流式细胞术简介课件

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流式细胞术.ppt

信号检测与分析
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。以激发图
散射光信号
散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。
①T淋巴细胞及亚群：外周血中成熟淋巴细胞主要属于
TCRαβ＋T细胞，可分为Th、Ts、Treg， TCRγδT细胞和NK1.1＋T细胞等，他们都有一个共同的标志CD3。
a、辅助/诱导性T淋巴细胞（Th）占27-51%，是主要的功能亚群，主要表达CD3＋CD4＋CD8 －。
b、抑制/细胞毒性T淋巴细胞（Ts）占15-44%，是主要的效应性 T 细胞亚群，主要表达 CD3＋ CD4 －CD8＋。
因此通过流式细胞仪计数和多参数分析淋巴细胞亚群对了解淋巴细胞发育、分化、活化和功能成熟，鉴别新的淋巴细胞亚群具有重要价值；更重要的是通过研究和分析疾病与特异性淋巴细胞亚群或某些疾病，如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植检测有着重要临床意义。
（1）淋巴细胞及其亚群分析
（三）质料采集和分析过程中的质量控制
1、标本采集处理
a、组织标本采集： b、标本固定：70%的乙醇固定效果好。 C、单细胞悬液的制备：细胞浓度调整为1×106/ml。 d、石蜡包埋组织的单细胞制备：一般不用。
2、资料采集：一般每个标本应获取1×104。 2×104个有核细胞的荧光和散光系数，白血病微小残余病变检测应收集5×104个细胞。 3、资料分析；略
缺点；细胞散射光特征丢失较肝素标本快。
（一） FCM单细胞标本的制备

《流式细胞术贝克曼》课件

贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究中广泛应用，可以用于检测免疫细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液学研究，检测血细胞的表面标志物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤研究，检测肿瘤细胞的表面标志物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的特点，能够在短时间内处理大量细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电检测技术，能够检测到微弱的荧光信号，具有高灵敏度，能够检测到低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多个参数，包括细胞大小、颗粒性、荧光信号等，从而对细胞进行多维度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代

流式细胞术简介及应用进展课件

流式细胞术简介及应用进展
15
▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
11
BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
12
BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
13
BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
14
三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
17
2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。

流式细胞术免疫标记简介完整ppt课件

免疫标记技术
免疫标记技术（immunolabelling technique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。
流式细胞术检测蛋白质分子：免疫荧光标记技术
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程” 。
FACSCalibur流式细胞仪能够检测的荧光（Fluorescence）信号
FL1 （第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素） FL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白） FL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等 PL4 （第四荧光） -APC（藻青蛋白）
双色直接染色
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程” 。
正常外周血中通常存在的T细胞亚群
CD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti），
占T细胞总数的60%~70%；
CD3+、CD4-、CD8+：T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc），
20%~30%； CD3+ CD4+ CD8+ ： 1%~3%； CD3+ CD4- CD8-：1%~10%。
CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+ （即CD4、CD8双阳性）

流式细胞术原理及应用通用课件

抗菌药物敏感性测试
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用药提供科学依据。
05 流式细胞术的数据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03

04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究，情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接，直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移（FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。

流式细胞术(免疫学检验课件)

Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群，是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞，主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性，在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围，有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底，获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数
对复杂的细胞亚群观察更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以获得所需的信息。
SSC信号的强弱与细胞内颗粒结构的质量成正比，用于检测细胞内部结构属性
前向散射光示意图细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生。

流式细胞术PPT课件

电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
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B 根据抗原表达强弱合理选择抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)

流式细胞术精品PPT课件

4
四、流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，并通过专用的DNA分析软件，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、流式细胞术的概念流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可

