组成来调节氧气浓度，并在短时间内迅速改变实验环境。

最后，分析。

Seahorse系统通过测量介质中的氧气和酸碱变化来计算各种细胞代谢参数。

氧气消耗速率（OCR）是一个关键指标，它反映了细胞的呼吸活性。

酸化速率（ECAR）是另一个关键指标，它反映了细胞的酸碱代谢状态。

通过分析OCR和ECAR之间的关系，可以评估细胞的能量代谢状态和功能。

需要注意的是，Seahorse系统只能提供相关的代谢数据，对于潜在的生物学机制的解释需要进一步的研究和分析。

总结起来，Seahorse（海马仪器）通过测量细胞的呼吸和酸碱平衡来评估细胞的能量代谢状态和功能。

它的工作原理包括细胞预处理、装载、测量和分析。

通过分析氧气消耗速率（OCR）和酸化速率（ECAR）之间的关系，可以评估细胞的能量代谢状态和功能。

Seahorse系统为细胞研究提供了一个有力的工具，可以深入了解细胞代谢的机制。

1.成年大鼠海马神经元的培养●步骤1.获得海马细胞◆大鼠乙醚麻醉，断头处理；◆迅速解剖海马组织，置于含有2ml 4℃的HibernateA/B27的35mm的培养皿中；◆随后将其移入含有同上培养基的培养皿，去除脑膜及多余的脑白质（？）；◆将海马移入组织切碎机冷处理台面上事先用HibernateA/B27润湿的滤纸上，沿海马长轴将组织切成0.5mm的薄片，随后将其移入含有5ml4℃的HibernateA/B27的离心管中；◆30℃震荡8min。

◆大吸管将其移入含有木瓜蛋白酶（预热至30℃）的离心管，置于170rpm的旋转平台（保持组织片悬浮状态），30℃水域温育30min；◆将海马组织切片移入15ml含有2mlHibernateA/B27的离心管中，30℃温育5min，吸管吹打10次（30s），静置2min，将上清移入另一离心管，重复上述步骤2次；2.梯度分离◆将细胞悬液加入Nycoprep gradient（4ml）的上方，室温，1900rpm，离心15min；去除最上方的碎片；吸管收集含有细胞的部分；用5mlHibernateA稀释；第三层富含神经元；将第四层用2 ml B27:NeurobasalA重悬，1100rpm离心1min；3.盖玻片处理：50ug/mL多聚-D-赖氨酸（无菌水溶解）包被过夜，吸去多余的多聚赖氨酸，无菌水漂洗一次，自然干燥1h；4.◆细胞接种：以目标密度稀释于B27:NeurobasalA，以每盖玻片60到120 Ul 接种，置于5% CO2:9% O2中孵育1h；◆将盖玻片移入24孔培养板中,每孔以0.4ml 37℃B27/NeurobasalA漂洗一次，去除未贴壁细胞及细胞碎片；改用0.4ml的生长培养基；◆培养后4天，每3-4天更换一半培养基；新的培养基中的FGF2含量是远培养基的2倍；1.培养器皿的准备：1）溶液瓶——装配各种溶液——输液瓶；2）螺口瓶——血清或培养基；3）培养瓶——细胞培养——一般采用带螺口的，清洗时注意防止盖子中垫片的丢失；4）培养皿——细胞组织的分离、培养、染色——包括直径为30mm、60mm、120mm5）血球细胞计数板——细胞计数6）移液管——连接上手动（吸耳球）或电动负压吸取装置——在移液管尾部塞入少量脱脂棉；7）离心管——分离、漂洗、收集细胞——一般选用螺口带盖的；Eppendorf ——塑料尖底带盖的离心管8）磁力搅拌器：用于神经细胞的分离机溶液的配置；最好配合使用可调温度的加热装置；可用高压蒸汽消毒。

ICC-免疫细胞化学染色
原代培养海马细胞神经元的鉴定
将大鼠海马神经元细胞终浓度（2*106个/ml）接种于铺有盖玻片并经多聚赖氨酸包被好的6孔板中，每孔2.5ml，培养条件同上，培养至第8天，用免疫组化法鉴定。

步骤如下：
1.吸弃培养液用PBS冲洗3遍，冷丙酮固定10min。

2.PBS冲洗3遍，3%H2O2（30%双氧水和纯甲醇按1:9的容积比混合）封闭内源性过氧化物酶，室温下10min。

3.PBS冲洗3遍，0.3%Triton破膜（溶解细胞膜，细胞核膜细胞器膜上的脂质）15min，PBS洗3遍。

4.10%羊血清封闭，室温10min，吸弃上清（不洗）。

一抗37℃反应1h（20μL的NSE+1ml稀释液），设空白对照，以PBS代替一抗
5.PBS洗3*5min，二抗（羊抗兔）室温下18min，PBS洗3*5min，SABC复合物37℃，18min。

（二抗标记的FITC在紫外光激发下显色）
6.PBS洗3*5min，DBA显色（5min）。

镜下观察，自来水终止。

DBA稀释度（1:50），苏木素复染（3min），95%乙醇脱水，二甲苯透明20min，中性树胶封固，风干，镜下观察。

注：PBS用0.01M的（配置成0.1M的，用时稀释）。

原代海马神经元细胞培养-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。

(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO412H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。

用0.2m滤膜过滤，4℃保存。

(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。

使用时，用解剖液稀释至0.25%。

(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。

将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。

(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP047H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。

(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。

(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。

(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg ml-1的母液储存。

用0.2m 滤膜过滤，-20℃储存。

使用时，取6l母液加入2ml培养液中，终浓度为3g ml-1。

（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。

(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。

在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。