流式细胞术基本原理PPT课件

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流式细胞术.ppt

信号检测与分析
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。以激发图
散射光信号
散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。
①T淋巴细胞及亚群：外周血中成熟淋巴细胞主要属于
TCRαβ＋T细胞，可分为Th、Ts、Treg， TCRγδT细胞和NK1.1＋T细胞等，他们都有一个共同的标志CD3。
a、辅助/诱导性T淋巴细胞（Th）占27-51%，是主要的功能亚群，主要表达CD3＋CD4＋CD8 －。
b、抑制/细胞毒性T淋巴细胞（Ts）占15-44%，是主要的效应性 T 细胞亚群，主要表达 CD3＋ CD4 －CD8＋。
因此通过流式细胞仪计数和多参数分析淋巴细胞亚群对了解淋巴细胞发育、分化、活化和功能成熟，鉴别新的淋巴细胞亚群具有重要价值；更重要的是通过研究和分析疾病与特异性淋巴细胞亚群或某些疾病，如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植检测有着重要临床意义。
（1）淋巴细胞及其亚群分析
（三）质料采集和分析过程中的质量控制
1、标本采集处理
a、组织标本采集： b、标本固定：70%的乙醇固定效果好。 C、单细胞悬液的制备：细胞浓度调整为1×106/ml。 d、石蜡包埋组织的单细胞制备：一般不用。
2、资料采集：一般每个标本应获取1×104。 2×104个有核细胞的荧光和散光系数，白血病微小残余病变检测应收集5×104个细胞。 3、资料分析；略
缺点；细胞散射光特征丢失较肝素标本快。
（一） FCM单细胞标本的制备

《流式细胞术贝克曼》课件

贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究中广泛应用，可以用于检测免疫细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液学研究，检测血细胞的表面标志物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤研究，检测肿瘤细胞的表面标志物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的特点，能够在短时间内处理大量细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电检测技术，能够检测到微弱的荧光信号，具有高灵敏度，能够检测到低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多个参数，包括细胞大小、颗粒性、荧光信号等，从而对细胞进行多维度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代

《流式细胞术的原理》PPT课件

光学系统
电子系统
流式细胞仪的工作原理
散射光信号
前向角散射光〔FSC，Forward Scatter〕：细胞相对大小及其外表积侧向角散射光〔SSC，Side Scatter〕：细胞颗粒度及细胞核相对复杂性
散射光信号
荧光信号
特异荧光信号
背景信号
荧光素
•什么是荧光及荧光素？ •某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧光的物质称为荧光素。 •什么是荧光发生机理？ •室温下的荧光素分子大局部处于稳定的“基态〞。当荧光素在激发光的照射下吸收足够的光能后，跃迁到新的状态，即“激发态〞。处于激发态的荧光分子极不稳定，它可以通过极短时间
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用：防止堵塞喷孔约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
荧光染料的选择
1，首先，了解目标抗原 1〕细胞外表抗原 2〕细胞内或是核内抗原〔固定、透膜步骤〕 3〕以上两者兼备。先标记外表抗原，固定后，破膜标记胞内抗原。 4〕细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂，如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。〔活化、固定、透膜〕
《流式细胞术的原理》 PPT课件
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流式细胞术实验技巧及数据分析ppt课件

FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
17
流式细胞术操作流程：
培养细胞新鲜组织石蜡包埋
单细胞悬液制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定细胞分选
统计学分析
FISH PCR
继续培养
18
单分散细胞
19
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
20
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
21
细胞散色光信号
22
排除双联体细胞
27
细胞阻滞在G2M期
28
双克隆细胞周期分析
29
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流的形成要满足雷诺数

流式细胞术原理及应用通用课件

抗菌药物敏感性测试
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用药提供科学依据。
05 流式细胞术的数据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03

04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究，情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接，直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移（FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。

流式细胞术原理及应用新课件PPT全

流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医学基础研究与临床检测，在分子生物学、免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。

流式细胞术精品PPT课件

4
四、流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，并通过专用的DNA分析软件，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、流式细胞术的概念流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可

流式细胞术原理及临床应用-PPT文档

FCM检测白血病微小残留病变(MRD):
MRD 是白血病复发的主要根源， FCM 的高特异性和敏感性可以在患者缓解期检测是否有残留病变细胞，早期探测MRD，以免复发
FCM在临床肿瘤学中的应用
1.血液标本的检查 ● 肿瘤患者的免疫功能检查 ● 肿瘤患者的粘附分子检查：在肿瘤的浸润与转
细胞凋亡的生物学意义
胚胎形成、肌体正常发育、衰老和损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡有关。
生物医学的研究热点
FCM在血栓性疾与止血中应用
由于活化血小板是血栓的主要
成分之一，血小板活化程度的增高与疾病的发生发展有关。利用流式细胞仪可检测血小板活化指标，了解血小板状态和活化进程。巨血小板血小板无力症网织血小板
肿瘤细胞耐药性
MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P-gp）亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对化疗药物开始出现耐
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的炎症反应
可用流式细胞仪分析的标本
外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、各种体液（尿、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等）
单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞粒子、可溶性分子
流式细胞仪的基本功能
•细胞表型分析：包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析 •DNA含量及细胞周期分析、细胞凋亡检测 •目标细胞分选 •自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测 •流式蛋白定量技术：血浆中各种细胞因子的含量