流式细胞术课件

抗体使用原则
Ø 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体
Ø 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC
Ø 使用双标以上抗体必做荧光补偿
几种常见的荧光染料
细胞悬液
激光
FITC 异硫氰酸荧光素
Texas red 得州红
PE.PC.APC 藻胆蛋白类 PEcy5 能量传递复合染料
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。（n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞（G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
线粒体功能的变化
TMP会在凋亡中产生，可以通过一些标记用流式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离子荧光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos 等，可作为流式检测的探针。
当细胞发生凋亡时，一个线粒体膜表面蛋白— —7A6抗原会出现
Bcl-2/bax family of proteins.
酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
光强
Ø便于数据统计
度
Ø不同的细胞群可
以用不同的色标
记
Ø主要表达方式
绿色荧光强度

流式细胞术的原理及应用ppt课件

➢可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细细胞表面面积
胞结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反应细胞的相对大小和截面积的大小
SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化
1.液流系统：细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞悬液。
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确
2.光学系统：激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器

流式细胞术ppt课件

可区分高FL细胞与低FL细胞。一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题细胞密度低非特异荧光
强
碎片多细胞聚集
荧光弱
原因细胞损失抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策增加离心时间、弃上清选择纯度高的抗体、用同型对照抗体或双标记排除非特

流式细胞术及其临床应用课件(1)

光源与光学系统
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源滤光片
流动室、鞘液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用）配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
10
2 700
3 720
4
15
……
Counts
0…………101…………102…………103

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PPT学习交流
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PPT学习交流
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流式细胞仪可检测到的细胞参数 • 荧光信号
PPT学习交流
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R1
File: 4
Acquisiti on Date: 06-Mar-03
Quad UL UR LL LR
Events % Gated
254
2.40
1067 10.08
5291 49.98
3975 37.55
X Mean 37.47
密度图
二维等高图ຫໍສະໝຸດ 直方图图报告中常见的几种流式细胞图
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仪器设置调节
1. 用未染色细胞 2. 调整仪器PMT电压
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开机需准备试剂
• 建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品
（1）Negative Control（不加任何抗体）。（2）CD3-FITC（FL1 单染）（3）CD19-PE（FL2 单染）（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。
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数据分析
• 设门 • 设定阴性与阳性群体的界限 • 确定阳性与阴性细胞群体 • 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平
均荧光值，绝对数或抗体结合数
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2. 用单染色的细胞调节仪器补偿
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关于同型对照
• 例：一个双色染色的实验抗体A FITC，抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE
那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE 单阳性对照：
FITC: 细胞加上Ab A FITC, IgG1 PE PE: 细胞加上Ab B PE, IgG1 FITC
• 病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本 • 针吸组织：新鲜样本
• 鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质（.22滤膜）
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植物样本的制作
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步骤一：选择合适的荧光染料
• 必须被流式细胞仪上所配备激光器所激发 • 激发光谱在仪器上滤光片能够接受范围内 • 荧光素光谱的重叠应当尽量减少
Ab B
Ab A
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样本处理
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细胞悬液的制备
• 细胞悬液：
• 分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差
• 直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小
• 灌洗液、体腔积液 • 培养细胞、细胞系
• 实体组织：
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Optics
488 nm 635 nm
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步骤二：染色
• 体积 • 温度 • 孵育时间 • 对照
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步骤三：数据收集和分析
• 画图
• 寻找目标细胞
• 调整仪器设置到合适的状态
• 我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？
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散点图
= 侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的
相对复杂性
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血液涂片
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外周全血细胞散射光双参数点图
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Review Question
Dead cells are known to be smaller and to exhibit more internal complexity than live cells. Which of the populations on this plot would you expect to be dead?
816.86 19.57
418.80
Y Mean 461.36 468.89
4.41 9.87
图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死
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Two-Color Cell Analysis
Which of the three populations has the most Ab A binding sites?
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量
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BD FACSCalibur
PPT学习交流
7
PPT学习交流
8
流式细胞仪可检测到的细胞参数
• 非荧光信号
颗粒度
细胞大小
= 前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积
流式细胞术原理/用途/制样要求
张波（药理室）
PPT学习交流
1
流式细胞仪是什么仪器，什么时候会用到？
PPT学习交流
2
2009年 1月20日
1月23日
2月2日
PPT学习交流
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PPT学习交流
4
PPT学习交流
5
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选