流式细胞术基本原理(完整)PPT参考幻灯片

流式细胞术的基本原理
1
流式细胞术（flow cytometer，FCM）：
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
2
流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体的先进科学技术设备
34Leabharlann 流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统 2）光源与光学系统 3）信号收集、转换与分析系统 4）细胞分选系统
5
1）流动室与液流系统
6
2）光源与光学系统
激光（单色性、单向性）前向散射（FSC）
侧向散射（SSC）
7
激发波长发射波长
8
3）信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号，电信号输入到放大器放大。
11
流式细胞术的对照设置
阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域值
阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性
空白对照：不标记，自发荧光 PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱
重叠进行的的补偿调节
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4）细胞分选系统
• 根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然后由充电电路对其充电，带电液滴通过静电场发生偏转而分离
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+

流式细胞术原理及应用 ppt课件

• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧光。
ppt课件
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常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623）可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞单核细胞淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统高压偏转板收集装置(流式管、离心管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体

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流式分选仪研制开发；计算机四参数软件；样品制备、医学生物学
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流式细胞仪的分类
• 分析型流式细胞仪
– 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。
• 分选型流式细胞仪
– 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； – 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流
式细胞仪一般只用于分选。
9
BD公司分析型流式细胞仪
3
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
• 光学系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
• 细胞分选系统
– 喷嘴 – 电偏转板 – 样本收集器
13
1.2.1 液流系统
鞘液
鞘液
• 鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。
流式细胞术
---原理、操作及应用
.
1
教学参考书
• 实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2004.4 • 临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。
2005.8 • 流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出
版社。2008.2 • 实用流式细胞术-血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学
– 激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。 – 现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为488nm、
633nm和355nm、405nmUV；
18
（二）光束成行系统
19
细胞流动方向
FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。
4
流式细胞术的特点
• 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； • 检测参数：多参数； • 检测特点：单细胞水平分析； • 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； • 检测结果：精度高、准确性好； • 可对目标细胞进行分选；
5
• 流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准； • WB ：群体分析，得到多个细胞的平均值。
• 流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。
细胞流
激光照射点流体动力学聚焦示意图
14
（一）流动室和液流驱动系统
• 流动室(flow cell, flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。
11
Beckman Coulter流式细胞仪
Epics XL 单激光四色，市场 FC 500 单激光或双激光五色， Gallios 三激光十色，分
覆盖率高，分析型
市场覆盖率高，分析型
析型
CyAn三激光九色，分析型
MoFlo XDP 高端分选型
12
1.2 流式细胞仪的结构组成
• 液流系统
– 流动室 – 液流驱动系统
式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
7
1979年国家科委重点项目：研制国内第一台激光流式细胞仪
1982年国内第一台三参数激光流式细胞 1984年国家科委组织科研成果的鉴定验 1985年获国家卫生部科技成果乙等奖； 1985年--1990年灵敏度、信噪比、更多
20
（三）光收集系统
• 滤光片的组成
– 长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过； – 短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过； – 带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。
出版社。2010.9 • 流式细胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2010.10
2
主要内容
• 一、流式细胞仪结构和原理
– 流式细胞术简介 – 流式细胞仪的结构组成 – 流式细胞仪的光信号检测 – 流式细胞术数据的存贮、显示与分析 – 流式分选
• 二、流式细胞术操作与技巧 • 三、流式细胞术在生物医学中的应用
பைடு நூலகம்17
1.2.2 光学系统
（一）激发光源：激光器
• 气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
• 染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激光器，发出550-650nm可变波长激发光；
• 半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。BD的FACS Calibur 已采用635nm半导体激光器。
6
流式细胞仪的发展及商品化
• 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； • 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； • 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； • 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； • 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； • 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； • 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； • 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流
FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配
FACS Canto II 双激光六色，三激光八色
FACS Verse双激光六色，三
激光八色
10
BD公司分选型流式细胞仪
FACSVantage SE FACSAria III
Influx
进样孔
鞘液Sheath
荧光信号激光束
流动室结构图：单细胞发生器
15
液流驱动系统
16
（二）进样速率控制
10 psi
10 psi
10.2 psi
10.8 psi
• 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。
• 高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。